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針對(duì)上述問(wèn)題，四川大學(xué)顧志鵬團(tuán)隊(duì)為解決血友病性關(guān)節(jié)病治療難題，利用植物多酚、鐵螯合劑和α-硫辛酸一鍋法構(gòu)建了一種具有清除ROS和鐵離子、保護(hù)軟骨功能的注射型水凝膠。該水凝膠由低成本、臨床可用成分構(gòu)成，具備良好的生物相容性、抗炎抗氧化及耐磨性。體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)顯示其可緩解HA病理過(guò)程、改善關(guān)節(jié)功能，具備良好應(yīng)用前景。該文章于2025年04月01日以《Robust Injectable Hydrogels for Hemophilic Arthropathy via Anti-Inflammation, Iron Removal and Cartilage Protection》為題發(fā)表于《Advanced Functional Materials》上。（DOI: 10.1002/adfm.202500271）

（1）可注射水凝膠的制備與表征

研究通過(guò)一鍋法組裝三種商用小分子制備了多功能可注射水凝膠用于HA治療。其中LA加熱開(kāi)環(huán)聚合后可與螯合模塊和抗氧化模塊形成多種相互作用（圖1a）；選用EGCG和去鐵胺（DFO）。通過(guò)優(yōu)化DFO和EGCG濃度獲得凝膠相圖，結(jié)果顯示DFO濃度升高促進(jìn)凝膠化，而高濃度EGCG降低凝膠概率（圖1b）。采用DFO和EGCG制備的1 mg/mL可注射水凝膠SEM和能譜分析顯示其具有典型多孔結(jié)構(gòu)且元素分布均勻。FT-IR證實(shí)EGCG與LA通過(guò)多酚硫自由基親核作用成功交聯(lián)（圖1c）。XPS分析顯示PLED水凝膠的S 2p譜含二硫鍵（164.6 eV）、脂肪硫（163.0 eV）和硫酚鍵（163.5 eV）三個(gè)特征峰（圖1d），表明EGCG酚基團(tuán)在交聯(lián)中起關(guān)鍵作用。分子動(dòng)力學(xué)模擬顯示PLED結(jié)構(gòu)的范德華相互作用能最高（-85204.55 kJ/mol），穩(wěn)定性最佳（圖1e）。流變學(xué)測(cè)試表明水凝膠儲(chǔ)能模量高于損耗模量，具有良好彈性（圖1f）。其剪切稀化特性（圖1h）和自修復(fù)性能（圖1g）源于分子網(wǎng)絡(luò)中的氫鍵、動(dòng)態(tài)二硫鍵和配位鍵，這些特性賦予材料優(yōu)異的可注射性和臨床適用性。

圖1 可注射水凝膠的制備與表征。（a）可注射水凝膠的主要成分及制備工藝；（b）可注射水凝膠的凝膠化相圖；（c）PLED水凝膠的FT-IR光譜；（d）PLED水凝膠的XPS表征；（e）PLED水凝膠各組分間物理相互作用能的分子模擬：I. DFO-DFO，II. LA/EGCG-LA/EGCG，III. LA/EGCG-DFO；（f）PLED水凝膠的流變測(cè)試結(jié)果；（g）PLED水凝膠的觸變行為；（h）PLED水凝膠的剪切稀化

