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針對(duì)上述問題，來自山東大學(xué)馬保金的研究團(tuán)隊(duì)構(gòu)建了負(fù)載淫羊藿苷（ICA）和EGCG的多價(jià)適體，分別命名為ATI和ATE。然后，將ATI和ATE摻入凝膠化甲基丙烯酰（GelMA）和聚乙二醇二丙烯酸酯（PEGDA）的預(yù)聚物溶液中，利用數(shù)字光處理（DLP）打印技術(shù)，制備了可降解、氫鍵增強(qiáng)的梯度水凝膠支架（GPA-ATI/ATE）。該支架能夠有效促進(jìn)早期干細(xì)胞募集，并在術(shù)后 12 周顯著增強(qiáng)骨軟骨結(jié)構(gòu)和功能的綜合再生。該研究利用材料設(shè)計(jì)來招募、保護(hù)和誘導(dǎo)內(nèi)源性干細(xì)胞分化的策略對(duì)于原位組織再生的應(yīng)用具有巨大的前景。該文章于2025年4月25日以《Tetrahedral DNA Nanoframework-Based Multivalent Aptamers Functionalized Biomimetic Hydrogel Scaffold Enhances Osteochondral Regeneration by Recruitment and Protection of Endogenous Stem Cells》為題發(fā)表于《Advanced Functional Materials》（DOI：10.1002/adfm.202502871）。

圖1 ATI 或 ATE 功能化 GPA 梯度支架修復(fù)骨軟骨缺損的示意圖。A) 構(gòu)建負(fù)載淫羊藿苷或表沒食子兒茶素沒食子酸酯 (ATI 或 ATE) 的多價(jià)核酸適體，分別摻雜到由 GelMA 和 PEGDA 組成的可生物降解水凝膠支架的頂層和底層。B) ATI 和 ATE 募集內(nèi)源性干細(xì)胞，清除活性氧 (ROS)，維持線粒體穩(wěn)態(tài)，并保留干細(xì)胞活性，從而促進(jìn)軟骨和成骨分化。C) 在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，利用生物混合梯度 GPA-ATI/ATE 水凝膠支架修復(fù)骨軟骨缺損

（1）ATI/ATE的制備與表征

內(nèi)源性干細(xì)胞遷移至缺損部位是組織再生的前提。為促進(jìn)這一過程，該研究設(shè)計(jì)了八面體DNA折紙結(jié)構(gòu)PolyApt，其三個(gè)頂點(diǎn)包含DNA適體Apt19s。PolyApt可通過退火工藝組裝，并通過負(fù)載ICA或EGCG進(jìn)一步制備功能性納米顆粒ATI或ATE。PAGE分析表明，PolyApt已成功組裝，并顯示出明顯的條帶。紫外光譜數(shù)據(jù)顯示，ICA和EGCG成功摻入PolyApt的雙鏈DNA中。封裝率分別為ICA/PolyApt（51.8%-60.4%）和EGCG/PolyApt（56.9%-59.3%）。Zeta電位分析和DLS結(jié)果確認(rèn)ATI和ATE的成功組裝，尺寸分別為7、14和13.5 nm。生物相容性評(píng)估顯示，PolyApt與對(duì)照組細(xì)胞增殖無顯著差異，ATI和ATE在不同濃度下促進(jìn)細(xì)胞增殖，但高濃度ICA和EGCG可能抑制細(xì)胞增殖。Live/Dead實(shí)驗(yàn)表明，BMSCs與ATI或ATE共培養(yǎng)時(shí)表現(xiàn)出良好生長(zhǎng)。基于封裝率和生物相容性，PolyApt/ICA（1:25）和PolyApt/EGCG（1:50）被選為進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)的最佳組合。

