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針對上述問題，南京醫(yī)科大學(xué)胡克教授和張飛敏（音譯）教授團(tuán)隊(duì)提出了一種基于普魯士藍(lán)納米雜化多細(xì)胞球體（PBNPs@MCSs）的復(fù)合移植體，用于抗氧化骨再生和光聲層析成像。該復(fù)合移植體通過調(diào)節(jié)細(xì)胞基質(zhì)的機(jī)械性能，引導(dǎo)多種細(xì)胞自組織形成多細(xì)胞球體（MCSs），并在形成過程中將普魯士藍(lán)納米粒子（PBNPs）與MCSs雜化。這種納米雜化多細(xì)胞球體不僅具有強(qiáng)大的抗氧化功能，能夠有效減少細(xì)胞在氧化應(yīng)激條件下的凋亡，還表現(xiàn)出增強(qiáng)的微環(huán)境調(diào)節(jié)能力和促進(jìn)體內(nèi)外骨修復(fù)的能力。此外，PBNPs@MCSs還展現(xiàn)出增強(qiáng)的光聲成像能力，能夠追蹤低劑量的PBNPs。因此，基于仿生水凝膠構(gòu)建的PBNPs@MCSs可以作為一種復(fù)合移植體的構(gòu)建模塊，在口腔復(fù)雜微環(huán)境中具有更大的促骨修復(fù)應(yīng)用潛力。該文章于2024年08月09日以《Prussian Blue Nanohybridized Multicellular Spheroids as Composite Engraftment for Antioxidant Bone Regeneration and Photoacoustic Tomography》為題發(fā)表于《ACS Nano》（DOI：10.1021/acsnano.3c06835）。

研究示意圖

（1）普魯士藍(lán)納米粒子（PBNPs）和仿生水凝膠的表征

TEM和SEM觀察普魯士藍(lán)納米粒子（PBNPs）的形貌，發(fā)現(xiàn)PVP包覆的PBNPs呈立方體形狀，直徑約100納米，粒徑均勻，表面呈“顆粒狀”（圖S1A、B）。高分辨率透射電子顯微鏡（HR-TEM）圖像清晰顯示了納米顆粒中分散的獨(dú)特晶格和表面晶格條紋，表明PBNPs具有良好的結(jié)晶性（圖S1D）。能量色散X射線光譜（EDX）確認(rèn)PBNPs的元素組成為C、N、Fe和K，其中Fe元素含量最高（圖S1E）。紫外-可見（UV-vis）吸收光譜顯示PBNPs在約700納米處有一個(gè)峰，歸因于Fe(II)和Fe(III)之間的價(jià)電荷轉(zhuǎn)移（圖S2A）。PBNPs的流體動力學(xué)尺寸約為131納米，平均zeta電位約為-21.8毫伏，表明其表面帶負(fù)電（圖S2B、C）。傅里葉變換紅外光譜（FTIR）顯示PBNPs在2086厘米?1處有一個(gè)主要峰，對應(yīng)于Fe(II)-CN-Fe(III)鍵的-C≡N-伸縮振動（圖S2D）。

圖S1 普魯士藍(lán)納米粒子（PBNPs）的表征。（A）PBNPs的透射電子顯微鏡（TEM）圖像；（B）PBNPs的掃描電子顯微鏡（SEM）圖像（100k倍）；（C）PBNPs的掃描電子顯微鏡（SEM）圖像（500k倍）；（D）PBNPs表面晶格的高分辨率透射電子顯微鏡（HR-TEM）圖像；（E）PBNPs的能量色散X射線光譜（EDX）元素分布圖（黃色：Fe，藍(lán)色：K，紅色：N，綠色：C）

