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針對(duì)上述問(wèn)題陸軍軍醫(yī)大學(xué)張慶/羅高興團(tuán)隊(duì)從大鯢皮膚分泌物中提取糖胺聚糖（SAGs），開(kāi)發(fā)了基于SAGs的復(fù)合微球（Gel-SAGs MPs），并揭示了SAGs如何通過(guò)調(diào)控巨噬細(xì)胞的代謝重編程來(lái)促進(jìn)糖尿病傷口愈合。該文章于2025年02月18日以《Andrias davidianus Derived Glycosaminoglycans Direct Diabetic Wound Repair by Reprogramming Reparative Macrophage Glucolipid Metabolism》為題發(fā)表于《Advanced Materials》（DOI：10.1002/adma.202417801）。

（1）SAGs通過(guò)促進(jìn)血管生成促進(jìn)糖尿病傷口愈合

圖1A展示了從大鯢皮膚分泌物中提取糖胺聚糖（SAGs）的過(guò)程，并通過(guò)化學(xué)分析鑒定其獨(dú)特的結(jié)構(gòu)。體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了SAGs對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞增殖和管狀形成的影響，發(fā)現(xiàn)其能顯著促進(jìn)血管生成。圖1B表明，在糖尿病小鼠模型中，SAGs組的傷口愈合率顯著高于SSAD蛋白組和對(duì)照組。具體而言，SAGs組在傷后第7天的愈合率為40.13 ± 7.12%，第10天為68.2 ± 2.97%，而SSAD蛋白組和對(duì)照組的愈合率顯著較低。圖1C-D的H&E染色和Masson染色結(jié)果顯示，SAGs組在第10天表現(xiàn)出更厚的表皮層（圖1F）、更高的膠原沉積量（圖1G）以及更完整的再上皮化，而SSAD蛋白組和對(duì)照組的傷口修復(fù)不完全，膠原沉積稀疏，再上皮化不充分。圖1E的免疫熒光染色顯示，SAGs組在第7天的CD31（紅色）和α-SMA（綠色）表達(dá)顯著增加，表明新生血管形成更為顯著（圖1H）。圖1I-J的單糖組成和1H NMR分析進(jìn)一步確認(rèn)了SAGs的結(jié)構(gòu)特征。

圖1 大鯢再生信號(hào)的轉(zhuǎn)化應(yīng)用及糖尿病傷口修復(fù)效果評(píng)估。（A）從大鯢學(xué)習(xí)并轉(zhuǎn)移再生密碼至哺乳動(dòng)物組織再生與修復(fù)；（B）不同治療組糖尿病傷口照片（不同天數(shù)）；（C）HE 染色；（D）Masson 染色；（E）免疫熒光染色；（F）上皮層厚度；（G）膠原沉積量；（H）CD31 和 α-SMA 表達(dá)量；（I）單糖組成；（J）1H NMR 分析

（2）SAGs誘導(dǎo)修復(fù)性巨噬細(xì)胞極化促進(jìn)血管生成和創(chuàng)面愈合

單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（圖2A）顯示，在糖尿病傷口中，巨噬細(xì)胞是主要的細(xì)胞類型，并且SAGs處理顯著增加了修復(fù)性巨噬細(xì)胞亞群（Arg1⁺/IL10⁺/S100a4⁺）的比例，同時(shí)減少了炎癥性巨噬細(xì)胞亞群（Nos2⁺/IL6⁺/Cd68⁺）的比例。圖2B的細(xì)胞間通訊分析表明，巨噬細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞之間存在密切的相互作。圖2C-2D的基因表達(dá)分析顯示，在SAGs處理后，糖尿病傷口中炎癥相關(guān)基因（如Nos2和IL6）的表達(dá)被抑制，而修復(fù)性基因（如Arg1和IL10）的表達(dá)顯著上調(diào)。共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)（圖2E-2F）表明，SAGs顯著增強(qiáng)了巨噬細(xì)胞刺激內(nèi)皮細(xì)胞形成管狀結(jié)構(gòu)的能力，且這種作用在0.1 mg/mL的SAGs濃度下達(dá)到最佳效果。圖2G進(jìn)一步證實(shí)了SAGs在不同濃度下對(duì)IL-6、IL-10和VEGF表達(dá)的影響，表明0.1 mg mL^?1是促進(jìn)修復(fù)的最佳濃度。免疫熒光分析（圖2H-2I）顯示，與LPS/IFNγ組相比，SAGs刺激顯著增加了抗炎巨噬細(xì)胞（ARG1⁺）的比例，同時(shí)減少了炎癥性巨噬細(xì)胞（NOS2⁺）的比例。RT-qPCR分析（圖2J）確認(rèn)了SAGs對(duì)巨噬細(xì)胞極化的調(diào)控作用，表現(xiàn)為炎癥標(biāo)志物（NOS2和IL6）的下調(diào)和抗炎及修復(fù)性細(xì)胞因子（IL10、ARG1和VEGFA）的上調(diào)。這些結(jié)果共同表明，SAGs通過(guò)促進(jìn)巨噬細(xì)胞從炎癥表型向修復(fù)表型轉(zhuǎn)變，從而誘導(dǎo)血管生成并加速糖尿病傷口愈合（圖2K）。

