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針對(duì)上述問(wèn)題，重慶醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院宋錦璘、胡赟團(tuán)隊(duì)開(kāi)發(fā)一種基于微針（microneedles, MNs）的藥物遞送平臺(tái)（MSN-LA@MNs），搭載一氧化氮（NO）驅(qū)動(dòng)的納米馬達(dá)，用于L-精氨酸的精準(zhǔn)靶向遞送。該系統(tǒng)巧妙地利用了機(jī)械力作用下的巨噬細(xì)胞和組織中iNOS表達(dá)上調(diào)這一天然優(yōu)勢(shì)，通過(guò) iNOS 催化L-精氨酸生成 NO，為納米顆粒提供自主推進(jìn)力。此外，微針的透皮給藥技術(shù)還具有操作簡(jiǎn)便、無(wú)痛、微創(chuàng)等優(yōu)勢(shì)。在力誘導(dǎo)的大鼠OTM模型中，證實(shí)MSN-LA@MNs能增強(qiáng)巨噬細(xì)胞胞葬作用，并在iNOS的引導(dǎo)下動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)無(wú)菌性炎癥水平，從而促進(jìn)OTM進(jìn)程，為調(diào)控OTM等力學(xué)生物學(xué)過(guò)程提供了納米馬達(dá)介導(dǎo)的代謝靶向策略。該文章于2025年3月3日以《Microneedles Loaded with Nitric-Oxide Driven Nanomotors Improve Force-Induced Efferocytosis Impairment and Sterile Inflammation by Revitalizing Macrophage Energy Metabolism》為題發(fā)表于《ACS NANO》（DOI：10.1021/acsnano.5c01877。

研究示意圖.（a）加載有一氧化氮驅(qū)動(dòng)的納米馬達(dá)的微針的基本設(shè)計(jì)的示意圖。（b）機(jī)械力通過(guò)精氨酸代謝、TCA循環(huán)和線粒體功能的代謝級(jí)聯(lián)損傷破壞巨噬細(xì)胞胞吐作用并引發(fā)無(wú)菌炎癥的機(jī)制。（c）MSN-LA@ MN在OTM中的應(yīng)用和藥物遞送機(jī)制。（d）MSN-LA@MNs如何通過(guò)恢復(fù)巨噬細(xì)胞能量代謝從而促進(jìn)OTM來(lái)改善力誘導(dǎo)的胞吐功能受損和無(wú)菌性炎癥

（1）機(jī)械力損害巨噬細(xì)胞胞葬作用并激活無(wú)菌性炎癥

研究人員對(duì)RNA-seq數(shù)據(jù)集GSE210827進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)加載組有265個(gè)基因下調(diào)、374個(gè)上調(diào)（圖1b），且凋亡和炎癥免疫通路顯著激活（圖1c）。大鼠OTM模型中，機(jī)械力加載的牙周組織TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞增多，與CD68陽(yáng)性細(xì)胞共定位減少（圖1e），且IL-1β陽(yáng)性表達(dá)升高（圖1f）。體外細(xì)胞壓縮力加載模型顯示，機(jī)械力抑制巨噬細(xì)胞胞葬作用（圖1h,i），且促炎細(xì)胞因子顯著上調(diào)，胞葬作用增強(qiáng)劑可逆轉(zhuǎn)這一現(xiàn)象（圖1j,k）。這些結(jié)果表明，機(jī)械力可能通過(guò)破壞巨噬細(xì)胞胞葬作用增強(qiáng)炎癥反應(yīng)。

