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為此，重慶醫(yī)科大學(xué)劉國(guó)棟主任、重慶大學(xué)蔡開(kāi)勇教授和漆超副教授研究開(kāi)發(fā)了一種新型自體納米疫苗，通過(guò)免疫原性多米諾效應(yīng)將免疫抑制性微環(huán)境轉(zhuǎn)化為活躍的免疫景觀，從而靶向殘余腫瘤細(xì)胞并預(yù)防GBM復(fù)發(fā)。該納米疫苗通過(guò)將脂多糖（LPS）和膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞裂解物（GCL）共載入層狀雙氫氧化物（LDH）納米片中制成，隨后將其整合到可注射的海藻酸水凝膠中，形成LLGA-Gel。該納米疫苗利用GCL的免疫原性潛力以及LPS的免疫刺激特性，誘導(dǎo)細(xì)胞焦亡性細(xì)胞死亡，增強(qiáng)樹(shù)突狀細(xì)胞成熟，并促進(jìn)巨噬細(xì)胞向M1表型極化；這些效應(yīng)最終導(dǎo)致腫瘤部位CD8+T細(xì)胞浸潤(rùn)增加和Foxp3+Treg細(xì)胞減少。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明，這種納米疫苗不僅增強(qiáng)了免疫原性細(xì)胞死亡的療效，而且顯著增強(qiáng)了免疫反應(yīng)，從而顯著降低了同種異體GBM的術(shù)后復(fù)發(fā)。這項(xiàng)研究強(qiáng)調(diào)了納米技術(shù)增強(qiáng)的免疫療法在開(kāi)發(fā)針對(duì)GBM的有效納米疫苗方面的前景。該文章于2025年2月3日以《Autologous Nanovaccine Induces Immunogenic Domino Effect to Prevent Postoperative Recurrence of Orthotopic Glioblastoma》為題發(fā)表于《Advanced Functional Materials》（DOI：10.1002/adfm.202412040）。

研究示意圖

（1）納米疫苗的制備與表征

采用水熱法合成的MgAl-LDH納米片為六邊形薄片，直徑約200 nm（SEM，圖2A；TEM，圖2B）。元素映射（圖2B）和XPS（圖2D）證實(shí)其主要元素為Al、Mg、O，且均勻分布。AFM（圖2C）分析顯示其厚度約4 nm。脂多糖的紫外-可見(jiàn)吸收光譜在259 nm處有特征峰，加載后顯著降低（圖2E），F(xiàn)T-IR光譜在≈2350 cm?1處有特征峰，LDH-LPS中保留（圖2F），表明脂多糖成功加載。Zeta電位測(cè)試（圖2G）顯示LDH納米片在水中帶弱負(fù)電荷，加載LPS后負(fù)電荷顯著增加，用GCL包覆后LLG的Zeta電位逆轉(zhuǎn)至≈+13 mV。Bradford蛋白質(zhì)測(cè)定法用于測(cè)量GCL的包封效率。XRD圖譜（圖2H）顯示LLG的衍射峰與LDH相似，與氫氧化鎂鋁的標(biāo)準(zhǔn)卡片特征峰一致（PDF#35-0965，Mg?Al?(OH)??·4.5H?O），說(shuō)明LPS和GCL的加載對(duì)LDH的結(jié)晶無(wú)影響。

圖1 MgAl-LDH的表征。（A）代表性掃描電子顯微鏡（SEM）圖像；（B）透射電子顯微鏡（TEM）圖像和MgAl-LDH的元素映射；（C）原子力顯微鏡（AFM）圖像和MgAl-LDH納米片在兩個(gè)不同視角下的厚度；（D）LDH的X射線光電子能譜（XPS）分析；（E）LPS加載前后的紫外-可見(jiàn)光譜；（F）LDH、LPS和LDH-LPS的傅里葉變換紅外光譜（FT-IR）；（G）LDH、LDH-LPS和LLG的Zeta電位測(cè)量（n=3）；（H）LDH、LLG和標(biāo)準(zhǔn)鎂鋁氫氧化物卡片（PDF#35-0965，Mg?Al?(OH)??·4.5H?O）的X射線衍射（XRD）圖譜

