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針對(duì)上述問題，湖南大學(xué)史俊峰/澳門大學(xué)宋賀團(tuán)隊(duì)合作發(fā)現(xiàn)姜皂苷R1（ZR1）可自發(fā)組裝形成分子水凝膠。冷凍電鏡結(jié)果顯示，該水凝膠由ZR1單體通過氫鍵驅(qū)動(dòng)形成納米原纖維結(jié)構(gòu)，具備疏水性核心和親水性表面。相比游離態(tài)ZR1，水凝膠形式顯著增強(qiáng)其對(duì)白色念珠菌的抑制能力，表現(xiàn)為破壞菌體膜結(jié)構(gòu)并導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)容物泄漏。ZR1水凝膠可負(fù)載乳酸桿菌，在體外共培養(yǎng)體系中表現(xiàn)出對(duì)白色念珠菌的協(xié)同抑制作用。結(jié)構(gòu)分析顯示，ZR1水凝膠可通過分子間作用與念珠菌細(xì)胞壁葡聚糖結(jié)合，實(shí)現(xiàn)靶向識(shí)別。在小鼠VVC模型中，ZR1-乳酸桿菌復(fù)合水凝膠處理組菌落數(shù)顯著降低，陰道組織炎癥程度減輕，菌群結(jié)構(gòu)恢復(fù)趨于正常，表明該材料具備聯(lián)合抗真菌與調(diào)節(jié)陰道菌群的治療潛力。ZR1分子結(jié)構(gòu)中穩(wěn)定的氫鍵網(wǎng)絡(luò)為水凝膠構(gòu)建提供組裝基礎(chǔ)，水凝膠平臺(tái)兼具抗真菌活性與益生菌遞送能力，為VVC治療提供新型干預(yù)策略，并為其他難溶天然產(chǎn)物的水凝膠化設(shè)計(jì)提供示范。該文章于2025年5月6日以《Atomic Insights lnto Self-Assembly ofZingibroside Rl andits Therapeutic Action Against Fungal Diseases》為題發(fā)表于《Advanced Materials》上（https://doi.org/10.1002/adma.202503283）。

（1）ZR1凝膠的制備與表征

ZR1在PBS中可通過加熱-冷卻法自組裝形成透明自支撐水凝膠，最低凝膠化濃度為2.0 wt%（圖1a）。負(fù)染TEM顯示水凝膠由寬度約5 nm的均一納米原纖維構(gòu)成，SEM觀察到內(nèi)部為多孔結(jié)構(gòu)（圖1b）。XRD分析顯示水凝膠具有明顯衍射峰，表明分子排列有序，而ZR1粉末中未見該結(jié)構(gòu)（圖1c）。FT-IR光譜顯示羧基O─H伸縮振動(dòng)增強(qiáng)，C═O不對(duì)稱與對(duì)稱伸縮振動(dòng)紅移，提示氫鍵參與自組裝過程（圖1d）。ZR1水凝膠的zeta電位為 -38.3 ± 0.47 mV，顯示其穩(wěn)定性優(yōu)于游離態(tài)ZR1（圖1e）。流變學(xué)分析表明其具備典型的剪切稀化行為和良好的儲(chǔ)能模量恢復(fù)能力，表現(xiàn)出優(yōu)異的粘彈性能和自愈合特征（圖1f）。上述結(jié)果表明ZR1可自組裝形成結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、力學(xué)性能良好、具有良好生物相容性和附著性的水凝膠，具備進(jìn)一步生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用潛力。

圖1. ZR1凝膠的形貌與凝膠性能表征。（a）加熱-冷卻法制備ZR1水凝膠的示意圖；（b）ZR1凝膠的SEM圖像（左）和TEM圖像（右）；（c）ZR1凝膠的XRD圖譜；（d）ZR1凝膠的FTIR光譜；（e）ZR1凝膠的Zeta電位測(cè)定結(jié)果；（f）ZR1凝膠在0.2%至500%應(yīng)變循環(huán)下的儲(chǔ)能模量（G′）恢復(fù)性能，頻率為1 Hz，凝膠濃度為2.0 wt.%

（2）ZR1納米纖維的低溫電子顯微鏡結(jié)構(gòu)