圖1 機(jī)械力損傷巨噬細(xì)胞胞葬作用并激活無(wú)菌性炎癥。（a）小鼠脛骨施加壓縮力的示意圖；（b）火山圖展示GSE210827數(shù)據(jù)集中的基因表達(dá)譜；（c）前25條基因本體（GO）富集分析通路；（d）大鼠正畸牙齒移動(dòng)（OTM）模型構(gòu)建示意圖；（e）大鼠牙周組織的TUNEL和CD68雙重?zé)晒馊旧ū壤?50μm）；（f）大鼠牙周組織中IL-1β的免疫組化染色（DE：牙本質(zhì)，PDL：牙周韌帶，AB：牙槽骨，比例尺=50μm）；（g）力學(xué)模型和胞葬作用模型示意圖；（h）熒光圖像顯示巨噬細(xì)胞胞葬作用（橙色熒光表示用DAPI標(biāo)記的凋亡細(xì)胞，綠色熒光表示用CellMask標(biāo)記的巨噬細(xì)胞膜，比例尺=10μm）；（i）流式細(xì)胞術(shù)分析和定量描述巨噬細(xì)胞胞葬作用（n=3，凋亡細(xì)胞用Calcein AM標(biāo)記，巨噬細(xì)胞用DiD標(biāo)記）；（j）qPCR分析炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α（n=3，VU533是一種特異性胞葬作用增強(qiáng)劑）；（k）ELISA分析炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α（n=3）

（2）機(jī)械力擾亂巨噬細(xì)胞精氨酸代謝并引發(fā)限制TCA循環(huán)的級(jí)聯(lián)反應(yīng)

生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，加載肢體骨樣本中葡萄糖、氨基酸和細(xì)胞呼吸等代謝通路顯著富集（圖1c），且與凋亡和炎癥免疫通路密切相關(guān)，其中一氧化氮生物合成過(guò)程關(guān)聯(lián)最為顯著，由精氨酸代謝調(diào)控（圖2a）。Q300代謝組學(xué)分析顯示，機(jī)械力誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞中88種代謝物顯著變化，精氨酸和脯氨酸代謝以及TCA循環(huán)通路顯著富集（圖2b）。差異代謝物熱圖分析支持這一發(fā)現(xiàn)（圖2c,d），精氨酸代謝通路中精氨酸和天冬氨酸減少，瓜氨酸上調(diào)，鳥(niǎo)氨酸和脯氨酸變化不明顯（圖2e），TCA循環(huán)相關(guān)代謝物表達(dá)受抑制（圖2f）。機(jī)械力下調(diào)Arg1、上調(diào)iNOS，增加NO釋放，同時(shí)下調(diào)ASS1和ASL（圖2g-i），導(dǎo)致精氨酸耗竭（圖2j）。圖2k總結(jié)發(fā)現(xiàn)，精氨酸代謝與TCA循環(huán)存在交叉點(diǎn)，機(jī)械力抑制精氨酸生物合成導(dǎo)致富馬酸減少，引發(fā)限制TCA循環(huán)的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，最終導(dǎo)致巨噬細(xì)胞能量代謝異常。

圖2 機(jī)械力擾亂巨噬細(xì)胞中的精氨酸代謝并限制三羧酸循環(huán)（TCA循環(huán)）。（a）基于GSE210827數(shù)據(jù)集的富集通路相互作用網(wǎng)絡(luò)分析；（b）基于代謝組學(xué)測(cè)試的hsa數(shù)據(jù)庫(kù)的通路分析氣泡圖；（c，d）與精氨酸和脯氨酸代謝以及能量代謝相關(guān)的差異代謝物的熱圖；（e，f）精氨酸代謝和TCA循環(huán)相關(guān)代謝物的絕對(duì)定量分析（n=5）；（g-j）qPCR和Western blot分析關(guān)鍵酶iNOS和Arg1（介導(dǎo)精氨酸消耗）、ASS1和ASL（介導(dǎo)精氨酸合成）；（k）機(jī)械力誘導(dǎo)精氨酸代謝紊亂并限制TCA循環(huán)的機(jī)制示意圖