圖2 SAGs誘導(dǎo)的血管生成與巨噬細(xì)胞狀態(tài)轉(zhuǎn)變。（A）scRNA-seq；（B）內(nèi)皮細(xì)胞與其他細(xì)胞群體的配體-受體相互作用強(qiáng)度；（C）糖尿病傷口中炎性和修復(fù)性巨噬細(xì)胞亞群（不同處理）；（D）炎性和修復(fù)性基因表達(dá)；（E）巨噬細(xì)胞與HUVEC共培養(yǎng)示意圖；（F）成管圖像；（G）SAG濃度對(duì)巨噬細(xì)胞IL-6/IL-10/VEGFA表達(dá)的影響；（H, I）不同處理后iNOS+（H）和Arg-1+（I）巨噬細(xì)胞表型的熒光圖像及定量分析；（J）不同巨噬細(xì)胞表型標(biāo)志物基因的RT-qPCR分析；（K）SAGs通過(guò)促進(jìn)巨噬細(xì)胞狀態(tài)轉(zhuǎn)變促進(jìn)血管生成

（3）SAGs引導(dǎo)代謝適應(yīng)協(xié)調(diào)巨噬細(xì)胞的表型轉(zhuǎn)變

韋恩圖分析（圖3A）顯示，與LPS/IFNγ組相比，LPS/IFNγ + SAGs組的差異表達(dá)基因（DEGs）顯著變化，表明SAGs處理對(duì)巨噬細(xì)胞的基因表達(dá)具有廣泛影響。熱圖（圖3B）進(jìn)一步揭示了SAGs處理后，與炎癥相關(guān)的基因（如NLRP3、IL1β、IL6等）表達(dá)下調(diào)，而與脂質(zhì)代謝和修復(fù)相關(guān)的基因（如CD36、PPARG等）表達(dá)上調(diào)。圖3C和3D的相對(duì)表達(dá)量分析顯示，SAGs顯著抑制了糖酵解相關(guān)基因（HK1、HK2、PFKP、GLUT1等）的表達(dá)，同時(shí)增強(qiáng)了脂質(zhì)代謝相關(guān)基因的表達(dá)。KEGG通路分析（圖3E和3F）表明，SAGs處理顯著下調(diào)了炎癥信號(hào)通路（如NOD樣受體、TNF、Toll樣受體等），并上調(diào)了脂質(zhì)代謝相關(guān)通路（如脂肪消化與吸收、PPAR信號(hào)通路等）?；蚣患治觯℅SEA）結(jié)果（圖3G–K）進(jìn)一步證實(shí)了SAGs對(duì)糖酵解/糖異生、脂肪酸代謝和mTOR信號(hào)通路的顯著影響，表明SAGs通過(guò)代謝重編程促進(jìn)巨噬細(xì)胞從炎癥表型向修復(fù)表型轉(zhuǎn)變。

圖3 SAGs誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞炎癥和代謝模式的改變。（A）韋恩分析；（B）基因熱圖；（C）巨噬細(xì)胞極化關(guān)鍵基因表達(dá)；（D）代謝相關(guān)基因表達(dá)；（E）LPS/IFNγ + SAG組下調(diào)的KEGG途徑分析；（F）LPS/IFNγ + SAG組上調(diào)的KEGG途徑分析；（G-K）糖酵解/糖異生、乙醛酸和二羧酸代謝、mTOR信號(hào)傳導(dǎo)、鞘脂代謝、脂肪消化吸收途徑的GSEA及核心富集符號(hào)熱圖