（2）細(xì)胞焦亡與LLG納米疫苗的抗腫瘤效果和免疫原性細(xì)胞死亡（ICD）機(jī)制

前期研究已證實(shí)LPS可啟動(dòng)炎癥小體形成，炎癥小體激活caspase-1，進(jìn)而切割gasdermin D（GSDMD），其N端片段轉(zhuǎn)移到細(xì)胞膜形成孔洞，導(dǎo)致細(xì)胞腫脹、裂解，引發(fā)細(xì)胞焦亡。本研究旨在驗(yàn)證LLG納米疫苗的體外抗腫瘤效果。選用GL261膠質(zhì)瘤細(xì)胞為腫瘤細(xì)胞模型，HT22神經(jīng)元細(xì)胞為正常細(xì)胞模型，采用CCK-8試劑盒評(píng)估LLG的細(xì)胞毒性及生物安全性。結(jié)果顯示，LPS對(duì)GL261細(xì)胞的細(xì)胞毒性呈濃度依賴性，LDH加載后增強(qiáng)（圖3A）。LLG處理后，GSDMD切割水平升高，N端帶增加（圖3B），這源于LDH促進(jìn)GL261細(xì)胞對(duì)LPS的攝取，GCL的加載進(jìn)一步增強(qiáng)此作用（圖3D、E）。因此，LLG在相同濃度下抗腫瘤效果最佳。Caspase-1抑制劑Z-VAD-FMK顯著增加細(xì)胞存活率（圖3C），證實(shí)caspase-1介導(dǎo)的GSDMD激活是細(xì)胞焦亡的關(guān)鍵。此外，LLG在80 μg/mL濃度下對(duì)HT22神經(jīng)元細(xì)胞無(wú)明顯細(xì)胞毒性（圖3A），因其攝取量低（圖S4A、B，支持信息）。這表明LLG納米疫苗可選擇性靶向并消除腫瘤細(xì)胞，而不影響正常神經(jīng)細(xì)胞，最大限度地提高治療效果并減少對(duì)健康腦組織的損害。

細(xì)胞焦亡以細(xì)胞腫脹、細(xì)胞膜破裂為特征，釋放細(xì)胞內(nèi)容物激活炎癥反應(yīng)，被視為免疫原性細(xì)胞死亡（ICD）。推測(cè)LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞焦亡可促進(jìn)GL261細(xì)胞釋放抗原物質(zhì)，激活腫瘤免疫原性。ICD的標(biāo)志包括細(xì)胞表面鈣網(wǎng)蛋白（CRT）外翻、ATP分泌和高遷移率族蛋白B1（HMGB1）釋放。LLG處理后，GL261細(xì)胞表面CRT信號(hào)最強(qiáng)（圖3F、G），而其他組信號(hào)較低。ATP和HMGB1水平在各治療組均升高，LLG處理效果最顯著（圖3I、J）。HMGB1的免疫熒光染色顯示其從細(xì)胞核到細(xì)胞質(zhì)的轉(zhuǎn)位及細(xì)胞外釋放（圖3H）。這些結(jié)果表明LLG通過(guò)攜帶腫瘤裂解物，觸發(fā)廣泛的抗原釋放，增強(qiáng)免疫原性。

圖2（A）不同樣本處理24小時(shí)后GL261和HT22細(xì)胞的存活率（n=3）；（B）GL261細(xì)胞的GSDMD和β-ACTIN的Western blot分析；（C）GL261細(xì)胞存活率（24小時(shí)，有無(wú)Z-VAD-FMK，n=3）；（D）GL261細(xì)胞與LDH和LDH-GCL共孵育4小時(shí)的CLSM圖像（Cy5.5標(biāo)記，DAPI染色）；（E）GL261和HT22細(xì)胞與LDH和LDH-GCL共孵育4小時(shí)的流式細(xì)胞術(shù)分析；（F）GL261細(xì)胞中CRT分布的CLSM圖像（LDH、LPS、LDH-LPS和LLG處理）；（G）GL261細(xì)胞CRT暴露的流式細(xì)胞術(shù)定量分析（n=3）；（H）GL261細(xì)胞內(nèi)HMGB1分布的CLSM圖像（LDH、LPS、LDH-LPS和LLG處理）；（I）GL261細(xì)胞HMGB1釋放譜（n=3）；（J）GL261細(xì)胞細(xì)胞外ATP分泌（n=3）

（3）LLG促進(jìn)DCs成熟和巨噬細(xì)胞極化

DCs和巨噬細(xì)胞對(duì)LDH-GCL的攝取顯著增加（圖4A）。與單獨(dú)的LDH相比，LLG處理組中M1型巨噬細(xì)胞數(shù)量顯著增加（圖4B）。LLG處理組中M2型巨噬細(xì)胞數(shù)量處于最低水平（圖4C）。LLG處理組中M1型巨噬細(xì)胞的極化效果顯著（圖4D）。在抗原共存條件下，LLG組中CD80和CD86雙陽(yáng)性DC的數(shù)量超過(guò)其他組（圖4E）。LLG處理組中M1型巨噬細(xì)胞的極化效果顯著（圖4F）。LLG處理組中M2型巨噬細(xì)胞數(shù)量處于最低水平（圖4G）。LLG處理組中CD80和CD86雙陽(yáng)性DC的數(shù)量超過(guò)其他組，表明LLG具有最佳的DC促成熟功能（圖4H）。

圖3（A）流式細(xì)胞術(shù)分析游離LDH和LDH-GCL在RAW264.7細(xì)胞（左）和DC2.4細(xì)胞（右）中的細(xì)胞攝?。唬˙）使用游離LDH和LDH-GCL培養(yǎng)的RAW264.7細(xì)胞、DC2.4細(xì)胞的細(xì)胞吞噬定量分析（n=3）；（C，D）不同材料處理后RAW264.7細(xì)胞中M1巨噬細(xì)胞（CD11b?CD86?，C）和M2巨噬細(xì)胞（CD11b?CD206?，D）的流式細(xì)胞術(shù)分析；（E）與不同材料預(yù)處理的膠質(zhì)瘤細(xì)胞共培養(yǎng)后DC成熟度的流式細(xì)胞術(shù)分析；（F，G）RAW264.7細(xì)胞中M1巨噬細(xì)胞（F）和M2巨噬細(xì)胞（G）的相對(duì)定量（n=3）；（H）與預(yù)處理的GL261共培養(yǎng)后成熟的DC2.4的相對(duì)定量（n=3）