低溫電子顯微鏡（cryo-EM）結(jié)果顯示，ZR1分子可自組裝形成直徑約50 ?的管狀納米原纖維（圖2a）。2D分類顯示纖維片段具有約40 ?的周期性高分辨特征，寬度約為45.8 ?，提示其具備有序螺旋排列（圖2b）。功率譜分析觀察到延伸至4.3 ?分辨率的弱層線，第一層線與赤道間距對(duì)應(yīng)的螺旋重復(fù)單元為38.6 ?（圖2c），與2D圖像中重復(fù)結(jié)構(gòu)一致。根據(jù)功率譜索引結(jié)果構(gòu)建三維密度圖，初步解析ZR1納米纖維的螺旋結(jié)構(gòu)。因小分子缺乏典型二級(jí)結(jié)構(gòu)，手性識(shí)別困難。通過分別在左手與右手螺旋模型中進(jìn)行原子構(gòu)建與實(shí)空間擬合，僅左手螺旋模型可容納ZR1手性結(jié)構(gòu)，確認(rèn)其為左手螺旋。進(jìn)一步基于最佳擬合模型重構(gòu)獲得分辨率為2.5 ?的三維密度圖，其螺旋上升步長(zhǎng)為1.7 ?，扭轉(zhuǎn)角為?93.4°，形成螺距為154.4 ?的四股螺旋結(jié)構(gòu)，投影重復(fù)單元為38.6 ?（圖2d,e）。該結(jié)構(gòu)清晰顯示出三萜核心與雙糖側(cè)鏈的電子密度，可構(gòu)建可靠原子模型（圖2f）。每個(gè)不對(duì)稱單元包含兩個(gè)ZR1分子，四個(gè)不對(duì)稱單元環(huán)繞納米纖維周向形成完整螺旋周期（圖2g）。

圖2. ZR1納米纖維的高分辨率冷凍電鏡結(jié)構(gòu)表征。（a）ZR1納米纖維的代表性cryo-EM圖像，箭頭指示其形貌；（b）2D分類圖像顯示具有約45.8 ?寬度的螺旋組裝結(jié)構(gòu)；（c）功率譜圖及對(duì)應(yīng)的貝塞爾函數(shù)階數(shù)標(biāo)注，用于計(jì)算螺旋扭轉(zhuǎn)與上升步長(zhǎng)；（d，e）從側(cè)視圖與頂視圖觀察的ZR1納米纖維密度圖，標(biāo)注纖維寬度與重復(fù)節(jié)距；（f）擬合左手螺旋結(jié)構(gòu)的ZR1原子模型（頂視圖）；（g）不對(duì)稱單元內(nèi)的ZR1分子結(jié)構(gòu)，包括兩個(gè)分子MolA和MolB

（3）ZR1凝膠體外表現(xiàn)出抗真菌活性

ZR1凝膠對(duì)白色念珠菌表現(xiàn)出顯著抗真菌活性。平板計(jì)數(shù)結(jié)果顯示，2.0% ZR1凝膠組菌落形成單位（CFUs）顯著低于同濃度溶液組，二者均低于未處理組（圖3a）。在接種密度為1×102至1×10? CFUs的系列測(cè)試中，ZR1凝膠在高密度條件下仍可有效抑制菌落生長(zhǎng)，抑制效果優(yōu)于ZR1溶液（圖3b）。SEM觀察顯示，ZR1凝膠處理后白色念珠菌細(xì)胞形態(tài)破壞明顯，表現(xiàn)為細(xì)胞膜凹陷、破裂或變形；而未處理組細(xì)胞呈完整卵圓狀（圖3c，左）。TEM進(jìn)一步顯示，ZR1凝膠處理組細(xì)胞膜與細(xì)胞壁分離，胞質(zhì)物質(zhì)泄漏；對(duì)照組細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整、胞質(zhì)均勻（圖3c，中、右）。共聚焦激光顯微鏡下的PI和Syto 9雙染結(jié)果表明，ZR1凝膠處理組細(xì)胞PI熒光顯著增強(qiáng)，Syto 9熒光減弱，提示膜通透性增加，細(xì)胞膜完整性受損（圖3d）。上述結(jié)果說明ZR1凝膠通過破壞白色念珠菌細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，增強(qiáng)其膜通透性，導(dǎo)致細(xì)胞死亡，從而發(fā)揮抗真菌作用。

圖3. ZR1凝膠的體外抗真菌性能。（a）ZR1凝膠處理后白色念珠菌的平板計(jì)數(shù)結(jié)果（n = 3）；（b）不同初始接種量條件下ZR1凝膠對(duì)白色念珠菌生長(zhǎng)的抑制效果評(píng)估（n = 3）；（c）ZR1凝膠作用4 h后白色念珠菌的SEM圖像（左）及TEM圖像（中、右）；比例尺分別為2 μm、1 μm和100 nm；（d）ZR1凝膠處理30 min后白色念珠菌經(jīng)碘化丙啶和Syto 9染色的共聚焦激光顯微鏡圖像，比例尺為20 μm；*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，ns表示差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