RT-qPCR分析（圖4A）顯示，與LPS/IFNγ刺激組相比，SAGs處理顯著抑制了糖酵解相關(guān)基因（HK1、HK2、PFKP和GLUT1）的表達(dá)，同時(shí)顯著增強(qiáng)了脂質(zhì)代謝相關(guān)基因（PPARG）的表達(dá)。Western blotting分析（圖4B）進(jìn)一步確認(rèn)了代謝相關(guān)蛋白表達(dá)的變化，表明SAGs處理促進(jìn)了巨噬細(xì)胞向氧化代謝的轉(zhuǎn)變。實(shí)時(shí)測(cè)量巨噬細(xì)胞外酸化（圖4C）顯示，與LPS/IFNγ刺激的巨噬細(xì)胞相比，LPS/IFNγ + SAGs處理組的細(xì)胞外酸化率降低，證實(shí)了代謝向氧化代謝的轉(zhuǎn)變。流式細(xì)胞術(shù)（圖4D和4E）顯示，PPARγ抑制劑GW9662逆轉(zhuǎn)了SAGs促進(jìn)骨髓來(lái)源巨噬細(xì)胞（BMDMs）從炎癥表型向修復(fù)表型轉(zhuǎn)變的效果。Seahorse通量分析（圖4F）進(jìn)一步表明，SAGs增強(qiáng)了巨噬細(xì)胞的線粒體氧化磷酸化，增加了基礎(chǔ)和最大氧耗率（OCR），而GW9662顯著逆轉(zhuǎn)了這種增加。RT-qPCR（圖4G）和Western blotting分析（圖4H）證實(shí)了PPARγ敲低后，SAGs介導(dǎo)的Arg1上調(diào)和Nos2下調(diào)顯著減弱，表明PPARγ在SAGs誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞極化中發(fā)揮關(guān)鍵作用。

圖4 SAG 通過(guò)代謝重編程將巨噬細(xì)胞群從促炎狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榭寡缀痛僭偕鸂顟B(tài)。（A）參與糖脂代謝的關(guān)鍵基因的 RT-qPCR 分析；（B）WB 分析相關(guān)蛋白表達(dá)水平；（C）細(xì)胞外酸化的實(shí)時(shí)測(cè)量；（D，E）不同處理的骨髓來(lái)源的巨噬細(xì)胞（BMDM）中 CD68（D）和 CD206（E）的流式細(xì)胞分析和定量；（F）不同處理的 BMDM 中細(xì)胞代謝的海馬通量分析；（G）PPARγ 敲低 BMDM 中 Pparg、Arg-1 和 Nos-2 的 RT-qPCR 分析；（H）PPARγ 敲低 BMDM 中 CD206、Arg-1、iNOS 和 PPARγ 的 WB 分析

（4）SAGs對(duì)糖尿病傷口的修復(fù)