（4）評(píng)估同種異體GBM術(shù)后復(fù)發(fā)的預(yù)防

為了將LLG納米疫苗錨定在腫瘤部位，以實(shí)現(xiàn)腫瘤疫苗和免疫佐劑的持續(xù)緩慢釋放，該研究將LLG嵌入Alg-Gel構(gòu)建LLGA-Gel藥物儲(chǔ)存庫(kù)。Alg-Gel和LLGA-Gel均具有均勻且完整的多孔結(jié)構(gòu)。LLGA-Gel在手術(shù)切除后第33天對(duì)GBM術(shù)后復(fù)發(fā)的抑制作用最強(qiáng)（圖5C、D）。與對(duì)照組相比，LA-Gel和LLA-Gel對(duì)腫瘤復(fù)發(fā)有一定抑制作用，LLGA-Gel抑制作用最強(qiáng)（圖5E）。LLGA-Gel治療組的腦切片中幾乎不存在惡性腫瘤細(xì)胞（圖5F）。LLGA-Gel組的TUNEL染色顯示廣泛的DNA斷裂和細(xì)胞死亡（圖5G）。LLGA-Gel組小鼠的中位生存時(shí)間延長(zhǎng)至103天，對(duì)照組為31天（圖5H）。除對(duì)照組外，治療過(guò)程中小鼠體重?zé)o顯著變化（圖5I）。LLGA-Gel組未觀察到肝腎功能指標(biāo)差異和主要器官嚴(yán)重?fù)p傷。

圖4（A）實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)示意圖；（B）腫瘤接種后第12天手術(shù)切除，黃色圓圈表示顱內(nèi)骨窗定位點(diǎn)；（C）手術(shù)后各組小鼠膠質(zhì)瘤生物發(fā)光信號(hào)強(qiáng)度量化（n=3）；（D）不同治療方法手術(shù)后膠質(zhì)瘤小鼠的代表性生物發(fā)光圖像（n=3）；（E）不同水凝膠治療后小鼠的T?加權(quán)磁共振成像（T? W-MRI）圖像，黃色圓圈指向腫瘤組織；（F，G）手術(shù)后33天各組小鼠腦組織切片的H&E和TUNEL染色；（H）不同治療方法手術(shù)后膠質(zhì)瘤小鼠的生存曲線（n=8）；（I）手術(shù)后各組小鼠體重評(píng)估（n=8）

（5）LLGA-Gel在體內(nèi)誘導(dǎo)抗腫瘤免疫反應(yīng)的療效

脾臟中CD4+和CD8+ T細(xì)胞顯著增加（圖6A、C），F(xiàn)oxp3+/CD4+ Treg細(xì)胞減少（圖6B、D）。在LLGA-Gel處理的腫瘤組織中，CD8細(xì)胞毒性T細(xì)胞和CD4 T細(xì)胞浸潤(rùn)顯著增加（圖6E），F(xiàn)oxp3 Treg細(xì)胞減少（圖6F）。LLGA-Gel治療后，腫瘤組織中M1型巨噬細(xì)胞顯著增加（圖6G、J），M2型巨噬細(xì)胞減少（圖6K），成熟DCs標(biāo)志物CD80和CD86在總DCs中的表達(dá)增強(qiáng)（圖6G）。此外，LLGA-Gel治療顯著降低了IL-10和IL-12水平，同時(shí)增加了IFN-γ和TNF-α水平（圖6I）。

圖5（A）術(shù)后小鼠脾臟組織中CD3?CD8?和CD3?CD4? T細(xì)胞百分比的代表性流式細(xì)胞術(shù)分析（n=3）；（B）術(shù)后小鼠脾臟組織中CD3?CD4?Foxp3? T細(xì)胞百分比的流式細(xì)胞術(shù)分析（n=3）；（C）各組小鼠術(shù)后脾臟組織中CD3?CD8? T細(xì)胞比例（n=3）；（D）各組小鼠脾臟組織中CD3?CD4?Foxp3? Tregs數(shù)量定量分析（n=3）；（E，F(xiàn)）腫瘤中CD8? T細(xì)胞（E）和Foxp3? Tregs（F）浸潤(rùn)的免疫熒光檢測(cè)；（G，H）不同藥物治療后腫瘤組織中成熟樹(shù)突狀細(xì)胞百分比的流式細(xì)胞術(shù)分析（G）和定量分析（H，n=3）；（I）不同治療后腫瘤組織中IL-10、IL-12、IFN-γ和TNF-α的標(biāo)準(zhǔn)化相對(duì)表達(dá)水平熱圖；（J，K）不同治療組腫瘤組織中巨噬細(xì)胞M2（J）和M1（K）的免疫熒光圖像