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針對(duì)上述問(wèn)題，四川大學(xué)張仕勇團(tuán)隊(duì)開(kāi)發(fā)了一種可注射的硫辛酸鐵（LA-Fe）水凝膠（LFH），能夠通過(guò)配位 Fe3?適應(yīng)不同腦組織（包括人腦組織）的機(jī)械強(qiáng)度，轉(zhuǎn)化為 LA 及其鈉鹽（LANa）的雜化水凝膠。當(dāng)將與小鼠腦組織機(jī)械性能相匹配的 LFH（337 ± 8.06 Pa）注入腦切除腔時(shí)，腦組織含水量維持在正常水平（77%），且不會(huì)誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化或增生，有效預(yù)防腦水腫和瘢痕增生。此外，LFH 在間質(zhì)液中自發(fā)降解，釋放 LA 和 Fe3?進(jìn)入腫瘤細(xì)胞。其中，氧化還原偶聯(lián)的 LA/DHLA（細(xì)胞中 LA 的還原形式）和 Fe3?/Fe2?可相互再生，持續(xù)提供 ROS 以誘導(dǎo)鐵死亡并激活免疫原性細(xì)胞死亡。進(jìn)一步加載抗 PDL1 后，抗 PDL1@LFH 顯著增強(qiáng)了腫瘤免疫治療效果并促進(jìn)了腫瘤鐵死亡。這種適應(yīng)組織機(jī)械強(qiáng)度的可注射水凝膠為腫瘤術(shù)后治療帶來(lái)了新的希望。該文章于2024年9月以《An injectable biomimetic hydrogel adapting brain tissue mechanical strength for postoperative treatment of glioblastoma without anti-tumor drugs participation》為題發(fā)表于《Journal of Controlled Release》（DOI： 10.1016/j.jconrel.2024.07.068）。

圖1 通過(guò)配位 Fe 開(kāi)發(fā)了第一個(gè)可以適應(yīng)包括人腦在內(nèi)的不同腦組織的機(jī)械強(qiáng)度的可注射水凝膠

（1）LHF 的合成和表征

將 LA/LANa 水分散液加熱至 90℃保持 15 min 后加入 FeCl?，合成 LFH（圖 1a）。SEM 表征顯示 LFH 具有典型的凝膠互穿多孔結(jié)構(gòu)（圖 1b）。通過(guò)顯色反應(yīng)證實(shí)了水凝膠中 Fe3?的配位。宏觀(guān)實(shí)驗(yàn)表明 LFH 可通過(guò) 25G 注射器注射并形成連續(xù)字母（圖 1c）。流變恢復(fù)試驗(yàn)顯示，在高剪切應(yīng)力下，LFH 的 G'（儲(chǔ)能模量）與 G''（損耗模量）交點(diǎn)為 476，且隨著振幅應(yīng)變?cè)黾?，G'顯著降低并低于 G''，表明 LFH 從凝膠轉(zhuǎn)變?yōu)槿苣z，具有可注射性（圖 1d）。循環(huán)測(cè)試（n=3）觀(guān)察到 LFH 具有剪切變稀和立即恢復(fù)行為，進(jìn)一步證明其穩(wěn)定注射性（圖 1e）。此外，LFH 在施加外部機(jī)械力后仍可重塑并形成完整模具形狀，表現(xiàn)出良好的自修復(fù)特性（圖 1f）。LFH 的可注射性和自修復(fù)性源于其羧基（COO?）與 Fe3?形成的可逆金屬配位相互作用，外力作用下該配位消散使 LFH 可注射，外力消除后配位重新生成賦予其自修復(fù)性。通過(guò)紫外-可見(jiàn)光吸收和 ICP-AES 檢測(cè) LFH 萃取液，評(píng)估其降解和釋放行為。如圖 1g 所示，LFH 降解緩慢，24 天后仍有 28% 的殘留。在 24 天內(nèi)，LA/LANa 和 Fe3?的釋放率分別為 89.23%±4.37% 和 75.23%±10.41%（圖 1h）。