（2）水凝膠的多功能性

研究開(kāi)發(fā)的多功能PLED水凝膠在治療血友病性關(guān)節(jié)?。℉A）方面展現(xiàn)出優(yōu)異的綜合性能（圖2a）。在鐵清除能力方面，通過(guò)血紅蛋白氧化和菲啰啉比色法評(píng)估發(fā)現(xiàn)，加入亞鐵離子后溶液顏色由鮮紅色變?yōu)樽丶t色（圖2b）。光譜分析顯示PLED水凝膠能有效維持血紅蛋白在542 nm和577 nm處的特征吸收峰（圖2c），其保護(hù)效果顯著優(yōu)于不含EGCG的PLD水凝膠（圖2d,e）。進(jìn)一步的定量測(cè)試表明，PLED水凝膠對(duì)Fe2?的螯合能力達(dá)到83.3%（圖2f,g），證實(shí)了其良好的鐵清除能力。在抗氧化性能方面，DPPH和ABTS自由基清除實(shí)驗(yàn)顯示，PLED水凝膠處理30分鐘后可使紫色DPPH溶液和藍(lán)色ABTS溶液褪色為淡黃色（圖2h,i），清除率分別達(dá)到80.5%和94.5%。值得注意的是，雖然DFO本身的自由基清除能力有限，但EGCG的加入顯著提升了水凝膠的整體抗氧化性能。潤(rùn)滑性能測(cè)試模擬了四種不同的軟/軟接觸摩擦副（圖2j）。結(jié)果顯示PLED水凝膠與天然軟骨間的摩擦系數(shù)為0.046lbf/lbf，與天然軟骨間的摩擦系數(shù)（0.037lbf/lbf）非常接近（圖2k）。這種優(yōu)異的潤(rùn)滑性能源于其獨(dú)特的液體潤(rùn)滑機(jī)制，在負(fù)載下能形成有效的潤(rùn)滑層。粘附性能評(píng)估采用牛膝關(guān)節(jié)模型，實(shí)驗(yàn)證明PLED水凝膠能在關(guān)節(jié)模擬液中保持10分鐘以上的穩(wěn)定粘附（圖2l）。與易碎裂的透明質(zhì)酸水凝膠相比，PLED水凝膠在反復(fù)關(guān)節(jié)運(yùn)動(dòng)模擬后仍能均勻分布在軟骨表面（圖2m），這歸功于其多級(jí)相互作用機(jī)制。此外，該水凝膠還展現(xiàn)出良好的材料表面適應(yīng)性，為其臨床應(yīng)用提供了更多可能性。

圖2 水凝膠的功能特性。（a）多功能可注射水凝膠的示意圖；（b–e）可注射水凝膠對(duì)血紅蛋白的保護(hù)作用；（f）鐵離子螯合、DPPH自由基清除、ABTS自由基清除溶液的顏色變化圖；（g）鐵清除能力；（h）DPPH自由基清除性能；（i）ABTS自由基清除性能；（j）簡(jiǎn)化示意圖，說(shuō)明四種不同的摩擦對(duì)；（k）可注射水凝膠與軟骨之間的摩擦系數(shù)結(jié)果；（l）可注射水凝膠在模擬關(guān)節(jié)炎模型中的粘附效果；（m）關(guān)節(jié)運(yùn)動(dòng)后可注射水凝膠與關(guān)節(jié)軟骨表面之間的界面現(xiàn)象

（3）可注射水凝膠的體外生物學(xué)評(píng)價(jià)

在評(píng)估水凝膠的生物相容性后，研究了其細(xì)胞層面的生物功能。結(jié)果顯示，該凝膠能有效保護(hù)細(xì)胞免受鐵離子損傷（圖3a,b）。通過(guò)線(xiàn)粒體膜電位檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，鐵過(guò)載會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞凋亡（紅/綠熒光標(biāo)記，圖3c），而PLED水凝膠能顯著改善膜電位并減少凋亡（圖3d）。流式細(xì)胞術(shù)顯示PLED組凋亡率從9.14%降至5.67%（圖3e,f）。普魯士藍(lán)染色證實(shí)PLED可減少細(xì)胞內(nèi)鐵沉積（圖3g），熒光探針檢測(cè)和流式分析（圖3h,i）進(jìn)一步驗(yàn)證了其抗鐵過(guò)載損傷的保護(hù)作用。

圖3 PLED水凝膠體外除鐵行為。（a）染色結(jié)果顯示鐵刺激后在水凝膠保護(hù)下的活細(xì)胞和死細(xì)胞；（b）鐵超載條件下水凝膠對(duì)細(xì)胞存活率的影響；（c）鐵超載后線(xiàn)粒體膜電位的變化；（d）CMXRos的熒光強(qiáng)度；（e，f）流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示鐵誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡；（g）細(xì)胞內(nèi)鐵染色結(jié)果；（h，i）細(xì)胞內(nèi)鐵染色的流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果

