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針對(duì)上述問題，暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院（華僑醫(yī)院）的羅良平教授團(tuán)隊(duì)設(shè)計(jì)了一種可注射的導(dǎo)電水凝膠，該水凝膠響應(yīng)于缺血損傷的弱酸性微環(huán)境，能夠智能釋放二甲雙胍和外泌體，以增強(qiáng)MIRI后的心臟修復(fù)。這種多功能水凝膠具有自我修復(fù)特性，在細(xì)胞水平上，該水凝膠系統(tǒng)表現(xiàn)出顯著的抗氧化、抗凋亡、改善電生理特性、線粒體保護(hù)和血管生成作用，轉(zhuǎn)錄組測(cè)序顯示了PI 3 K/AKT、VEGF，體內(nèi)研究進(jìn)一步證實(shí)，水凝膠治療減少了梗死面積、心臟纖維化和心律失常的發(fā)生率，同時(shí)改善了心室射血分?jǐn)?shù)并促進(jìn)了MIRI后心臟功能的恢復(fù)。為增強(qiáng)心臟修復(fù)和治療MIRI提供了一種有前途的新型治療方法。該文章于2025年2月18日以《Injectable pH Responsive Conductive Hydrogel for Intelligent Delivery of Metformin and Exosomes to Enhance Cardiac Repair after Myocardial Ischemia-Reperfusion Injury》為題發(fā)表于《Advance Science》（DOI：:10.1002/advs.202410590）。

摘要圖 | 研究示意圖

(1) 水凝膠的制備與表征

該研究從骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）中提取外泌體（Exos），并將其與二甲雙胍（Met）、氧化透明質(zhì)酸（OHA）、肼化膠原（Col-CDH）以及多壁碳納米管（MWCNT）共同構(gòu)建可注射水凝膠（圖1a）。TEM圖顯示Exos呈典型雙層膜結(jié)構(gòu)，粒徑集中在125.1 nm（圖1b, 1c），Western blot證實(shí)其表達(dá)CD9、CD63和TSG101（圖1d）。共孵育實(shí)驗(yàn)顯示Exos可被心肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞攝取。材料方面，OHA由高碘酸氧化HA得到，F(xiàn)TIR中1730 cm-1峰證實(shí)了醛基形成。Col-CDH通過NHS/EDC法修飾膠原蛋白，引入肼基，F(xiàn)TIR與1H NMR均證實(shí)修飾成功（圖1e, 1f）。OHA與Col-CDH交聯(lián)形成水凝膠，并通過席夫堿鍵加載藥物與Exos。SEM觀察到凝膠結(jié)構(gòu)多孔且致密（圖1g）。凝膠時(shí)間隨組分濃度升高而縮短，10%濃度條件下約為20秒，適合注射應(yīng)用（圖1h）。藥物釋放實(shí)驗(yàn)表明，該水凝膠在pH 6.8與7.4環(huán)境下均有快速起始釋放，后期趨于穩(wěn)定（圖1i, 1j）。在酸性心肌缺血微環(huán)境中，席夫堿鍵易解離，促進(jìn)Met和Exos智能釋放。Met釋放更快，利于早期抗氧化抗凋亡，Exos持續(xù)釋放，有助于后期血管生成與修復(fù)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，包載Exos的水凝膠在體內(nèi)具有良好的滯留性和穩(wěn)定性，14天后仍可檢測(cè)到生物發(fā)光信號(hào)（圖1k），遠(yuǎn)優(yōu)于裸Exos組。

圖1.（a）骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體提取及水凝膠系統(tǒng)合成的示意圖；（b）MSC-Exos的透射電鏡（TEM）圖像；（c）MSC-Exos的粒徑分布圖；（d）外泌體中CD9、CD63和TSG101蛋白表達(dá)的Western blot圖像；（e）HA、OHA、Col、Col-CDH和OHA/Col-CDH的傅里葉變換紅外光譜（FTIR）；（f）HA、OHA、Col和Col-CDH的氫核磁共振（1H NMR）譜圖；（g）水凝膠的掃描電鏡（SEM）圖像；（h）“試管倒置法”展示的水凝膠成型圖示；（i）水凝膠中二甲雙胍釋放曲線；（j）水凝膠中外泌體釋放曲線；（k）通過生物發(fā)光成像技術(shù)追蹤外泌體在體內(nèi)的分布軌跡