圖2 LFH的合成與表征。（a）LFH合成示意圖；（b）LFH的掃描電子顯微鏡（SEM）圖像；（c）LFH的宏觀(guān)注射性；（d）LFH的動(dòng)態(tài)應(yīng)變掃描（以1 Hz的頻率評(píng)估測(cè)量結(jié)果）；（e）LFH的循環(huán)掃描（LFH在1 Hz下以1%的峰值應(yīng)變振蕩加載3分鐘，然后以1000%的峰值應(yīng)變?cè)? Hz下振蕩3分鐘）；（f）LFH的自愈特性；（g）LFH的體外降解；（h）LA/LANa和Fe3?從LFH中的體外釋放

（2）LFH的機(jī)械強(qiáng)度和異物反應(yīng)（FBR）評(píng)估

硫辛酸具有獨(dú)特的熱開(kāi)環(huán)聚合特性，可自交聯(lián)并暴露出多個(gè)羧基。這些羧基不僅能與 Fe3?動(dòng)態(tài)螯合賦予水凝膠可注射性，還能通過(guò)調(diào)節(jié) Fe3?螯合量控制水凝膠的機(jī)械強(qiáng)度。當(dāng) LA/LANa 混合物以 1：3 的比例與 1% 或 1.5% Fe3?混合時(shí)，可獲得與小鼠和大鼠腦組織彈性模量相近的 LFHs（圖 2a、b）。而將 1：3.5 的 LA/LANa 混合物與 2% Fe3?混合時(shí)，可制備出與人腦組織彈性模量相似的 LFH（圖 2c）。

為探究腦植入物與腦組織的匹配性對(duì) FBR 的影響，將不同彈性模量的 LFH 植入小鼠腦腔，檢測(cè)腦水腫和瘢痕增生程度，評(píng)估腦內(nèi) LFH 的 FBR。實(shí)驗(yàn)中，以彈性模量為 337 ± 8.06 Pa 的 LFH2 為實(shí)驗(yàn)組，以超軟（14 ± 0.41 Pa）和超硬（5322 ± 64.06 Pa）的 LFH1 和 LFH3 為對(duì)照組。植入時(shí)，LFH2 能完美貼合術(shù)后腔，而 LFH1 和 LFH3 分別出現(xiàn)溢流腔和未填充腔（圖 2d）。植入 7 天和 24 天后，LFH2 組腦組織未見(jiàn)明顯損傷，成功與腦組織整合（圖 2d，視頻 2），而 LFH1 和 LFH3 組小鼠腦組織均出現(xiàn)明顯發(fā)紅和出血（圖 2d）。

腦水腫通過(guò)濕/干組織重量測(cè)量評(píng)估（圖 2e）。結(jié)果顯示，LFH2 組小鼠大腦含水量低至 77%，與健康小鼠相當(dāng)，表明 LFH2 植入未引發(fā)腦水腫（圖 2f）。而 LFH1 和 LFH3 植入后，小鼠腦組織含水量分別顯著增加至 80% 和 82%（圖 2f）。

免疫熒光染色顯示，植入后 7 天和 24 天，LFH2 組腦組織中未見(jiàn)明顯綠色（GFAP）或紅色（Iba-1）熒光（圖 2g），表明星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞未被激活。而 LFH1 和 LFH3 組中則有強(qiáng)烈熒光，說(shuō)明其植入導(dǎo)致星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞激活（圖 2g）。免疫組化染色進(jìn)一步證實(shí) LFH1 和 LFH3 組瘢痕增生。植入 7 天后，LFH1 和 LFH3 組活性星形膠質(zhì)細(xì)胞密度顯著增加并聚集在水凝膠周?chē)琇FH3 周?chē)Ｋ澜M織甚至轉(zhuǎn)化為中央瘢痕腔（圖 2h）。植入 24 天后，LFH1 和 LFH3 組小鼠腦組織形成厚度 >100 μm 的明顯瘢痕組織（圖 2h，i）。相比之下，LFH2 組植入后周?chē)鸁o(wú)明顯活化星形膠質(zhì)細(xì)胞增殖和聚集，疤痕厚度遠(yuǎn)小于 LFH1 組和 LFH3 組（圖 2h，i）。這些數(shù)據(jù)證實(shí)了植入材料與腦組織機(jī)械強(qiáng)度匹配的重要性，匹配度越高，F(xiàn)BR 發(fā)生率越低。