圖2 PolyApt、ATI 和 ATE 的表征。A）成功合成的 PolyApt 的凝膠電泳分析，1-7 泳道分別代表 Apt-S1、Apt-S2、Apt-S3、S4、Apt-S1+Apt-S2、Apt-S1+Apt-S2+Apt-S3 和 PolyApt。B、C）PolyApt、ICA、ATI、EGCG 和 ATE 的紫外可見吸收光譜。D）PolyApt、ICA、ATI、EGCG 和 ATE 的 Zeta 電位。E）DLS 分析 PolyApt、ATI 和 ATE 的水動(dòng)力學(xué)尺寸。F）不同 PolyApt/ICA 和 PolyApt/EGCG 摩爾比下 ATI 和 ATE 的包封率。G）PolyApt、ATI 和 ATE 的原子力顯微鏡成像。 H) BMSCs 與 PolyApt、ATI 和 ATE 共培養(yǎng)后的細(xì)胞增殖情況。細(xì)胞培養(yǎng)板作為空白對(duì)照。I) BMSCs 與 ATI 和 ATE 共培養(yǎng)后的熒光顯微鏡照片。綠點(diǎn)表示活細(xì)胞，紅點(diǎn)表示死細(xì)胞

（2）DLP打印梯度GPA-ATI/ATE水凝膠支架

內(nèi)源性干細(xì)胞遷移至缺損部位對(duì)組織修復(fù)至關(guān)重要。研究設(shè)計(jì)了含DNA適體Apt19s的八面體DNA折紙結(jié)構(gòu)PolyApt，并通過負(fù)載ICA或EGCG制備功能性納米顆粒ATI或ATE。PolyApt的組裝成功，通過紫外吸收光譜和NMR分析確認(rèn)了ICA和EGCG的成功摻入。封裝率在不同摩爾比下分別為51.8%-60.4%（ICA）和56.9%-59.3%（EGCG）。PolyApt、ATI和ATE的尺寸和形態(tài)通過DLS和AFM確認(rèn)，具有良好的穩(wěn)定性和生物相容性。細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)表明，ATI和ATE在不同濃度下促進(jìn)細(xì)胞增殖，但高濃度ICA和EGCG可能抑制細(xì)胞活力。進(jìn)一步研究顯示，PolyApt/ICA和PolyApt/EGCG的摩爾比為1:25和1:50時(shí)，具有較高的包封率和良好的生物相容性，適用于組織再生實(shí)驗(yàn)。GPA水凝膠通過共聚GelMA和PEGDA，提高了機(jī)械彈性和水凝膠穩(wěn)定性，適用于骨軟骨再生。GPA水凝膠的溶脹性、降解速度和力學(xué)性能與GelMA相比顯著提高，且具有較好的生物相容性。通過調(diào)節(jié)PEGDA和GelMA的比例，優(yōu)化了水凝膠的性能，選擇了GPA15-2.5作為候選材料。GPA15-2.5水凝膠支持細(xì)胞增殖，并具有良好的恢復(fù)性能。其流變性表明，水凝膠在外力作用下具有優(yōu)異的恢復(fù)力和高機(jī)械強(qiáng)度，適合用于骨軟骨修復(fù)。通過3D打印技術(shù)，GPA15-2.5水凝膠能夠制造精確的結(jié)構(gòu)，適用于骨軟骨一體化修復(fù)，支架具有良好的機(jī)械強(qiáng)度和彈性。

圖3 水凝膠理化性質(zhì)評(píng)價(jià)。A）不同初始濃度GelMA和PEGDA的GPA水凝膠的拉伸應(yīng)力-應(yīng)變曲線。B）不同初始濃度GelMA和PEGDA的GPA水凝膠的壓縮應(yīng)力-應(yīng)變曲線。C）不同初始濃度GelMA和PEGDA的GPA水凝膠在膠原酶溶液中的體外降解行為。D）GPA水凝膠的流變性質(zhì)，包括頻率掃描測(cè)試和連續(xù)交替振蕩剪切應(yīng)變測(cè)試。E）梯度GPA-ATI/ATE水凝膠支架批量一致打印的代表性圖像。F）打印的多孔GPA-ATI/ATE水凝膠支架的壓縮應(yīng)力-應(yīng)變曲線，以及打印的GPA-ATI/ATE梯度支架在最大應(yīng)變?yōu)?0%下的循環(huán)壓縮應(yīng)力-應(yīng)變曲線。循環(huán)次數(shù)設(shè)定為100