（2）水凝膠的多功能性質(zhì)

圖2a顯示，所有水凝膠在48小時(shí)內(nèi)達(dá)到吸水平衡，MWCNT濃度越高，膨脹率越低。其中，OHA/Col-CDH膨脹率最高，OHA/Col-CDH/MWCNT-0.5最低。適度的膨脹行為有助于其在體內(nèi)封閉空間中的應(yīng)用。圖2b表明，所有水凝膠在含膠原酶的PBS（pH 7.4）中21天內(nèi)可完全降解，有利于藥物和外泌體的持續(xù)釋放。流變性能方面（圖2c–f），水凝膠在低應(yīng)變下結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，當(dāng)應(yīng)變超過臨界點(diǎn)，儲(chǔ)能模量G′低于損耗模量G″，網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)崩解，表現(xiàn)出剪切變稀特性（圖2d），這有利于注射。交替應(yīng)變測(cè)試顯示水凝膠具良好的自愈性能（圖2e）。時(shí)間掃描結(jié)果（圖2f）顯示G′始終大于G″，說明水凝膠可迅速形成穩(wěn)定交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)。導(dǎo)電性方面，MWCNT的引入顯著提高水凝膠導(dǎo)電率（圖2g）。OHA/Col-CDH/MWCNT-0.1與-0.2的導(dǎo)電性（約10?? S/cm）與天然心肌相當(dāng)。電化學(xué)測(cè)試（圖S3）顯示MWCNT增強(qiáng)了紅氧對(duì)峰及電容性，表明其有利于心臟電信號(hào)傳導(dǎo)。圖2h顯示，水凝膠彈性模量隨交聯(lián)密度升高而增強(qiáng)，其中OHA/Col-CDH/MWCNT-0.2的彈性模量（38 kPa）處于天然心?。?1.9–46.2 kPa）范圍內(nèi)。綜合考慮力學(xué)、流變與導(dǎo)電性能，OHA/Col-CDH/MWCNT-0.2被選為后續(xù)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)用水凝膠。

圖2.（a）水凝膠的溶脹曲線.（b）水凝膠的降解曲線. c）水凝膠在不同振蕩應(yīng)變下的儲(chǔ)能模量（G′）和損耗模量（G″）.（d）水凝膠中粘度和剪切速率之間的關(guān)系. （e）水凝膠在經(jīng)受交替應(yīng)變時(shí)的自修復(fù)能力. （f）在時(shí)間上進(jìn)行的流變學(xué)評(píng)估-水凝膠的掃描模式。（g）水凝膠的電導(dǎo)率。（h）水凝膠的彈性模量

（3）水凝膠處理系統(tǒng)的抗凋亡、抗氧化和線粒體保護(hù)作用

圖3a展示了二甲雙胍與MSC外泌體聯(lián)合構(gòu)建的水凝膠在緩解心肌缺血再灌注損傷（MIRI）中的作用機(jī)制。通過構(gòu)建H/R體外模型，評(píng)估了不同處理對(duì)細(xì)胞凋亡與ROS水平的影響。流式細(xì)胞術(shù)與熒光成像結(jié)果（圖3c,d,e,f）顯示，Met+Exo+Gel組可顯著抑制心肌細(xì)胞凋亡，表現(xiàn)為TUNEL陽(yáng)性率降低，Bcl-2上調(diào)、Bax下調(diào)（圖3b）。同時(shí)，該水凝膠還顯著降低ROS水平。DCFH-DA檢測(cè)與共聚焦顯微鏡觀察顯示，Met+Exo+Gel組綠熒光強(qiáng)度最低（圖3g–j），表明ROS生成被顯著抑制。水凝膠通過減少氧化應(yīng)激，有效緩解MIRI過程中的細(xì)胞損傷。線粒體保護(hù)方面，JC-1染色結(jié)果顯示，Met+Exo+Gel組能顯著恢復(fù)H/R誘導(dǎo)的線粒體膜電位喪失（圖3k,l）；TEM圖像亦顯示該組線粒體結(jié)構(gòu)保存良好，腫脹和嵴破壞現(xiàn)象顯著減少（圖3m）。進(jìn)一步的Western blot分析發(fā)現(xiàn)，Met+Exo+Gel顯著激活A(yù)MPK/PGC1α通路，促進(jìn)線粒體生物合成，并上調(diào)融合蛋白MFN2，抑制裂變蛋白DRP1（圖3b），有助于線粒體動(dòng)態(tài)平衡和功能恢復(fù)。值得注意的是，Exo+Gel組也上調(diào)了PGC1α、MFN2和AKT，說明MSC外泌體中含有多種活性成分，具有促進(jìn)細(xì)胞間通訊和增強(qiáng)線粒體修復(fù)的潛力。綜上，Met與Exos協(xié)同構(gòu)建的水凝膠在抑制凋亡、降低氧化應(yīng)激及保護(hù)線粒體方面表現(xiàn)出顯著治療效果，適用于MIRI治療。