（2）PBNPs@MCSs的制備

圖1展示了PBNPs@MCSs在水凝膠上的形成過程，通過調(diào)節(jié)細(xì)胞基質(zhì)力學(xué)性能引導(dǎo)細(xì)胞自組織形成MCSs，并實(shí)現(xiàn)其與PBNPs的雜化。圖1D的ICP-MS實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在MCSs（MC3T3-E1）中，PBNPs主要被包裹在球體內(nèi)部，僅有少量被細(xì)胞吞噬。圖1E顯示，MCSs（MC3T3-E1）和PBNPs@MCSs（MC3T3-E1）直徑均約為200微米，且呈完整球形，PBNPs@MCSs中心部分較暗，說明納米粒子在球體內(nèi)部穩(wěn)定。圖1F的免疫熒光染色結(jié)果表明，添加PBNPs未顯著改變細(xì)胞間相互作用分子（如E-鈣黏蛋白）的表達(dá)，也未影響MCSs的細(xì)胞骨架和形態(tài)，證實(shí)了該雜化體系的生物相容性。圖1G描繪了MC3T3-E1細(xì)胞在水凝膠上自組織形成球體的時(shí)間演變：培養(yǎng)12小時(shí)后，細(xì)胞開始通過分泌細(xì)胞外基質(zhì)相互作用；1至5天內(nèi)，細(xì)胞逐漸聚集形成多細(xì)胞團(tuán)塊，形狀逐漸圓潤，5天后形成分離的MCSs。這種在水凝膠上通過細(xì)胞自主裝載形成納米雜化MCSs的方法，不依賴納米粒子內(nèi)化，提高了標(biāo)記效率，減少了細(xì)胞損傷，且更具通用性，可標(biāo)記內(nèi)化能力低的細(xì)胞類型和納米粒子，拓展了納米雜化MCSs的功能。

圖1 仿生水凝膠的表征。（A）仿生水凝膠的宏觀照片；（B）仿生水凝膠的掃描電子顯微鏡（SEM）圖像；（C）水凝膠的力學(xué)性能表征；（D）鐵含量的電感耦合等離子體質(zhì)譜（ICP-MS）測試；（E）光學(xué)顯微鏡圖像顯示MC3T3-E1細(xì)胞形成的多細(xì)胞球體（MCSs）和普魯士藍(lán)納米粒子雜化的多細(xì)胞球體（PBNPs@MCSs）；（F）通過免疫熒光檢測細(xì)胞黏附因子E-鈣黏蛋白的表達(dá)；（G）在水凝膠上培養(yǎng)120小時(shí)后形成的MC3T3-E1細(xì)胞的MCSs以及與PBNPs共培養(yǎng)形成的PBNPs@MCSs

（3）PBNPs@MCSs的光聲成像效果

圖2A、B展示了不同濃度PBNP溶液（0、10、20、50、100、150和250微克/毫升）在700納米近紅外激光脈沖下的光聲成像實(shí)驗(yàn)結(jié)果。PBNPs能夠產(chǎn)生強(qiáng)烈的光聲信號，且信號強(qiáng)度隨濃度增加而增強(qiáng)，50微克/毫升濃度開始顯示出明顯效果。圖2C、D顯示了在細(xì)胞水平上，PBNPs（20微克/毫升）標(biāo)記的細(xì)胞或MCSs與未標(biāo)記的2D培養(yǎng)細(xì)胞對照組的光聲成像結(jié)果。PBNPs@MCSs（MC3T3-E1）在2D和3D標(biāo)記中均保留了PBNPs的光學(xué)特性，并且顯示出更優(yōu)越的光聲成像能力。圖2E通過在BALB/c小鼠背部皮下注射PBNPs@MCSs（MC3T3-E1）進(jìn)行體內(nèi)光聲成像測試。超聲圖像（圖2E左側(cè)）顯示了清晰的低回聲腔，表明細(xì)胞溶液已成功注入小鼠背部。光聲圖像（圖2E右側(cè)）顯示了不同組的成像效果，信號強(qiáng)度收集結(jié)果如圖2F所示。在體內(nèi)，PBNPs@MCSs（MC3T3-E1）組顯示出比其他兩組更好的光聲成像效果。這些結(jié)果表明，PBNPs@MCSs（MC3T3-E1）具有光聲示蹤能力，可用于追蹤植入物的位置、作用持續(xù)時(shí)間和殘留量。

圖2 光聲成像相關(guān)研究。（A）不同濃度PBNP溶液的光聲圖像（從左到右，濃度逐漸增加）；（B）不同濃度PBNP溶液的光聲信號強(qiáng)度；（C）PBNPs@MCSs（MC3T3-E1）在細(xì)胞水平的光聲成像效果；（D）圖C中不同組的光聲信號強(qiáng)度；（E）在BALB/c小鼠背部皮下注射后PBNPs@MCSs（MC3T3-E1）的體內(nèi)光聲成像（左：超聲圖像，右：光聲圖像）；（F）圖E中不同組的光聲信號強(qiáng)度