（3）打印的 GPA-ATI/ATE 水凝膠支架的干細(xì)胞結(jié)合和遷移

在評(píng)估ATI和ATE的生物功能之前，首先檢查了GPA-ATI和GPA-ATE水凝膠支架的體外釋放曲線。前兩天，ATI和ATE呈爆發(fā)性釋放，之后釋放速率趨于穩(wěn)定，約14天后進(jìn)入平衡狀態(tài)，表明大多數(shù)化合物已釋放，這表明水凝膠支架可持續(xù)釋放ATI和ATE，促進(jìn)BMSCs活性募集和保護(hù)。當(dāng)BMSCs與Apt共孵育時(shí)，熒光強(qiáng)度明顯增加，表明Apt與BMSCs結(jié)合。PolyApt與BMSCs的結(jié)合顯著增強(qiáng)，ATI和ATE的熒光強(qiáng)度與PolyApt相當(dāng)，表明ICA和EGCG的摻入未顯著影響結(jié)合能力。流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)一步確認(rèn)，PolyApt的結(jié)合能力最強(qiáng)，而ATI和ATE也表現(xiàn)出較強(qiáng)的結(jié)合能力，且不影響PolyApt的效率。Transwell實(shí)驗(yàn)顯示，純GPA水凝膠不具備趨化特性，而GPA-TFNAs、GPA-Apt和GPA-PolyApt水凝膠則能有效募集BMSCs。GPA-PolyApt水凝膠由于多價(jià)效應(yīng)和TFNAs的貢獻(xiàn)，募集效率顯著提高。ATI和ATE水凝膠組也能促進(jìn)BMSCs的募集，且在細(xì)胞增殖方面表現(xiàn)良好。劃痕試驗(yàn)結(jié)果顯示，GPA-PolyApt、GPA-ATI和GPA-ATE水凝膠組的BMSCs遷移能力較強(qiáng)，劃痕愈合率高于其他組。PolyApt、ATI和ATE的多價(jià)效應(yīng)顯著提高了細(xì)胞的遷移能力。整體結(jié)果表明，這些改性GPA水凝膠具有顯著的趨化特性，能夠有效促進(jìn)細(xì)胞遷移，具有良好的組織工程應(yīng)用前景。

圖4 A) Apt、PolyApt、ATI 和 ATE 與 BMSC 的體外特異性結(jié)合和攝取能力。B) 使用 ImageJ 對(duì)平均熒光強(qiáng)度進(jìn)行定量統(tǒng)計(jì)分析。C) 分別與 6-FAM 標(biāo)記的 Apt、PolyApt、ATI 和 ATE 孵育的 BMSC 進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析。D) 對(duì)流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)得出的平均熒光強(qiáng)度進(jìn)行定量統(tǒng)計(jì)分析。E) Transwell 遷移實(shí)驗(yàn)分別評(píng)估用打印 GPA 水凝膠支架、GPA-TFNAs 水凝膠支架、GPA-Apt 水凝膠支架、GPA-PolyApt 水凝膠支架、GPA-ATI 水凝膠支架和 GPA-ATE 水凝膠支架處理的組中 BMSC 的趨化行為。F) 對(duì)遷移的 BMSC 數(shù)量進(jìn)行定量分析。 G）24小時(shí)二維劃痕試驗(yàn)的代表性圖像，分別評(píng)估打印GPA水凝膠支架、GPA-TFNAs水凝膠支架、GPA-Apt水凝膠支架、GPA-PolyApt水凝膠支架、GPA-ATI水凝膠支架和GPA-ATE水凝膠支架組中BMSC的遷移率。H）劃痕傷口愈合率的定量統(tǒng)計(jì)分析