圖3.（a）水凝膠系統(tǒng)在抗凋亡、抗氧化及線粒體保護(hù)機(jī)制方面的示意圖；（b）各組中Bcl-2、Bax、AMPKα、PGC1α、DRP1和MFN2蛋白的表達(dá)水平；（c）各組細(xì)胞凋亡的流式細(xì)胞術(shù)圖像；（d）各組細(xì)胞凋亡程度的定量分析（流式細(xì)胞術(shù)）；（e）各組TUNEL染色圖像，通過熒光顯微鏡觀察；（f）各組TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞比例的定量分析（熒光成像）；（g）各組DCFH-DA探針檢測(cè)ROS的流式細(xì)胞術(shù)圖像；（h）各組細(xì)胞ROS水平的定量分析（流式細(xì)胞術(shù)）；（i）各組DCFH-DA熒光探針檢測(cè)ROS的共聚焦顯微鏡圖像；（j）各組ROS陽(yáng)性細(xì)胞比例的定量分析（共聚焦成像）；（k）各組JC-1染色線粒體膜電位的代表性熒光圖像；（l）JC-1綠熒光強(qiáng)度比值的定量分析；（m）不同處理組線粒體的透射電鏡（TEM）圖像

（4）水凝膠處理系統(tǒng)改善心肌細(xì)胞電生理特性的研究

新生大鼠心肌細(xì)胞（NRCMs）依賴細(xì)胞內(nèi)鈣信號(hào)節(jié)律性收縮。為評(píng)估導(dǎo)電水凝膠對(duì)其收縮和電生理功能的影響，采用Fluo-4熒光鈣探針檢測(cè)瞬時(shí)胞內(nèi)Ca²⁺變化。結(jié)果顯示，H/R組缺乏明顯電活動(dòng)和收縮，而Met+Exo+Gel組顯著增強(qiáng)Ca²⁺傳播，表現(xiàn)為峰值上升時(shí)間縮短和頻率提高（圖4a, e, f），表明水凝膠可改善鈣信號(hào)傳導(dǎo)，促進(jìn)心肌電活動(dòng)恢復(fù)。α-actin是心肌成熟的關(guān)鍵蛋白，Cx43是介導(dǎo)心肌細(xì)胞間信號(hào)傳導(dǎo)的主要縫隙連接蛋白。免疫熒光和Western blot檢測(cè)顯示，導(dǎo)電水凝膠組心肌細(xì)胞中α-actin肌節(jié)更密集，Cx43表達(dá)增強(qiáng)，且定位于細(xì)胞膜間（圖4b–d, g, h）。Met+Exo+Gel組效果尤為顯著，提示其有助于細(xì)胞電耦合和同步收縮。此外，整合素信號(hào)通路也參與水凝膠介導(dǎo)的心肌修復(fù)。Western blot結(jié)果（圖4d）顯示，導(dǎo)電水凝膠組顯著上調(diào)整合素α5、β1及下游ILK、AKT表達(dá)，尤其在含Exo組中更為明顯。這可能歸因于MSC-Exos激活PI3K/AKT信號(hào)通路，進(jìn)而調(diào)控Cx43表達(dá)，增強(qiáng)細(xì)胞間電連接。綜上，導(dǎo)電水凝膠通過增強(qiáng)Ca2?傳導(dǎo)、激活整合素-ILK-AKT通路和上調(diào)α-actin與Cx43表達(dá)，促進(jìn)心肌細(xì)胞耦合與同步收縮，展現(xiàn)出良好的心臟電生理修復(fù)潛力。