（3）L-精氨酸通過(guò)恢復(fù)巨噬細(xì)胞能量代謝改善機(jī)械力誘導(dǎo)的胞葬功能障礙和無(wú)菌性炎癥

研究人員通過(guò)補(bǔ)充L-精氨酸來(lái)恢復(fù)機(jī)械力作用下巨噬細(xì)胞的精氨酸儲(chǔ)備（圖3a）。透射電鏡觀察顯示，機(jī)械力使巨噬細(xì)胞線粒體萎縮變形，而L-精氨酸可部分恢復(fù)其形態(tài)（圖3b）。機(jī)械力作用下，巨噬細(xì)胞內(nèi)總ROS和線粒體ROS水平顯著增加，線粒體膜電位去極化，而L-精氨酸可部分緩解這些現(xiàn)象（圖3c-e）。機(jī)械力作用下巨噬細(xì)胞ATP水平降低，NAD+/NADH表達(dá)下調(diào)，氧含量降低，而L-精氨酸可逆轉(zhuǎn)這些缺陷（圖3f-h）。共聚焦熒光顯微鏡和流式細(xì)胞術(shù)分析顯示，L-精氨酸可減輕機(jī)械力對(duì)胞葬作用的負(fù)面影響（圖3i,j），且顯著改善炎癥因子的釋放水平（圖3k）。這些結(jié)果表明，恢復(fù)巨噬細(xì)胞內(nèi)精氨酸代謝平衡可緩解機(jī)械力引發(fā)的能量危機(jī)，促進(jìn)無(wú)菌性炎癥消退。

圖3 L-精氨酸通過(guò)恢復(fù)巨噬細(xì)胞能量代謝改善機(jī)械力誘導(dǎo)的胞葬作用障礙和無(wú)菌性炎癥。（a）控制組、力組和力+L-精氨酸組巨噬細(xì)胞中精氨酸水平的分析；（b）透射電子顯微鏡圖像顯示巨噬細(xì)胞線粒體的形態(tài)（比例尺=400 nm）；（c）巨噬細(xì)胞中活性氧（ROS）水平的分析（DCFH-DA的綠色熒光強(qiáng)度代表細(xì)胞內(nèi)總ROS水平，Mito-SOX的紅色熒光強(qiáng)度代表線粒體ROS水平，比例尺=40μm）；（d，e）線粒體膜電位的分析（JC-1染色的紅綠熒光強(qiáng)度比和TMRM陽(yáng)性細(xì)胞比例反映線粒體膜電位的高低，比例尺=40μm）；（f）巨噬細(xì)胞內(nèi)ATP水平的分析；（g）巨噬細(xì)胞內(nèi)NAD?和NADH水平的分析；（h）巨噬細(xì)胞內(nèi)氧含量的分析（Ru(dpp)?Cl?的紅色熒光越強(qiáng)，氧水平越低，比例尺=80μm）；（i，j）熒光圖像和流式細(xì)胞術(shù)分析描述巨噬細(xì)胞胞葬作用（比例尺=10μm）；（k）ELISA分析在凋亡細(xì)胞積累環(huán)境中炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α的水平；（l）機(jī)械力通過(guò)破壞巨噬細(xì)胞能量代謝損傷胞葬作用并激活炎癥的機(jī)制示意圖

（4）MSN-LA@HA微針的合成與表征

研究人員開(kāi)發(fā)了一種結(jié)合藥物釋放納米顆粒和可溶性微針優(yōu)勢(shì)的局部給藥系統(tǒng)，用于機(jī)械力條件下L-精氨酸的高效局部遞送。他們合成了由介孔二氧化硅納米顆粒（MSN）和L-精氨酸組成的MSN-LA納米系統(tǒng)（圖4a），并通過(guò)高分辨透射電鏡圖像（圖4b）、能譜（EDS）分析（圖4b）、尺寸和Zeta電位測(cè)量（圖4c）、BJH法（圖4d）和FTIR結(jié)果（圖4e）證實(shí)了L-精氨酸的成功封裝。此外，研究人員制備了負(fù)載MSN-LA的HA微針（MSN-LA@HA MNs）（圖4f），并通過(guò)掃描電鏡和EDS mapping（圖4h）驗(yàn)證了MSN-LA的成功整合。CCK-8實(shí)驗(yàn)和活-死細(xì)胞染色顯示該微針無(wú)顯著細(xì)胞毒性（圖4i），壓縮測(cè)試表明其具有優(yōu)異的機(jī)械強(qiáng)度（圖4j），且L-精氨酸的釋放動(dòng)力學(xué)顯示其在前12小時(shí)內(nèi)快速釋放約70%的藥物，剩余藥物隨時(shí)間逐漸釋放（圖4k）。