鐵過(guò)載會(huì)引發(fā)細(xì)胞內(nèi)ROS過(guò)量（圖4a,b）。DCFH-DA檢測(cè)顯示，PLED水凝膠能顯著降低Fe2?刺激導(dǎo)致的ROS升高（≈10%），使其恢復(fù)至正常水平（圖4c）。MDA（圖4d）、SOD（圖4e）、GSH Px（圖4f）、CAT（圖4g）和總谷胱甘肽（圖4h）等指標(biāo)證實(shí)，PLED較PLD能更有效緩解鐵過(guò)載引起的氧化應(yīng)激，使多項(xiàng)指標(biāo)接近正常細(xì)胞水平。通過(guò)qRT-PCR評(píng)估水凝膠對(duì)炎癥誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞退化的保護(hù)作用。結(jié)果顯示，F(xiàn)e2?組COL II基因表達(dá)顯著降低（圖4i），而PLD和PLED水凝膠均能提升COL II表達(dá)，保護(hù)軟骨細(xì)胞。同時(shí)，PLED組能更有效下調(diào)促炎因子（MMP13、IL-1β、IL-6、TNF-α）表達(dá)（圖4j-m），其中對(duì)TNF-α的抑制作用尤為顯著。鐵死亡相關(guān)基因檢測(cè)表明，F(xiàn)e2?組GPX4（圖4n）、COX2（圖4o）和iNOS（圖4p）表達(dá)升高，PLED和PLD水凝膠均可緩解這一現(xiàn)象。該多功能水凝膠通過(guò)EGCG和LA直接清除自由基，DFO螯合鐵離子抑制氧化反應(yīng)；同時(shí)EGCG和LA減少炎癥因子釋放，DFO通過(guò)降低鐵離子濃度減輕炎癥反應(yīng)，在細(xì)胞水平展現(xiàn)出優(yōu)異的鐵清除、抗氧化和抗炎效果，具有治療HA的潛力。

圖4 水凝膠的抗炎和抗氧化特性。（a）細(xì)胞內(nèi)ROS熒光染色；（b，c）定量評(píng)估細(xì)胞內(nèi)ROS水平；（d）測(cè)量細(xì)胞過(guò)氧化產(chǎn)物；（e，f，g）細(xì)胞抗氧化酶測(cè)定；（h）測(cè)量細(xì)胞內(nèi)抗氧化水平；（i，j）檢測(cè)與軟骨退化相關(guān)的基因；（k，l，m）測(cè)量鐵刺激細(xì)胞中的炎癥水平；（n，o，p）確定與細(xì)胞內(nèi)鐵死亡相關(guān)的基因

（4）可注射水凝膠的體內(nèi)治療

在完成體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證后，研究建立了血友病關(guān)節(jié)炎大鼠模型進(jìn)行體內(nèi)評(píng)估（圖5a）。首先考察了水凝膠的生物相容性和降解行為（圖5b），結(jié)果顯示水凝膠可持續(xù)存在1個(gè)月且無(wú)明顯不良反應(yīng)，有利于長(zhǎng)期關(guān)節(jié)炎治療。HA模型小鼠關(guān)節(jié)內(nèi)水凝膠熒光也證實(shí)了這一特性（圖5c,d）。治療一周后，未治療組膝關(guān)節(jié)明顯腫脹（圖5e,g）伴局部溫度升高（圖5f,h），而PLD和PLED治療組腫脹減輕、溫度恢復(fù)正常。步態(tài)分析顯示（圖5i），未治療組左后肢運(yùn)動(dòng)明顯受損，PLED組恢復(fù)效果最佳。通過(guò)對(duì)站立相、擺動(dòng)相等參數(shù)分析（圖5j）證實(shí)，PLED治療可使部分指標(biāo)恢復(fù)正常水平。