圖3 LFH的FBR評(píng)估。（a）LFH（1% Fe3?）和小鼠腦組織；（b）LFH（1.5% Fe3?）和大鼠腦組織；（c）LFH（2% Fe3?）和文獻(xiàn)報(bào)道的人類(lèi)腦組織；（d）在LFHs植入后第7天和第24天，在小鼠腦組織和解剖的腦組織中植入不同的LFHs；（e）用于腦水腫測(cè)量的濕/干法示意圖；（f）不同組腦水含量百分比的比較（正常：健康且未經(jīng)治療的小鼠腦組織）；（g）LFH（包括LFH1、LFH2和LFH3）植入后7天和24天小鼠腦切片的免疫熒光染色（GFAP，一種星形膠質(zhì)細(xì)胞活化標(biāo)志物，綠色熒光；Iba-1，一種小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物，紅色熒光）；（h）LFH1、LFH2和LFH3植入7天和24天后腦組織切片的免疫組織化學(xué)染色（箭頭指活化的星形膠質(zhì)細(xì)胞積聚和形成梗死腔的地方，水平線(xiàn)表示疤痕的寬度）；（i）植入的LFH周?chē)窠?jīng)膠質(zhì)瘢痕的厚度

（3）LFH的抗腫瘤活性和ICD誘導(dǎo)能力

為評(píng)估 LFH 的治療效果，將小鼠膠質(zhì)瘤細(xì)胞（GL261 細(xì)胞）分別與 Fe3?、LA/LANa 或 LFH 接觸，通過(guò)體外鈣黃綠素-AM（CAM）/碘丙酯熒光（PI）染色檢測(cè)細(xì)胞活力。MTT 實(shí)驗(yàn)顯示，單獨(dú)使用 Fe3?或 LA/LANa 對(duì)細(xì)胞毒性較弱，而 LFH 處理后 GL261 細(xì)胞存活率僅為 12%（圖 3a）。CAM/PI 染色結(jié)果與 MTT 一致，LFH 組紅色熒光顯著增加，表明 LFH 對(duì) GL261 細(xì)胞具有顯著的抗腫瘤作用（圖 3b）。

為探究 LFH 的抗腫瘤機(jī)制，發(fā)現(xiàn) LFH 釋放 LA 和 Fe3?進(jìn)入腫瘤細(xì)胞后，一方面可在 DHLA 和 Fe3?作用下還原為 Fe2?，觸發(fā) Fenton 反應(yīng)誘導(dǎo)鐵死亡。通過(guò)不同細(xì)胞死亡抑制劑處理 LFH 處理后的 GL261 細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)鐵死亡抑制劑（去鐵胺、維生素 E 和鐵司他汀-1）顯著提高細(xì)胞活力，而壞死抑制劑、自噬抑制劑和凋亡抑制劑效果不明顯（圖 3c），證實(shí)鐵死亡是 LFH 處理 GL261 細(xì)胞的主要死亡方式。進(jìn)一步檢測(cè)谷胱甘肽（GSH）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶 4（GPX4）和脂質(zhì)過(guò)氧化物（MDA）水平，發(fā)現(xiàn) LFH 降低 GSH 表達(dá)、抑制 GPX4 活性并增加 MDA 水平，這些變化可被鐵死亡抑制劑逆轉(zhuǎn)（圖 3d）。