圖4 MSN-LA@HA MNs的合成與表征。（a）MSN-LA合成示意圖；（b）MSN和MSN-LA的透射電子顯微鏡圖像和能量色散光譜（EDS）元素分析；（c）MSN和MSN-LA的粒徑和zeta電位分析；（d）MSN和MSN-LA的孔徑分析；（e）LA、MSN和MSN-LA的傅里葉變換紅外光譜（FTIR）分析；（f）MSN-LA@MNs制備過(guò)程示意圖；（g）HA MNs和MSN-LA@HA MNs的立體顯微鏡圖像；（h）HA MNs和MSN-LA@HA MNs的掃描電子顯微鏡圖像和EDS元素分析；（i）巨噬細(xì)胞與HA、MSN@HA和MSN-LA@HA共培養(yǎng)的CCK-8活性分析；（j）HA MNs和MSN-LA@HA MNs的機(jī)械強(qiáng)度分析；（k）MSN-LA@HA MNs的體外釋放動(dòng)力學(xué)

（5）MSN-LA納米馬達(dá)的運(yùn)動(dòng)能力和趨化特性評(píng)估

研究人員通過(guò)定量分析發(fā)現(xiàn)，在機(jī)械力作用巨噬細(xì)胞環(huán)境中，MSN-LA表現(xiàn)出顯著增強(qiáng)擴(kuò)散特征，其MSD曲線呈拋物線形，運(yùn)動(dòng)速度顯著高于MSN（圖5b-e），表明其作為納米馬達(dá)的自主運(yùn)動(dòng)能力。Y型通道實(shí)驗(yàn)顯示，MSN-LA納米馬達(dá)在機(jī)械力作用巨噬細(xì)胞環(huán)境中逐漸累積（圖5f-h）。Transwell實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了MSN-LA對(duì)iNOS的趨化響應(yīng)，且iNOS抑制劑預(yù)處理可降低其趨化能力（圖5i-j）。共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，MSN-LA比MSN具有更強(qiáng)的巨噬細(xì)胞內(nèi)化能力（圖5k）、溶酶體逃逸能力（圖5l）和線粒體共定位程度（圖5m），這有利于其在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮代謝調(diào)控功能。

圖5 MSN-LA納米馬達(dá)的運(yùn)動(dòng)性和趨化特性評(píng)估。（a）不同樣品與力載巨噬細(xì)胞共孵育時(shí)的NO產(chǎn)生；（b，c）MSN（b）和MSN-LA（c）在力載巨噬細(xì)胞環(huán)境中的歸一化運(yùn)動(dòng)軌跡；（d）基于運(yùn)動(dòng)軌跡的均方位移（MSD）擬合分析；（e）MSN和MSN-LA在力載巨噬細(xì)胞環(huán)境中的速度；（f）Y形通道示意圖，其中（i）為含有羅丹明B標(biāo)記的MSN-LA的儲(chǔ)液池，（ii）為含有巨噬細(xì)胞裂解液的瓊脂糖凝膠儲(chǔ)液池，（iii）為含有力載巨噬細(xì)胞裂解液的瓊脂糖凝膠儲(chǔ)液池；（g，h）Y形通道中MSN-LA的熒光圖像（g）和相應(yīng)的熒光定量結(jié)果（h）；（i）Transwell模型用于垂直趨化實(shí)驗(yàn)的示意圖；（j）高細(xì)胞密度腔室的熒光強(qiáng)度曲線；（k）細(xì)胞攝取納米顆粒的共聚焦激光掃描顯微鏡圖像（紅色：納米顆粒）；（l）納米顆粒與溶酶體共定位的共聚焦激光掃描顯微鏡圖像及Pearson相關(guān)系數(shù)分析（紅色：納米顆粒，綠色：溶酶體）；（m）納米顆粒與線粒體共定位的共聚焦激光掃描顯微鏡圖像及Pearson相關(guān)系數(shù)分析（紅色：納米顆粒，綠色：線粒體）

（6）MSN-LA@MNs增強(qiáng)OTM中的巨噬細(xì)胞胞葬作用并促進(jìn)牙齒移動(dòng)