圖4. (a）來自不同實(shí)驗(yàn)組的NRCM中鈣瞬變和相應(yīng)的Ca ²⁺頻率信號(hào)的檢查。(b）來自α不同實(shí)驗(yàn)組的NRCM中α-肌動(dòng)蛋白的免疫染色。(c）來自不同實(shí)驗(yàn)組的NRCM中Cx 43的免疫染色。(d）整聯(lián)蛋白α5、整聯(lián)蛋白β1、ILK、AKT、α-肌動(dòng)蛋白和Cx43的蛋白質(zhì)表達(dá)水平。(e）定量分析鈣瞬時(shí)參數(shù)，集中于每5秒記錄的峰頻率。(f）定量分析鈣瞬時(shí)參數(shù)，集中于到達(dá)峰的時(shí)間。(g）定量分析-肌動(dòng)蛋白的熒光強(qiáng)度α。(h）定量分析Cx43的熒光強(qiáng)度

（5）水凝膠處理體系的促滲成管效應(yīng)

有效修復(fù)心肌缺血再灌注損傷（MIRI）通常需在梗死邊緣啟動(dòng)血管新生反應(yīng)，逐步向中心擴(kuò)展，形成密集毛細(xì)血管網(wǎng)絡(luò)，以滿足代謝需求并防止心肌細(xì)胞進(jìn)一步壞死（圖5a）。該研究在HUVEC構(gòu)建H/R模型，評(píng)估水凝膠系統(tǒng)對(duì)細(xì)胞遷移與血管生成的促進(jìn)作用。劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果（圖5b）顯示，含MSC-Exos的水凝膠組（Exo+Gel、Met+Exo+Gel）在12小時(shí)內(nèi)顯著促進(jìn)細(xì)胞遷移，36小時(shí)后幾乎完全愈合，而不含Exos的組效果有限。細(xì)胞遷移速率定量數(shù)據(jù)（圖5f）與之吻合。Transwell實(shí)驗(yàn)亦表明，Exo+Gel與Met+Exo+Gel組顯著提升細(xì)胞遷移能力（圖5c）。血管生成方面，管腔形成實(shí)驗(yàn)表明，含MSC-Exos的水凝膠可顯著促進(jìn)血管結(jié)構(gòu)生成，表現(xiàn)為結(jié)點(diǎn)、分支數(shù)明顯增加（圖5d, g–i）。Met+Exo+Gel組的管腔生成能力優(yōu)于單用Exos組，可能與二甲雙胍激活A(yù)MPK、減輕內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激相關(guān)。此外，Western blot分析（圖5e）顯示，Exo+Gel與Met+Exo+Gel組HUVEC中AKT、CD105和VEGF蛋白水平顯著升高。CD105是新生血管標(biāo)志，VEGF是血管生成關(guān)鍵因子，AKT通路則調(diào)控內(nèi)皮細(xì)胞增殖與遷移。結(jié)果表明，MSC-Exos與二甲雙胍協(xié)同可激活VEGF/AKT信號(hào)通路，增強(qiáng)內(nèi)皮細(xì)胞活性，促進(jìn)新血管生成，具有良好治療潛力。

圖5. (a）水凝膠系統(tǒng)促進(jìn)遷移和血管生成的示意圖。（b）與水凝膠系統(tǒng)的組分一起培養(yǎng)0、12、24和36小時(shí)的HUVEC的代表性圖像。（c）與水凝膠組分一起培養(yǎng)的HUVEC的Transwell圖像。（d）體外HUVEC形成管的圖像。（e）AKT、VEGF和CD 105的蛋白表達(dá)水平。（f）12、24和36小時(shí)傷口細(xì)胞遷移率的線圖。（g-i）不同水凝膠組的節(jié)點(diǎn)（g）、連接（h）和分支（i）的數(shù)量的定量結(jié)果