（4）PBNPs@MCSs的抗氧化特性

在PBNPs@MCSs（MC3T3-E1）的抗氧化特性實(shí)驗(yàn)中，圖3A顯示PBNPs@MCSs（MC3T3-E1）組的DCF熒光水平與MCSs（MC3T3-E1）組無顯著差異，表明單獨(dú)的PBNPs并未增加MCSs中的ROS水平；而PBNPs@MCSs（MC3T3-E1）+Rosup組的DCF熒光水平顯著低于MCSs（MC3T3-E1）+Rosup組，說明添加PBNPs能夠增強(qiáng)MCSs的抗氧化水平。圖3B的定量結(jié)果與圖3A一致，進(jìn)一步證實(shí)了PBNPs的抗氧化效果。圖3C的活/死染色結(jié)果顯示PBNPs@MCSs（MC3T3-E1）組與MCSs（MC3T3-E1）組無顯著差異，表明PBNPs@MCSs（MC3T3-E1）具有良好的生物安全性。圖3D表明，在400 μM H?O?刺激下，MCSs（MC3T3-E1）組的非凋亡細(xì)胞比例顯著下降，壞死細(xì)胞比例上升，而PBNPs@MCSs（MC3T3-E1）組的細(xì)胞存活率與未刺激的對照組相當(dāng)，說明PBNPs@MCSs（MC3T3-E1）能在高ROS環(huán)境中有效保護(hù)細(xì)胞免受凋亡和壞死。這些結(jié)果表明，PBNPs@MCSs（MC3T3-E1）不僅增強(qiáng)了細(xì)胞的抗氧化特性，還顯著提高了細(xì)胞在氧化應(yīng)激條件下的生存能力。

圖3 氧化應(yīng)激與細(xì)胞活性研究。（A）使用DCFH探針熒光染色的MCSs（MC3T3-E1）和PBNPs@MCSs（MC3T3-E1）的熒光圖像；（B）圖A中不同組DCF熒光強(qiáng)度的定量分析；（C）用H?O?處理的MCSs（MC3T3-E1）和PBNPs@MCSs（MC3T3-E1）的活/死熒光圖像；（D）通過流式細(xì)胞術(shù)檢測MCSs（MC3T3-E1）和PBNPs@MCSs（MC3T3-E1）在氧化環(huán)境中的抗凋亡能力

（5）成骨相關(guān)指標(biāo)的檢測

成骨誘導(dǎo)7天后，ALP染色（圖4A）和活性測定（圖4B）結(jié)果顯示，在MCSs（MC3T3-E1）+H?O?組中，成骨受到顯著抑制，而PBNPs@MCSs（MC3T3-E1）+H?O?組的成骨分化能力恢復(fù)到接近未受H?O?處理的MCSs（MC3T3-E1）組的水平。成骨誘導(dǎo)21天后，茜素紅染色結(jié)果（圖4C）顯示，在MCSs（MC3T3-E1）組中可見大量紅色鈣結(jié)節(jié)，顏色最深，而MCSs（MC3T3-E1）+H?O?組的茜素紅染色最淺，PBNPs@MCSs（MC3T3-E1）+H?O?組介于兩者之間。鈣結(jié)節(jié)的半定量結(jié)果（圖4D）與茜素紅染色結(jié)果基本一致。此外，成骨相關(guān)基因RUNX-2、ALP、COL-I和OCN的mRNA表達(dá)水平的qRT-PCR結(jié)果如圖4E所示。200 μM濃度的H?O?刺激顯著抑制了成骨相關(guān)基因的mRNA表達(dá)，而PBNPs@MCSs（MC3T3-E1）組的成骨相關(guān)基因表達(dá)水平與未受刺激的MCSs（MC3T3-E1）組相似。

圖4 PBNPs@MCSs（MC3T3-E1）的體外抗氧化成骨能力。（A）2D培養(yǎng)細(xì)胞、MCSs（MC3T3-E1）和PBNPs@MCSs（MC3T3-E1）在成骨誘導(dǎo)7天后的堿性磷酸酶（ALP）染色代表性圖像（4×）；（B）成骨誘導(dǎo)7天后2D培養(yǎng)細(xì)胞、MCSs（MC3T3-E1）和PBNPs@MCSs（MC3T3-E1）的ALP活性定量檢測；（C）成骨誘導(dǎo)21天后2D培養(yǎng)細(xì)胞、MCSs（MC3T3-E1）和PBNPs@MCSs（MC3T3-E1）的茜素紅染色代表性圖像（10×）；（D）不同組鈣結(jié)節(jié)的半定量檢測；（E）成骨誘導(dǎo)7天后通過qRT-PCR檢測成骨相關(guān)基因