另一方面，LFH 中的 LA/DHLA 和 Fe3?/Fe2?氧化還原對(duì)可擴(kuò)增癌細(xì)胞中的氧化應(yīng)激。通過(guò) DCFH-DA 探針檢測(cè)細(xì)胞內(nèi) ROS 水平，LFH 處理的 GL261 細(xì)胞 ROS 水平顯著高于 Fe3?和 LA/LANa 組，達(dá)到 1587%，是 Fe3?組的 2.8 倍和 LA/LANa 組的 2 倍（圖 3e、f），證實(shí) LFH 能顯著增強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激。

此外，LFH 還能誘導(dǎo)免疫原性細(xì)胞死亡（ICD）。檢測(cè) ICD 標(biāo)志物（CRT、HMGB1 和 ATP）發(fā)現(xiàn)，LFH 處理的腫瘤細(xì)胞 ATP 分泌量是對(duì)照組的 25 倍（圖 3g），HMGB1 完全遷移出細(xì)胞核（圖 3h），且 CLSM 圖像顯示 CRT 在細(xì)胞膜上顯著暴露（圖 3i）。這些結(jié)果表明 LFH 具有誘導(dǎo) ICD 的能力。

圖4 LFH的抗腫瘤活性和機(jī)制。（a）GL261細(xì)胞與LFH共孵育0、6、12、18、24、36和48小時(shí)后的細(xì)胞活力；（b）GL261細(xì)胞與FeCl?、LA/LANa和LFH共孵育12小時(shí)后活/死細(xì)胞的熒光圖像（CAM，綠色；PI，紅色）；（c）GL261細(xì)胞與LFH和不同抑制劑共孵育后的細(xì)胞活力測(cè)定；（d）GL261細(xì)胞與FeCl?、LA/LANa、LFH和LFH+DFO共孵育6小時(shí)后鐵死亡相關(guān)標(biāo)志物（GSH、GPX4和脂質(zhì)過(guò)氧化物）的檢測(cè)；（e，f）GL261細(xì)胞與FeCl?、LA/LANa和LFH共孵育3、6小時(shí)后，用DCFH-DA染色的相對(duì)ROS生成（e）和熒光圖像（f）；（g）GL261細(xì)胞與FeCl?共孵育后的ATP分泌；（h）共聚焦激光掃描顯微鏡（CLSM）圖像顯示GL261細(xì)胞與FeCl?共孵育后的HMGB1釋放；（i）CLSM圖像顯示GL261細(xì)胞與FeCl?共孵育后CRT的表面易位

（4）LFH的體內(nèi)抗癌評(píng)價(jià)

免疫激活可清除腫瘤并增強(qiáng)鐵死亡，LA/DHLA 和 Fe3?/Fe2?可再生并提供 ROS 誘導(dǎo)鐵死亡和免疫原性細(xì)胞死亡。PDL1 在 GBM 微環(huán)境中高表達(dá)導(dǎo)致免疫抑制，因此構(gòu)建了 aPDL1@LFH 以增強(qiáng) T 細(xì)胞活性和腫瘤鐵死亡，緩解免疫抑制并提升治療效果。在 C57BL/6 小鼠右腦建立原位 GBM 不完全切除模型（圖 4a），術(shù)后小鼠分為 LFH 和 aPDL1@LFH 組處理，未治療組為對(duì)照。治療 24 天，生物發(fā)光成像顯示各組小鼠大腦熒光信號(hào)術(shù)后顯著減弱，表明模型成功建立（圖 4b）。隨著處理時(shí)間延長(zhǎng)，LFH 和 aPDL1@LFH 組熒光強(qiáng)度顯著低于對(duì)照組，24 天后分別為對(duì)照組的 7.5% 和 0.012%（圖 4c）。LFH 組和 aPDL1@LFH 組小鼠存活率更高，中位生存時(shí)間分別為 27 天和 38 天（圖 4d）。治療后，H&E 染色和 TUNEL 測(cè)定顯示 LFH 和 aPDL1@LFH 組腫瘤體積顯著小于對(duì)照組，且顯著誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡和壞死（圖 4e、f）。