（6）通過RNA測(cè)序探索Metabolites/Exosome負(fù)載水凝膠系統(tǒng)的潛在機(jī)制

為進(jìn)一步探究多功能水凝膠系統(tǒng)（含二甲雙胍與外泌體）對(duì)基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控機(jī)制，研究團(tuán)隊(duì)對(duì)H/R處理的H9c2細(xì)胞進(jìn)行了RNA測(cè)序（圖6a）。結(jié)果顯示，H/R組相比對(duì)照組共檢出2977個(gè)差異表達(dá)基因（DEGs），其中上調(diào)1377個(gè)，下調(diào)1600個(gè)；而Met+Exo+Gel組相較H/R組有2527個(gè)DEGs，上調(diào)2084個(gè)，下調(diào)443個(gè)（圖6b, 6c），說明該水凝膠系統(tǒng)顯著調(diào)控大量基因表達(dá)。GO分析發(fā)現(xiàn)，H/R組上調(diào)基因與凋亡相關(guān)，下調(diào)基因涉及細(xì)胞周期與染色體分離（圖S5），驗(yàn)證H/R促進(jìn)細(xì)胞凋亡并抑制增殖。而Met+Exo+Gel組則顯著富集于細(xì)胞生長(zhǎng)、血管生成與抗氧化通路（圖6d）。KEGG分析顯示，H/R組基因富集于mTOR、TGF-β、ROS及凋亡等致病通路（圖S6），而Met+Exo+Gel組則上調(diào)AMPK、自噬、VEGF等修復(fù)相關(guān)通路，下調(diào)凋亡與氧化應(yīng)激通路（圖6e），表明其具有抗凋亡、抗氧化及促血管生成的作用。GSEA進(jìn)一步證實(shí)，該水凝膠系統(tǒng)激活多種關(guān)鍵通路，包括：凋亡（圖6f）、內(nèi)皮遷移（圖6g）、細(xì)胞發(fā)育（圖6h）、化學(xué)致癌/ROS（圖6i）、血管生成（圖6j）、PI3K-AKT（圖6k）、AMPK（圖S7）和VEGF（圖S8）等。綜上，RNA-seq結(jié)果揭示該系統(tǒng)通過多條機(jī)制改善心肌細(xì)胞功能、促進(jìn)修復(fù)，為MIRI治療提供了有力的生物信息學(xué)支持。

圖6.（a）不同處理?xiàng)l件下基因表達(dá)水平的熱圖，每組均設(shè)有三個(gè)生物學(xué)重復(fù)；（b）對(duì)照組與缺氧復(fù)氧（H/R）組間差異表達(dá)基因（DEGs）的火山圖，展示上下調(diào)基因；（c）Met+Exo+Gel組與H/R組間DEGs的火山圖；d）Met+Exo+Gel組與H/R組間DEGs的GO功能富集分析；（e）Met+Exo+Gel組與H/R組間DEGs的KEGG通路富集分析；（f）Met+Exo+Gel組與H/R組之間的細(xì)胞凋亡信號(hào)通路的GSEA分析；（g）血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移相關(guān)的GSEA分析；（h）發(fā)育相關(guān)細(xì)胞生長(zhǎng)的GSEA分析；（i）化學(xué)致癌物-活性氧相關(guān)通路的GSEA分析；（j）血管生成的GSEA分析；（k）PI3K-AKT信號(hào)通路的GSEA分析

（7）多功能水凝膠治療系統(tǒng)的體內(nèi)療效評(píng)價(jià)