研究人員在大鼠OTM過(guò)程中分別給予MSN-LA@MNs和MSN@MNs（圖6a，b）。Micro-CT成像和分析顯示，MSN-LA@MNs顯著增加了OTM距離，而MSN@MNs無(wú)此效果（圖6c-d）。H&E染色顯示兩組均未出現(xiàn)牙根吸收，壓力側(cè)可見(jiàn)骨吸收陷窩（圖6e）。TUNEL和CD68雙熒光染色結(jié)果顯示，機(jī)械力作用下TUNEL+凋亡細(xì)胞從第1天到第7天逐漸增加，而MSN-LA@MNs顯著降低了第3天和第7天的凋亡細(xì)胞數(shù)量（圖6f-g）。此外，MSN-LA@MNs在第3天和第7天顯著提高了Mφ-associated ACs與total ACs的比值（圖6h），表明巨噬細(xì)胞胞葬作用增強(qiáng)。

圖6 MSN-LA@MNs增強(qiáng)正畸牙齒移動(dòng)中的巨噬細(xì)胞胞葬作用并促進(jìn)牙齒移動(dòng)。（a，b）在大鼠正畸牙齒移動(dòng)模型中應(yīng)用微針的示意圖（a）和實(shí)際應(yīng)用（b，比例尺=2000μm）；（c）第7天大鼠上頜骨的重建微CT圖像（比例尺=1000μm）；（d）第7天牙齒移動(dòng)距離的分析（n=6）；（e）第一磨牙壓力側(cè)組織的蘇木精-伊紅（H&E）染色圖像（黑色箭頭：骨吸收陷窩，DE：牙本質(zhì)，PDL：牙周韌帶，AB：牙槽骨，比例尺=200μm）；（f）第1、3和7天大鼠第一磨牙壓力側(cè)的TUNEL和CD68雙重?zé)晒馊旧ū壤?50μm）；（g）TUNEL陽(yáng)性凋亡細(xì)胞的半定量熒光分析（n=5）；（h）TUNEL和CD68雙陽(yáng)性細(xì)胞的分析，表征巨噬細(xì)胞胞葬作用（n=5）

（7）MSN-LA@MNs在iNOS趨化引導(dǎo)下時(shí)序調(diào)節(jié)OTM中的無(wú)菌性炎癥

研究人員分析了MSN-LA@MNs對(duì)大鼠OTM模型中無(wú)菌性炎癥的調(diào)控作用。免疫組化染色和半定量分析顯示，MSN-LA@MNs組在OTM初期（第1天）顯著升高IL-1β水平，第3天維持較高表達(dá)，而在第7天較機(jī)械力組明顯降低（圖7a，c）。CD68和iNOS雙熒光染色及半定量分析顯示，CD68和iNOS雙陽(yáng)性表達(dá)趨勢(shì)與IL-1β相似（圖7b，d）。這些結(jié)果表明，MSN-LA@MNs在OTM初期短暫升高炎癥水平，隨后在線性期更徹底地消退炎癥，促進(jìn)組織修復(fù)。圖7e展示了MSN-LA@MNs對(duì)OTM無(wú)菌性炎癥的時(shí)序調(diào)控作用。

圖7 MSN-LA@MNs在iNOS的趨化引導(dǎo)下以時(shí)間順序調(diào)節(jié)正畸牙齒移動(dòng)中的無(wú)菌性炎癥。（a）大鼠牙周組織中IL-1β的免疫組化染色（DE：牙本質(zhì)，PDL：牙周韌帶，AB：牙槽骨，比例尺=50μm）；（b）第1、3和7天大鼠第一磨牙壓力側(cè)的iNOS和CD68雙重?zé)晒馊旧ū壤?50μm）；（c）IL-1β陽(yáng)性區(qū)域百分比的半定量分析（n=6）；（d）iNOS和CD68雙陽(yáng)性細(xì)胞的熒光半定量分析（n=5，與力組作為對(duì)照進(jìn)行統(tǒng)計(jì)比較）；（e）MSN-LA@MNs在iNOS的趨化引導(dǎo)下以時(shí)間順序調(diào)節(jié)正畸牙齒移動(dòng)中無(wú)菌性炎癥的示意圖