（4）打印GPA-ATI/ATE水凝膠支架的抗氧化保護(hù)作用

為了評(píng)估ATI/ATE的抗氧化特性，采用了DPPH、ABTS和超氧化物陰離子測(cè)定法。結(jié)果表明，ATI/ATE濃度增加時(shí)，清除自由基的能力增強(qiáng)，這與ICA/EGCG的抗氧化能力有關(guān)。ATI/ATE能有效清除自由基并抑制ROS生成，且隨著濃度升高，其抗氧化效果明顯增強(qiáng)。在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，用H₂O₂誘導(dǎo)的BMSCs氧化應(yīng)激后，ATI/ATE治療顯著上調(diào)抗氧化酶基因（如GPX1、NQO1、SOD1和CAT）的表達(dá)，恢復(fù)了細(xì)胞內(nèi)氧化還原平衡。DCFH-DA染色結(jié)果也顯示，ATI和ATE能增強(qiáng)ICA和EGCG的吸收，進(jìn)一步提升細(xì)胞的抗氧化能力。線粒體是ROS的主要靶點(diǎn)，通過JC-1染色評(píng)估ATI/ATE對(duì)線粒體膜電位的影響。H₂O₂處理后，ATI和ATE顯著穩(wěn)定了線粒體膜電位，減少了功能障礙。此外，ATI/ATE水凝膠支架也表現(xiàn)出良好的ROS清除能力，減少了H₂O₂誘導(dǎo)的線粒體損傷。TEM結(jié)果顯示，ATI和ATE處理后，線粒體形態(tài)和數(shù)量恢復(fù)正常，減少H₂O₂引起的損傷。MitoTracker Green染色和流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)一步證實(shí)，ATI和ATE增強(qiáng)了BMSCs中的線粒體生物合成，促進(jìn)了能量代謝。這些結(jié)果表明ATI和ATE不僅能增強(qiáng)抗氧化能力，還能有效保護(hù)線粒體功能，保持BMSCs的生物活性。

圖5 A) 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）的抗氧化和線粒體功能測(cè)定。不同濃度ATE對(duì)三種典型自由基（DPPH、·OH和·O 2 ? ）的清除活性。B) 在H₂O₂刺激下，不同處理后抗氧化酶（GPX1、NQO1、SOD1和CAT）的相對(duì)mRNA表達(dá)水平。C) DCFH-DA探針染色評(píng)估ATI和ATE的細(xì)胞內(nèi)ROS清除能力。D) 定量分析DCFH-DA熒光強(qiáng)度以評(píng)估BMSCs中的ROS水平。E) JC-1染色監(jiān)測(cè)不同處理后BMSCs中的線粒體膜電位。F) 定量分析JC-1聚集體與單體（A/M）的比率，反映線粒體膜電位的變化。 G) 不同處理后 BMSCs 中線粒體 ROS 的 Mito-Sox 染色代表性熒光圖像。H) Mito-Sox 染色熒光強(qiáng)度的定量統(tǒng)計(jì)。I) 不同處理后 BMSCs 中線粒體的形態(tài)和分布的代表性 TEM 圖像。J) 不同處理后 BMSCs 經(jīng) Mito-tracker green 染色的流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果