大鼠隨機(jī)分為六組：Sham、MIRI、Gel、Met+Gel、Exo+Gel、Met+Exo+Gel。注射水凝膠4周后，通過超聲M型成像檢測(cè)心功能，結(jié)合HE染色進(jìn)行組織分析（圖7a）。超聲結(jié)果顯示，MIRI組EF、FS顯著下降，LVIDd、LVIDs、EDV和ESV明顯升高，提示心功能受損與左室重構(gòu)（圖7b, 7f–i）。相比之下，含水凝膠治療組上述參數(shù)均顯著改善，說明水凝膠提供了機(jī)械支撐與導(dǎo)電調(diào)控。其中，Met+Gel和Exo+Gel組EF與FS優(yōu)于Gel組，表明二甲雙胍與MSC-Exos均具獨(dú)立治療作用。Met+Exo+Gel組改善最顯著，提示兩者具有協(xié)同效果。組織學(xué)分析表明，MIRI組心肌萎縮、壁變薄、纖維化嚴(yán)重，膠原沉積明顯（圖7c）。水凝膠治療組心室壁厚度增加，膠原含量減少（圖7d, 7e），改善心肌結(jié)構(gòu)重建。Met+Exo+Gel組表現(xiàn)出最厚的左心室梗死壁和最小的梗死面積，可能與其聯(lián)合抗ROS和抗凋亡作用有關(guān)。綜上，含二甲雙胍與MSC-Exos的多功能水凝膠可顯著改善心功能、減少梗死面積并促進(jìn)心肌重構(gòu)，具有良好的MIRI治療潛力。

圖7. ( a）顯示28天過程中MIRI誘導(dǎo)、水凝膠注射、心臟功能評(píng)價(jià)和病理學(xué)檢查的時(shí)間軸的示意圖。（b）每組的代表性超聲心動(dòng)圖圖像。（c）梗塞區(qū)域的HE和Masson染色。高放大率圖像取自低放大率圖像的黑盒（d，e）定量分析各組治療后梗死面積（d）和纖維化面積（e）。（f-i）治療后超聲心動(dòng)圖測(cè)定心功能指標(biāo)，包括EF（f）、FS（g）、ESV（h）、EDV（i）

（8）多功能水凝膠在體內(nèi)抗凋亡、促進(jìn)細(xì)胞增殖和心臟特異性標(biāo)志物表達(dá)的作用

在MIRI發(fā)病機(jī)制中，心肌微環(huán)境會(huì)產(chǎn)生大量活性氧（ROS），若未能及時(shí)清除，將導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡。采用TUNEL染色檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡。所有水凝膠處理組在術(shù)后第3天均減少了細(xì)胞凋亡，Met+Gel、Exo+Gel和Met+Exo+Gel組凋亡率顯著低于MIRI組，其中Met+Exo+Gel組效果最顯著（圖8a, 8c）。為了評(píng)估水凝膠對(duì)心肌細(xì)胞增殖和功能恢復(fù)的促進(jìn)作用，研究通過免疫熒光共定位檢測(cè)cTnT（心肌特異性）、Ki67（增殖標(biāo)志）與α-actin（結(jié)構(gòu)蛋白）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，部分cTnT陽(yáng)性細(xì)胞共表達(dá)Ki67，提示心肌細(xì)胞處于增殖狀態(tài)，且這些細(xì)胞中α-actin表達(dá)水平較高，表明心肌肌節(jié)結(jié)構(gòu)正在重建（圖8b, 8d, 8e）。Met+Gel、Exo+Gel和Met+Exo+Gel組中Ki67與α-actin的表達(dá)水平均明顯上升。綜上，二甲雙胍和MSC-Exos協(xié)同作用可減少ROS與心肌凋亡，同時(shí)促進(jìn)心肌細(xì)胞增殖和結(jié)構(gòu)重建，雖心肌再生尚需進(jìn)一步驗(yàn)證，但其在心功能修復(fù)中具有潛在價(jià)值。

圖8. (a）3天后通過不同處理的損傷區(qū)域的代表性TUNEL染色圖像。（b）4周后通過不同處理的損傷區(qū)域中Ki 67、β-肌動(dòng)蛋白和c-TnT三色染色的免疫熒光圖像。（c-e）TUNEL（c）、Ki 67（d）和β-肌動(dòng)蛋白（e）的定量分析