圖 5A 的示意圖展示了通過(guò)微流控方法制備 Gel-SAGs MPs 的過(guò)程，成功將 GelMA 和 SAGs 結(jié)合。圖 5B 的 FTIR 結(jié)果確認(rèn) GelMA 與 SAGs 之間形成了酰胺鍵，且 Gel-SAGs MPs 的酰胺 II 與酰胺 I 比值顯著高于單獨(dú)的 SAGs 或 GelMA。圖 5C 的 zeta 電位分析顯示 Gel-SAGs MPs 的 zeta 電位值為 ?6.41 ± 5.31 mV，介于未改性 GelMA（?0.46 ± 1.07 mV）和 SAGs（?21.46 ± 2.47 mV）之間，表明其具有負(fù)電荷特性，有利于與正電荷蛋白相互作用。圖 5D 的 SEM 圖像顯示 Gel-SAGs MPs 保留了與 GelMA MPs 相似的完整多孔結(jié)構(gòu)，平均粒徑為 325 ± 14 μm，孔徑在 5 到 10 μm 之間，且更均勻。圖 5E 和 5F 的降解行為分析表明，Gel-SAGs MPs 在 48 小時(shí)后開(kāi)始破壞球體完整性，72 小時(shí)內(nèi)累積釋放 SAGs 達(dá)約 80%，降解率逐漸達(dá)到 50%，其降解行為與 SAGs 釋放密切相關(guān)。圖 5G 展示了 Gel-SAGs MPs 在大鼠皮下植入模型中的降解情況，與殼聚糖粉末（CHP）相比，Gel-SAGs MPs 在第 10 天幾乎完全降解，降解周期與理想傷口愈合時(shí)間一致。圖 5H 的 H&E 染色顯示 Gel-SAGs MPs 處理的組織中炎癥細(xì)胞逐漸減少，表明其具有較低的炎癥反應(yīng)。圖 5I 的肝臟創(chuàng)傷模型顯示 Gel-SAGs MPs 顯著縮短了止血時(shí)間（71.33 ± 8.02 秒）并減少了血液損失（205.93 ± 22.24 毫克），與商業(yè)殼聚糖粉末（CHP）相當(dāng)。圖 5J 的 H&E 染色圖像進(jìn)一步證實(shí)了 Gel-SAGs MPs 在促進(jìn)肝臟損傷修復(fù)方面的有效性。圖 5K 的免疫熒光分析顯示，與 CHP 和其他對(duì)照組相比，Gel-SAGs MPs 顯著降低了 CD11b+ 巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的表達(dá)，表明其具有抗炎特性。這些結(jié)果表明，Gel-SAGs MPs 作為一種新型傷口愈合增強(qiáng)劑，具有良好的生物相容性、生物降解性和止血性能，能夠有效調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)，促進(jìn)組織修復(fù)。

圖5 基于SAGs的傷口愈合促進(jìn)劑的構(gòu)建與表征。（A）微流控方法制備Gel-SAGs MP；（B）FTIR光譜；（C）電位；（D）SEM圖像；（E, F）SAG釋放與GelMA-SAG降解的定性和定量分析；（G）Gel-SAGs MP在大鼠皮下植入模型中的降解圖像；（H）H&E染色；（I）肝創(chuàng)傷模型中出血的定量分析；（J）H&E；（K）免疫熒光

圖 6A 的 ELISA 分析顯示 Gel-SAGs MPs 對(duì)炎癥趨化因子 MCP-1、IL-6 和 IL-8 具有較強(qiáng)的親和力，能夠有效捕獲這些因子。圖 6B 的巨噬細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了 Gel-SAGs MPs 的這種能力，其顯著減少了 MCP-1 誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞遷移（p = 0.0445），與陽(yáng)性對(duì)照組相比，遷移減少更為顯著（p = 0.0016）。圖 6C 的免疫熒光圖像顯示，在皮下植入后的第 3 天，Gel-SAGs MPs 周圍和內(nèi)部有顯著的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，但到了第 7 天，這種浸潤(rùn)減少，且巨噬細(xì)胞表現(xiàn)出抗炎表型（Arg1+），表明 Gel-SAGs MPs 能夠促進(jìn)巨噬細(xì)胞從炎癥狀態(tài)向抗炎和修復(fù)狀態(tài)轉(zhuǎn)變。

圖6 Gel-SAGs MPs 通過(guò)與炎癥趨化因子和巨噬細(xì)胞相互作用來(lái)募集并促進(jìn)炎癥轉(zhuǎn)化。（A）ELISA 定量分析；（B）巨噬細(xì)胞遷移評(píng)估；（C）第3天和第7天由皮下包埋的微球募集的抗炎巨噬細(xì)胞（Arg-1?）的熒光圖像及定量分析