圖5 PLED水凝膠治療HA大鼠。（a）注射水凝膠治療HA實(shí)驗(yàn)方案示意圖；（b）注射PLED水凝膠的皮下降解；（c，d）評(píng)估注射水凝膠在關(guān)節(jié)腔內(nèi)的滯留情況；（e）HA模型小鼠關(guān)節(jié)腫脹的代表性圖像；（f）HA模型小鼠關(guān)節(jié)發(fā)熱的紅外圖像；（g）HA模型小鼠關(guān)節(jié)腫脹和（h）發(fā)熱的定量統(tǒng)計(jì)；（i）HA模型小鼠注射水凝膠治療后的步態(tài)分析；（j）HA模型小鼠步態(tài)相關(guān)指標(biāo)的定量分析

通過(guò)Micro-CT評(píng)估治療后的關(guān)節(jié)周?chē)亲兓?，結(jié)果顯示PLD和PLED凝膠顯著改善了骨贅形成、軟骨下硬化和骨質(zhì)流失。組織學(xué)染色（圖6a）表明，治療組有效緩解了鐵過(guò)載導(dǎo)致的滑膜增生和軟骨基質(zhì)降解。普魯士藍(lán)染色顯示治療組幾乎無(wú)鐵沉積。免疫熒光分析（圖6a,b-i）證實(shí)，PLED較PLD能更有效促進(jìn)COL II表達(dá)（圖6b），減少膠原流失。同時(shí)顯著調(diào)節(jié)鐵死亡相關(guān)蛋白（COX2、GPX4、MMP13、iNOS）（圖6c-f）和促炎因子（IL-6、IL-1β、TNF-α）（圖6g-i）的表達(dá)。值得注意的是，PLED組的治療效果顯著優(yōu)于PLD組，表明單一鐵清除療法效果有限。EGCG和DFO在鐵螯合方面具有協(xié)同作用，而LA通過(guò)抗氧化劑再生增強(qiáng)整體抗氧化能力，三者聯(lián)合提供了更全面持久的治療效果。

圖6 注射水凝膠治療HA后關(guān)節(jié)的組織學(xué)評(píng)價(jià)。（a）膝關(guān)節(jié)組織微觀(guān)變化（HE、SAF-O、PB）及相關(guān)指標(biāo)免疫熒光染色（COL II、COX2、GPX4、MMP13、iNOS、IL-6、IL-1β、TNF-α）結(jié)果（黑色箭頭代表鐵過(guò)載陽(yáng)性表達(dá)，白色虛線(xiàn)代表關(guān)節(jié)界面）；（b–i）使用ImageJ對(duì)相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行定量分析的結(jié)果

通過(guò)RNA測(cè)序分析進(jìn)一步闡明水凝膠治療HA的機(jī)制。PCA分析顯示PLED組可部分逆轉(zhuǎn)鐵過(guò)載引起的轉(zhuǎn)錄組變化（圖7a）。差異基因分析發(fā)現(xiàn)，與生理鹽水組相比，PLED組存在2274個(gè)差異表達(dá)基因（圖7b），其中60.7%的上調(diào)基因和39.3%的下調(diào)基因被PLED逆轉(zhuǎn)（圖7c）。關(guān)鍵HA相關(guān)基因分析表明，PLED對(duì)Mmp12等分解代謝基因和炎癥基因的調(diào)控作用尤為顯著（圖7d,e）。GSEA分析顯示，鈣信號(hào)通路和蛋白質(zhì)消化吸收是富集最顯著的KEGG通路（圖7f,g）。GO分析表明，細(xì)胞外基質(zhì)調(diào)控、陽(yáng)離子通道活性等是最重要的差異mRNA功能類(lèi)別。PLED可能通過(guò)調(diào)控鈣信號(hào)通路、肥大性心肌病等通路發(fā)揮治療作用，并可調(diào)節(jié)Mmp12、IL1rn等基因表達(dá)，這些基因有望成為HA早期診斷或療效監(jiān)測(cè)的生物標(biāo)志物。

圖7 PLED水凝膠治療HA模型小鼠后RNA-seq分析。（a）RNA主成分分析（PCA）；（b）生理鹽水組與PLED組差異基因火山圖；（c）生理鹽水組與PLED組差異表達(dá)基因聚類(lèi)分析；（d，e）生理鹽水組與PLED組HA相關(guān)差異基因分析；（f）HA相關(guān)基因KEGG通路富集分析；（g）HA相關(guān)基因GO富集分析