（9）評(píng)價(jià)多功能水凝膠在體內(nèi)改善心肌傳導(dǎo)和降低對(duì)室性心律失常的易感性的作用

Cx43 是心肌中關(guān)鍵的縫隙連接蛋白，負(fù)責(zé)電信號(hào)耦合，確保心肌細(xì)胞同步收縮、維持正常心功能。為評(píng)估導(dǎo)電水凝膠在體內(nèi)對(duì)電信號(hào)傳導(dǎo)的影響，該研究對(duì)心肌組織進(jìn)行了Cx43免疫熒光染色。結(jié)果顯示，所有水凝膠處理組中，受損區(qū)域的Cx43表達(dá)均顯著高于MIRI組，尤以Met+Exo+Gel組最為顯著（圖9a, 9c），提示該聯(lián)合治療在促進(jìn)電信號(hào)恢復(fù)方面具有顯著優(yōu)勢(shì)。進(jìn)一步通過程控電刺激（PES）評(píng)估水凝膠對(duì)心律失常的防治作用。4周后，MIRI組在S1刺激后即出現(xiàn)持續(xù)性室性心動(dòng)過速（VT），而水凝膠組主要表現(xiàn)為短暫的室性早搏（PVC），尤其Met+Exo+Gel組僅在S4后偶發(fā)非持續(xù)性PVC（圖9b, 9d）。水凝膠顯著降低心律失常誘發(fā)率，說明其可改善電活動(dòng)穩(wěn)定性。上述效果歸因于MWCNT賦予水凝膠優(yōu)異導(dǎo)電性，有助于重建損傷區(qū)域與周圍健康組織間的電信號(hào)傳導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)，促進(jìn)電信號(hào)在心肌組織中的快速傳播，從而降低心律失常風(fēng)險(xiǎn)，恢復(fù)心臟電生理功能。

圖9.（a）28天后通過不同處理的損傷、邊緣和遠(yuǎn)端區(qū)域的代表性Cx43染色圖像。（b）注射后4周PES誘導(dǎo)的心律失常的ECG。c）損傷區(qū)域中Cx43的定量分析。d）心律失常敏感性由誘發(fā)商確定。S1：8次爆發(fā)刺激; S2：?jiǎn)未晤~外刺激; S3：雙次額外刺激; S4：三次額外刺激。VT：室性心動(dòng)過速; PVC：室性早搏

（10）評(píng)價(jià)多功能水凝膠對(duì)體內(nèi)血管生成的影響

心肌損傷后，重建受損區(qū)域的血管系統(tǒng)對(duì)恢復(fù)心功能至關(guān)重要。通過促進(jìn)血管新生，可有效改善局部氧氣與營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)。本研究采用α-SMA（成熟小動(dòng)脈標(biāo)志）、vWF（微血管標(biāo)志）和CD31（內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志）對(duì)心肌組織進(jìn)行免疫染色，以評(píng)估各組治療后血管新生情況。如圖10a、10b所示，術(shù)后4周，MIRI組血管新生水平較低，可能與心臟代償機(jī)制相關(guān)。而各水凝膠處理組均表現(xiàn)出顯著的血管生成能力，尤以含MSC-Exos組最為顯著，表明外泌體在體內(nèi)具有良好的促血管生成作用，這一結(jié)論與前期體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。進(jìn)一步對(duì)CD31（圖10c）、α-SMA（圖10d）和vWF（圖10e）陽(yáng)性血管的密度進(jìn)行定量分析，結(jié)果顯示Met+Exo+Gel組在新血管數(shù)量上明顯優(yōu)于其他組，提示該水凝膠系統(tǒng)不僅可促進(jìn)細(xì)胞增殖，還能有效募集內(nèi)皮細(xì)胞至損傷區(qū)域，加速血管網(wǎng)絡(luò)重建。綜上所述，多功能水凝膠通過外泌體介導(dǎo)的促血管生成作用，有效增強(qiáng)心肌組織的血管化過程，為MIRI治療提供了有前景的治療策略。

圖10.（a）4周后通過不同處理的損傷區(qū)域中的CD 31染色的免疫熒光圖像。（b）4α周后通過不同處理的損傷區(qū)域中的-SMA和vWF雙重染色的免疫熒光圖像。（c-e）損傷區(qū)域中CD 31陽(yáng)性血管（c）、α-SMA陽(yáng)性血管（d）和vWF陽(yáng)性血管（e）的定量分析