（5）Gel-SAGs MPs通過(guò)效應(yīng)控制、炎癥微環(huán)境調(diào)節(jié)和血管化促進(jìn)糖尿病傷口愈合

圖7A總結(jié)了Gel-SAGs MPs在糖尿病傷口愈合中的多方面作用，包括快速止血、分泌物管理以及激活內(nèi)源性修復(fù)階段，顯著改善了糖尿病傷口的愈合過(guò)程。圖7B的代表性數(shù)字圖像顯示，與對(duì)照組、GelMA MPs和商業(yè)殼聚糖粉末（CHP）相比，Gel-SAGs MPs處理組在傷后第14天的傷口閉合率最高，達(dá)到86.41 ± 3.69%，顯著高于其他組。圖7C的定量分析進(jìn)一步證實(shí)了這一結(jié)果，表明Gel-SAGs MPs在所有觀察時(shí)間點(diǎn)均顯著促進(jìn)傷口閉合。圖7D的實(shí)時(shí)血流灌注圖像顯示，Gel-SAGs MPs顯著改善了傷口區(qū)域的血流供應(yīng)，這對(duì)于糖尿病傷口的慢性愈合至關(guān)重要。圖7E和7F的H&E和Masson染色結(jié)果表明，Gel-SAGs MPs顯著促進(jìn)了肉芽組織的形成和增厚。

圖7 基于 SAGs 的傷口愈合促進(jìn)劑可促進(jìn)糖尿病小鼠的傷口修復(fù)。（A）Gel-SAGs MP 對(duì)慢性傷口愈合的多方面影響；（B）第 0、3、7 和 10 天不同處理后的傷口圖像；（C）第 3、7 和 10 天不同處理下的傷口愈合情況；（D）第 7 天傷口中血流的圖像及定量分析；（E）H&E 染色及定量分析；（F）Masson 染色及定量分析

圖8A和8B的免疫熒光圖像顯示，在傷后第3天，Gel-SAGs MPs處理組的炎癥巨噬細(xì)胞標(biāo)志物iNOS的熒光強(qiáng)度較低（圖8D），而抗炎巨噬細(xì)胞標(biāo)志物CD206的熒光強(qiáng)度較高（圖8E），表明Gel-SAGs MPs促進(jìn)了巨噬細(xì)胞從炎癥表型向抗炎表型的轉(zhuǎn)變。圖8C和8F的CD31和α-SMA免疫熒光染色顯示，在傷后第7天和第10天，Gel-SAGs MPs組的新生血管形成顯著增加。圖8G和8H的天狼星紅染色和α-SMA免疫熒光分析顯示，在傷后第21天，Gel-SAGs MPs處理的傷口中，膠原纖維網(wǎng)絡(luò)特征更接近正常皮膚，表現(xiàn)為膠原纖維更短、排列更隨機(jī)，且α-SMA+成纖維細(xì)胞數(shù)量顯著減少，表明Gel-SAGs MPs減少了纖維化和瘢痕形成。

圖8 評(píng)估 Gel-SAGs MPs 治療后糖尿病傷口中巨噬細(xì)胞極化、新生血管形成和纖維化情況。（A-C）不同處理組免疫熒光染色；（D-F）免疫熒光染色的定量分析；（G, H）不同處理后天狼星紅染色和 α-SMA 免疫熒光的圖像及定量分析

圖9A的圖像顯示，Gel-SAGs MPs在促進(jìn)糖尿病傷口愈合方面顯著優(yōu)于碘伏、MepILex Lite泡沫敷料和藻酸鹽敷料。圖9B的定量分析表明，Gel-SAGs MPs處理組的傷口閉合率顯著高于其他商業(yè)產(chǎn)品，表明其在愈合速度上的優(yōu)勢(shì)。圖9C的H&E染色和Masson染色結(jié)果顯示，Gel-SAGs MPs顯著加速了傷口愈合并改善了愈合質(zhì)量，表現(xiàn)為更完整的上皮化和更密集的膠原沉積，而其他材料的效果相對(duì)較弱。圖9D的治療模式比較熱圖進(jìn)一步揭示了Gel-SAGs MPs在免疫調(diào)節(jié)和代謝調(diào)節(jié)方面的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，表明其能夠通過(guò)多維度調(diào)節(jié)傷口微環(huán)境來(lái)促進(jìn)組織再生。

圖9 Gel-SAGs MPs 與其他常用傷口處理材料的比較。（A）Gel-SAGs MP 與市售產(chǎn)品之間的比較圖像；（B）傷口愈合百分比；（C）不同處理下的 H&E 染色、Masson 染色及定量分析；（D）Gel-SAGs MP 治療組與常見(jiàn)商業(yè)傷口治療產(chǎn)品的熱圖比較