（5）打印 GPA-ATI/ATE 水凝膠支架的軟骨形成和成骨分化能力

除了促進(jìn)內(nèi)源性干細(xì)胞的募集和保護(hù)外，還研究了ATI和ATE對(duì)BMSCs軟骨形成和成骨分化的影響。通過阿新藍(lán)染色，發(fā)現(xiàn)ATI處理組的BMSCs形成了良好的軟骨分化聚集體，而GPA-ICA組也表現(xiàn)出較強(qiáng)的糖胺聚糖合成。ATI增強(qiáng)了ICA的細(xì)胞吸收效率，有助于提高軟骨分化能力。RT-qPCR結(jié)果顯示，ATI處理組在第7和第14天顯著上調(diào)了軟骨形成相關(guān)基因（如COL II和AGG）的表達(dá)，表明ATI有助于軟骨分化。在成骨分化方面，ATI和ATE處理組的BMSCs表現(xiàn)出較強(qiáng)的ALP染色，且在氧化應(yīng)激條件下依然保持較好的成骨活性。鈣沉積分析顯示，GPA-ATE處理組的礦化效果明顯，表明其能夠保護(hù)BMSCs免受氧化損傷并促進(jìn)成骨分化。進(jìn)一步的基因表達(dá)分析也證實(shí)了ATI和ATE在促進(jìn)成骨分化方面的作用，尤其是在氧化應(yīng)激條件下。這些結(jié)果表明，ATI和ATE通過與GPA水凝膠支架結(jié)合，可以有效促進(jìn)BMSCs的軟骨形成和成骨分化，具有廣泛的組織修復(fù)潛力。

圖6 在不同水凝膠支架上，有無H₂O₂刺激下評(píng)價(jià) BMSCs 的軟骨和成骨分化。A) 進(jìn)行阿新藍(lán)染色以評(píng)估培養(yǎng) 14 天后，有或沒有H₂O₂刺激下不同水凝膠支架上 BMSCs 的軟骨分化。比例尺：200 μm。B) 使用 qRT-PCR 分析在有或沒有H₂O₂刺激下，在第 7 和 14 天不同水凝膠支架上軟骨細(xì)胞相關(guān)基因的表達(dá)水平。C) 在第 7 天進(jìn)行 ALP 染色以評(píng)估在有或沒有H₂O₂刺激下不同水凝膠支架上 BMSCs 的早期成骨分化。D) 不同組間相對(duì) ALP 水平的半定量分析。 E) 在第 14 天進(jìn)行 ARS 染色以評(píng)估 BMSCs 在不同水凝膠支架上（有或無H₂O₂刺激）的成骨分化情況。F) 不同組間相對(duì)鈣沉積水平的半定量分析。G) 在第 7 天，有或無H₂O₂刺激的情況下，使用 qRT-PCR 分析不同水凝膠支架上成骨相關(guān)基因的表達(dá)水平。H )在第 14 天，有或無H₂O₂刺激的情況下，使用 qRT-PCR 分析不同水凝膠支架上成骨相關(guān)基因的表達(dá)水平

（6）梯度水凝膠支架的體內(nèi)骨軟骨修復(fù)功效

為了評(píng)估GPA-ATI/ATE梯度水凝膠支架在募集干細(xì)胞、清除ROS、維持細(xì)胞活力及促進(jìn)軟骨和成骨分化方面的優(yōu)勢(shì)，使用膝關(guān)節(jié)滑車部圓柱形缺損模型進(jìn)行了體內(nèi)評(píng)估（圖6A）?？瞻捉M顯示明顯缺損，而純GPA水凝膠組缺損處仍有空洞，GPA-PolyApt組則部分填補(bǔ)缺損。GPA-ATI/ATE組則能有效填充缺損，表面光滑。掃描電鏡結(jié)果顯示，ATI的釋放對(duì)軟骨修復(fù)至關(guān)重要。術(shù)后6周的micro-CT結(jié)果表明，GPA-ATI/ATE組的軟骨下骨形成明顯優(yōu)于其他組，并在12周時(shí)實(shí)現(xiàn)了全面修復(fù)。GPA-ATI/ATE組的軟骨下骨再生程度顯著高于純GPA和GPA-PolyApt組（圖6C）。定量分析驗(yàn)證了這些發(fā)現(xiàn)（圖6D），GPA-ATI/ATE組在骨體積、骨體積比和骨礦物質(zhì)密度等參數(shù)上顯著高于其他組。壓縮試驗(yàn)結(jié)果顯示，GPA-ATI/ATE水凝膠支架在恢復(fù)膝關(guān)節(jié)功能方面表現(xiàn)最佳，接近正常膝關(guān)節(jié)負(fù)荷（圖S17）。組織學(xué)分析（圖6E）進(jìn)一步證實(shí)，GPA-ATI/ATE支架顯著促進(jìn)了軟骨和軟骨下骨的修復(fù)，尤其在12周時(shí)，軟骨和骨的再生與宿主組織良好整合。相比之下，其他組的修復(fù)效果較差，顯示出裂紋或空洞。這些結(jié)果表明，ATI/ATE功能化的GPA水凝膠支架能有效促進(jìn)骨軟骨缺損的修復(fù)，具有顯著的生物修復(fù)潛力。