圖5 LFH的體內(nèi)抗腫瘤效率。（a）實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)示意圖，顯示接種后第12天攜帶Luci?GL261的小鼠進(jìn)行腫瘤切除和LFH腔內(nèi)植入；（b，c）體內(nèi)生物發(fā)光圖像（b）和量化信號(hào)強(qiáng)度（c）；（d）不同治療的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（GBM）切除模型小鼠的生存分析；（e）治療24天后不同組小鼠腦部的蘇木精-伊紅（H&E）切片（復(fù)發(fā)性腫瘤以虛線(xiàn)框表示）；（f）各組的TUNEL染色（DAPI，藍(lán)色；TUNEL，綠色）

治療 24 天后，收集各組腦組織，流式細(xì)胞術(shù)評(píng)估腦 DC 細(xì)胞成熟、T 細(xì)胞活化和 Treg 細(xì)胞表達(dá)（圖 5a）。LFH 和 aPDL1@LFH 組活動(dòng) DC 頻率顯著高于對(duì)照組，分別為對(duì)照組的 1.47 倍和 2.85 倍，且 aPDL1@LFH 組高于 LFH 組（圖 5b、c）。LFH 處理后，CD4? T 細(xì)胞和 CD8? T 細(xì)胞數(shù)量分別增加 3.45 倍和 3.53 倍（圖 5d-g），而 aPDL1@LFH 組 CD4? T 細(xì)胞和 CD8? T 細(xì)胞數(shù)量分別是對(duì)照組的 5.01 倍和 5.57 倍（圖 5d-g）。aPDL1@LFH 組 CD3?CD4?Foxp3? Treg 細(xì)胞數(shù)量顯著減少至 7.73±0.45%（圖 5h，i）。ELISA 檢測(cè)顯示，LFH 和 aPDL1@LFH 組小鼠血清中 IL-2 和 TNF-α 水平顯著高于對(duì)照組（圖 5j、k）。

圖6 LFH的體內(nèi)免疫反應(yīng)。（a）顯示腫瘤提取過(guò)程和流式細(xì)胞術(shù)分析的示意圖；（b，c）流式細(xì)胞術(shù)分析（b）和每種制劑中腦組織中樹(shù)突狀細(xì)胞（DC）的成熟速率（c）；（d）在手術(shù)切除和給藥后24天從攜帶膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（GBM）的小鼠中收獲并通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)分析不同制劑的CD3?CD4? T細(xì)胞；（e）CD3?CD4? T細(xì)胞的定量分析；（f）治療24天后攜帶GBM的小鼠大腦的CD3?CD8?細(xì)胞毒性T細(xì)胞的流式細(xì)胞術(shù)分析；（g）CD3?CD8?細(xì)胞毒性T細(xì)胞的定量分析；（h，i）根據(jù)流式細(xì)胞術(shù)（h）和定量分析（i）每組腦組織中CD3?CD4?Foxp3?調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Tregs）的種群；（j，k）LFH和aPDL1@LFH處理后腫瘤壞死因子（TNF-α，j）和白細(xì)胞介素-2（IL-2，k）的表達(dá)