通過免疫熒光染色觀察各組成骨誘導(dǎo)7天后RUNX2蛋白的表達(dá)情況。RUNX2呈紅色熒光，細(xì)胞骨架呈綠色熒光，細(xì)胞核呈藍(lán)色熒光；結(jié)果如圖5所示。對照組為非球形細(xì)胞，細(xì)胞排列較為規(guī)整。然而，接種在共聚焦培養(yǎng)皿上的球形細(xì)胞向四周擴(kuò)散，大量細(xì)胞骨架相互重疊。在200 μM H?O?刺激下，MCSs（MC3T3-E1）+H?O?組中RUNX2+細(xì)胞顯著減少，而PBNPs@MCSs（MC3T3-E1）+H?O?組中RUNX2+細(xì)胞未顯著減少。

圖5 成骨誘導(dǎo)7天后，通過免疫熒光染色檢測2D培養(yǎng)細(xì)胞（MC3T3-E1）、MCSs（MC3T3-E1）和PBNPs@MCSs（MC3T3-E1）中RUNX2蛋白的表達(dá)。RUNX2（紅色）、鬼筆環(huán)肽（綠色）和DAPI（藍(lán)色）

(6)PBNPs@MCSs（rBMSCs）在體內(nèi)清除ROS的能力檢測

術(shù)后24小時(shí)使用小動物可見光成像系統(tǒng)收集DCF熒光圖像并進(jìn)行定量分析，結(jié)果顯示拔牙手術(shù)創(chuàng)傷導(dǎo)致拔牙窩內(nèi)ROS水平升高，而PBNPs@MCSs（rBMSCs）能有效清除ROS（圖6B、C）。圖6D展示了拔牙后第7天和第21天大鼠上頜第一磨牙的微CT矢狀圖像，術(shù)后7天，空白對照組拔牙區(qū)域存在較大低密度陰影，明膠海綿組有少量新骨形成，而PBNPs@細(xì)胞（rBMSCs）組和PBNPs@MCSs（rBMSCs）組顯示出點(diǎn)狀高密度陰影，但骨密度和骨量相對較低；術(shù)后21天，各組牙槽間隔萎縮消失，拔牙窩區(qū)有層狀新骨形成，其中PBNPs@MCSs（rBMSCs）組骨量和骨密度最高。圖6E、F的量化分析顯示，空白對照組和海綿組之間無顯著差異，而PBNPs@MCSs（rBMSCs）組在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)結(jié)束時(shí)的骨密度（BMD）值和骨量/總體積（BV/TV）比值均顯著高于對照組，且在21天時(shí)，PBNPs@細(xì)胞（rBMSCs）組和PBNPs@MCSs（rBMSCs）組之間出現(xiàn)顯著差異，表明PBNPs@MCSs（rBMSCs）組在拔牙窩內(nèi)具有更強(qiáng)的抗氧化能力和骨修復(fù)效果。

圖6 體內(nèi)動物實(shí)驗(yàn)及成骨效果評估。（A）體內(nèi)動物實(shí)驗(yàn)示意圖；（B）手術(shù)后24小時(shí)，通過小動物可見光成像系統(tǒng)收集的提取窩點(diǎn)的DCF熒光圖像；（C）DCF熒光強(qiáng)度的定量結(jié)果；（D）牙齒拔除后7天和21天大鼠上頜第一磨牙的代表性微CT矢狀圖像；（E）骨密度（BMD）的微CT定量分析結(jié)果；（F）骨體積/總體積（BV/TV）的微CT定量分析結(jié)果；（G）用Masson三色染色的骨缺損標(biāo)本的代表性圖像

隨后，通過Masson三色染色（圖6G）、Goldner三色染色（圖7A）和von Kossa染色（圖7B），結(jié)果顯示PBNPs@MCSs（rBMSCs）組有更好的新骨形成和礦化，組織形態(tài)計(jì)量學(xué)分析也表明該組有顯著更高的礦化骨體積和陽性染色膠原蛋白（圖7C、D），進(jìn)一步證實(shí)了PBNPs@MCSs的原位骨再生潛力。

圖7 手術(shù)后第7天和第21天牙槽骨缺損的組織學(xué)變化。（A）用Goldner三色染色的骨缺損標(biāo)本的代表性圖像（黑條：1 mm（20×）和0.5 mm（40×））；（B）用von Kossa染色的骨缺損標(biāo)本的代表性圖像（黑條：1 mm（20×）和0.5 mm（40×））；（C）Goldner三色染色結(jié)果的統(tǒng)計(jì)分析（陽性面積/總面積）；（D）von Kossa染色結(jié)果的統(tǒng)計(jì)分析（陽性面積/總面積）