圖7 GPA-ATI/ATE 水凝膠支架對(duì)大鼠膝關(guān)節(jié)骨軟骨缺損模型的治療效果。A) 不同組別術(shù)后 12 周修復(fù)骨軟骨缺損的大體圖像。B) 不同組別術(shù)后 12 周修復(fù)軟骨表面的 SEM 圖像。C) 不同組別術(shù)后 6 和 12 周修復(fù)軟骨下骨的微型 CT 分析的 3D 重建圖像。D) BV、BV/TV 和 BMD 的定量微型 CT 分析。E) 蘇木精和伊紅 (H&E) 和甲苯胺藍(lán) (TB) 染色顯示，與其他組相比，GPA-ATI/ATE 水凝膠支架組的軟骨和軟骨下骨的修復(fù)均得到增強(qiáng)

為了進(jìn)一步評(píng)估GPA-ATI/ATE水凝膠支架在骨軟骨修復(fù)中的作用，進(jìn)行了軟骨和骨特異性蛋白的免疫組織化學(xué)染色（圖7A）。植入12周后，GPA-ATI/ATE組的軟骨層和軟骨下骨區(qū)域呈現(xiàn)明顯且均勻的陽(yáng)性染色，尤其是COL II和OCN蛋白的染色強(qiáng)度顯著高于其他組，表明該支架能夠增強(qiáng)軟骨和軟骨下骨的修復(fù)。這主要是因?yàn)锳TI和ATE的持續(xù)釋放，能吸引BMSCs并保護(hù)它們免受ROS損傷，同時(shí)促進(jìn)軟骨和成骨分化。免疫熒光染色分析（圖7B）顯示，GPA-ATI/ATE水凝膠支架中BMSCs的富集程度顯著高于GPA-PolyApt組，這表明ATI和ATE增強(qiáng)了BMSCs的募集和增殖。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果（圖7C）進(jìn)一步表明，GPA-ATI/ATE組的CD44陽(yáng)性細(xì)胞比例達(dá)到13.9%，顯著高于GPA-PolyApt組的8.9%，表明ATI和ATE的結(jié)合促進(jìn)了BMSCs的遷移和增殖。ICA和EGCG通過激活Wnt/β-catenin和BMP-Smad信號(hào)通路，以及減輕氧化應(yīng)激，增強(qiáng)了BMSCs的軟骨和成骨分化能力。定量分析顯示，GPA-ATI/ATE水凝膠支架顯著促進(jìn)了BMSCs的富集，從而改善了骨再生。

圖8 缺損區(qū)域的免疫組織學(xué)分析和CD44陽(yáng)性BMSCs募集。A) Saf-G、Coll II和OCN的代表性免疫組織學(xué)染色圖像，顯示不同組別的軟骨和軟骨下骨修復(fù)情況。B) 免疫熒光染色圖像顯示術(shù)后7天，GPA-ATI/ATE水凝膠支架在大鼠膝關(guān)節(jié)骨軟骨缺損處募集的CD44陽(yáng)性BMSCs。C) 流式細(xì)胞術(shù)定量分析術(shù)后7天，GPA-ATI/ATE水凝膠支架在骨軟骨缺損處介導(dǎo)的內(nèi)源性BMSCs募集情況