aPDL1 負(fù)載提高了 LFH 對(duì) GBM 的治療效果，其協(xié)同作用源于解除免疫抑制和增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞鐵死亡。體外實(shí)驗(yàn)中，LFH 聯(lián)合 IFN-γ 處理使 GL261 細(xì)胞存活率顯著降低，比 LFH 組低 2/3（圖 6a），且熒光顯微鏡下紅色熒光最強(qiáng)（圖 6b）。LFH + IFN-γ 組 GSH 和 GPX4 表達(dá)水平顯著降低，分別為 LFH 組的 48% 和 49%，細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化增強(qiáng)至 LFH 組的 1.4 倍（圖 6c），細(xì)胞內(nèi) ROS 水平高于 LFH 組（圖 6d、e）。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，免疫熒光染色顯示 aPDL1@LFH 處理后小鼠腦部 PD-L1 表達(dá)顯著降低，包括膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞和巨噬細(xì)胞（圖 6h）。aPDL1@LFH 處理后，小鼠腦組織中 IFN-γ 含量最高（圖 6h），顯著下調(diào) SLC3A2、SLC7A11、GSH 和 Cys 表達(dá)，分別為 LFH 組的 47% 和 70%（圖 6j、k），且 GPX4 表達(dá)降低，脂質(zhì)過(guò)氧化增加（圖 6l，m）。這些結(jié)果表明，aPDL1 負(fù)載增強(qiáng)了 LFH 的免疫激活和鐵死亡誘導(dǎo)能力。

圖7 aPDL1@LFH增強(qiáng)的體外和體內(nèi)抗腫瘤作用機(jī)制。（a）GL261細(xì)胞與IFN-γ、LFH和LFH+IFN-γ共孵育48小時(shí)后的細(xì)胞活力；（b）GL261細(xì)胞與IFN-γ、LFH和LFH+IFN-γ共孵育12小時(shí)后活/死細(xì)胞的熒光圖像；（c）GL261細(xì)胞與IFN-γ、LFH和LFH+IFN-γ共孵育6小時(shí)后鐵死亡相關(guān)標(biāo)志物GSH、GPX4和脂質(zhì)過(guò)氧化物的檢測(cè)；（d，e）GL261細(xì)胞與IFN-γ、LFH和LFH+IFN-γ共孵育6小時(shí)后，用DCFH-DA染色的熒光圖像（d）及相應(yīng)的熒光強(qiáng)度（e）；（f）LFH和aPDL1@LFH植入24天后小鼠腦切片中PDL1的免疫熒光染色；（g）LFH和aPDL1@LFH植入24天后小鼠腦切片中CD68和PDL1的免疫熒光雙染色；（h）LFH和aPDL1@LFH處理后小鼠大腦中IFN-γ的表達(dá)；（i）LFH和aPDL1@LFH植入24天后小鼠腦切片中SLC3A2和SLC7A11的免疫熒光雙染色；（j-m）處理后各組鐵死亡相關(guān)標(biāo)志物Cys（j）、GSH（k）、GPX4（l）和MDA（m）的表達(dá)

（5）LFH的生物相容性

LFH 在體外和體內(nèi)的生物安全性良好。體外實(shí)驗(yàn)中，BV2 細(xì)胞與 LFH 共孵育 72 小時(shí)后，細(xì)胞活力仍超過(guò) 90%（圖 7a）。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，蘇木精-伊紅染色顯示 LFH 植入 24 天后小鼠腦組織中無(wú)大量炎癥細(xì)胞積累，炎癥反應(yīng)低（圖 7b）。血液學(xué)分析顯示，LFH 和 aPDL1@LFH 治療后小鼠血清中的 AST、ALT、ALP、CREA 和 BUN 水平與健康小鼠相當(dāng)，表明水凝膠植入對(duì)肝臟和腎臟無(wú)顯著損害（圖 7c）。

圖8 LFH和aPDL1@LFH的體內(nèi)生物安全性。（a）BV2細(xì)胞與LFH共孵育不同時(shí)間后的細(xì)胞活力；（b）蘇木精和伊紅（H&E）染色，以評(píng)估植入后24天LFH周?chē)M織的炎癥反應(yīng)；（c）LFH和aPDL1@LFH治療小鼠的血液生化分析（健康小鼠作為對(duì)照）