（4）ZR1凝膠抗真菌特性的分子洞察

ZR1凝膠對(duì)白色念珠菌細(xì)胞膜的破壞效應(yīng)優(yōu)于游離態(tài)溶液，提示其納米纖維結(jié)構(gòu)可能在該過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。3D結(jié)構(gòu)分析顯示，ZR1分子沿螺旋軸方向通過羧基與羥基間的氫鍵穩(wěn)定排列（圖4a,b），三萜骨架朝向纖維內(nèi)核，表面暴露親水性雙糖基團(tuán)（圖4c），促進(jìn)纖維間氫鍵作用（圖4d），實(shí)現(xiàn)內(nèi)疏水、外親水的構(gòu)型（圖4e），有利于與細(xì)胞膜接觸與干擾。密度泛函理論（DFT）與獨(dú)立梯度模型（IGMH）分析顯示，ZR1與β-1,3-葡聚糖之間存在穩(wěn)定氫鍵，作用能為約?0.76 eV，表明其對(duì)白色念珠菌細(xì)胞壁具有較高親和力（圖4f）。分子動(dòng)力學(xué)模擬顯示，ZR1納米纖維可與POPC磷脂發(fā)生顯著相互作用（圖4g,h）。結(jié)果表明，ZR1納米纖維通過識(shí)別并結(jié)合細(xì)胞壁葡聚糖，將其錨定于真菌膜表面，進(jìn)而通過膜結(jié)構(gòu)擾動(dòng)實(shí)現(xiàn)抗真菌活性，呈現(xiàn)細(xì)胞壁識(shí)別與膜破壞的雙重作用機(jī)制。

圖4. ZR1納米纖維組裝在抗真菌活性中的分子機(jī)制。（a）ZR1納米纖維結(jié)構(gòu)模型側(cè)視圖；（b）螺旋軸方向上的分子間相互作用；（c）ZR1納米纖維頂視圖；（d）相鄰原原纖維間的分子作用模式；（e）ZR1結(jié)構(gòu)模型頂視圖，疏水原子以棒狀表示，極性原子以紅球表示；（f）ZR1納米纖維與β-1,3-葡聚糖相互作用的DFT計(jì)算結(jié)果；（g）分子動(dòng)力學(xué)模擬中ZR1凝膠與細(xì)胞膜相互作用的初始狀態(tài)與最終狀態(tài)；（h）細(xì)胞膜在初始與最終狀態(tài)下的空間分布投影圖，X軸與Y軸表示膜模型的長(zhǎng)度（單位：納米）

（5）LGG@ZR1 可在小鼠體內(nèi)抑制 VVC

在小鼠外陰陰道念珠菌?。╒VC）模型中，ZR1凝膠和LGG@ZR1復(fù)合物展現(xiàn)出良好治療效果。雌性BALB/c小鼠經(jīng)雌激素預(yù)處理后陰道接種2 × 10? CFUs白色念珠菌建立VVC模型，感染確認(rèn)后連續(xù)9天給予不同治療，包括LGG、ZR1凝膠、LGG@ZR1復(fù)合物和伊曲康唑（對(duì)照藥物）（圖5a）。外陰觀察顯示，LGG@ZR1組在第5天炎癥顯著緩解，分泌物減少，紅腫消失明顯，優(yōu)于其他組（圖5b）。H&E和PAS染色顯示，LGG@ZR1組陰道上皮結(jié)構(gòu)完整，炎癥反應(yīng)及真菌殘留較輕，近似于健康對(duì)照組；PBS組表現(xiàn)為上皮結(jié)構(gòu)破壞和中性粒細(xì)胞大量浸潤(rùn)（圖5c,d），其他處理組仍存在真菌殘留，提示LGG@ZR1具備良好組織修復(fù)與抗真菌能力。16S rDNA測(cè)序結(jié)果顯示，LGG@ZR1組陰道微生態(tài)多樣性（OTU數(shù)、α-及β-多樣性）顯著高于伊曲康唑組，接近健康組水平（圖5e,f）。菌群組成上，LGG@ZR1處理顯著增加厚壁菌門（Firmicutes）比例，降低變形菌門（Proteobacteria）豐度（圖5g），恢復(fù)至更接近健康狀態(tài)的微生態(tài)結(jié)構(gòu)。綜上，LGG@ZR1在體內(nèi)表現(xiàn)出優(yōu)于伊曲康唑的抗VVC療效，具有抗真菌、抗炎、免疫調(diào)節(jié)及陰道微生態(tài)修復(fù)的多重功能，具備潛在臨床應(yīng)用前景。

圖5. LGG@ZR1對(duì)小鼠VVC模型的體內(nèi)治療效果。（a）VVC建模、治療與檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)流程圖及不同處理組小鼠陰道外觀圖；（b）健康組、VVC模型組及LGG、ZR1凝膠、LGG@ZR1、伊曲康唑治療組小鼠的外觀圖像（n = 5）；（c,d）各組小鼠陰道組織的H&E染色與PAS染色圖像，比例尺：100 μm；（e,f）各組陰道菌群的α多樣性（Chao）與β多樣性（PCoA）指數(shù)，數(shù)據(jù)以幾何均值 ± SEM 表示（n = 5），P值采用Student’s t檢驗(yàn)計(jì)算；（g）各處理組在門水平的菌群相對(duì)豐度熱圖