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針對(duì)上述問(wèn)題，山東大學(xué)張東姣團(tuán)隊(duì)開(kāi)發(fā)一種基于黑磷（BP）和氨基硅酞菁（SiPc-NH₂）的納米復(fù)合水凝膠（BP-PC@GelMA），通過(guò)非共價(jià)相互作用（如π-π堆積、靜電作用）增強(qiáng)BP的分散性和穩(wěn)定性，減少其氧化降解，并提升其光熱性能和生物相容性。研究進(jìn)一步探討B(tài)P-PC@GelMA在骨缺損修復(fù)中的作用機(jī)制，特別是通過(guò)調(diào)控Hippo/Wnt信號(hào)通路和線粒體動(dòng)態(tài)（融合/分裂、自噬）來(lái)促進(jìn)成骨分化。最終目標(biāo)是構(gòu)建一種兼具成骨、抗菌和光熱治療功能的多功能骨修復(fù)材料，為臨床治療骨缺損提供新的策略和理論支持。該文章于2025年1月23日以《Improved Black Phosphorus Nanocomposite Hydrogel for Bone Defect Repairing: Mechanisms for Advancing Osteogenesis》為題發(fā)表于《Advanced Healthcare Materials》（DOI：10.1002/adhm.202404934）。

研究示意圖

（1）BP和SiPc-NH2顆粒的生物相容性及合成比例研究

為了研究BP和SiPc-NH₂在細(xì)胞培養(yǎng)應(yīng)用中的最佳濃度，首先評(píng)估了BP和SiPc-NH₂對(duì)大鼠成骨細(xì)胞（rOBs）活力的影響。通過(guò)CCK-8檢測(cè)了1、3、5天后的細(xì)胞增殖情況，結(jié)果顯示在1 μM濃度下，BP和SiPc-NH₂的增殖活性隨時(shí)間變化顯著不同。SiPc-NH₂在第3天和第5天表現(xiàn)出增殖增加，表明其對(duì)細(xì)胞活力具有時(shí)間依賴性增強(qiáng)作用。相反，BP在同一時(shí)間段內(nèi)增殖活性下降，表明其對(duì)細(xì)胞活力具有時(shí)間依賴性抑制作用（圖1b）。通過(guò)活死染色檢測(cè)BP和SiPc-NH₂顆粒，結(jié)果顯示所有組中均有大量活細(xì)胞，僅少數(shù)細(xì)胞死亡，與陰性對(duì)照組（NC組）相比無(wú)顯著差異（圖1a,c）。

隨后，采用堿性磷酸酶（ALP）染色法評(píng)估BP對(duì)rOBs成骨分化的調(diào)控作用，并探索BP和SiPc-NH₂的最佳成骨濃度。結(jié)果表明，BP濃度為6μg/mL時(shí)，ALP染色強(qiáng)度最高，表明其成骨潛力最強(qiáng)。而在較低（1μg/mL）和較高（12μg/mL）濃度下，ALP染色強(qiáng)度減弱，表明成骨能力下降（圖1d）。此外，研究發(fā)現(xiàn)SiPc-NH₂濃度在0至75 mg/L范圍內(nèi)，ALP染色結(jié)果無(wú)顯著差異，表明該濃度范圍內(nèi)無(wú)明顯成骨效果。因此，確定了BP與SiPc-NH₂的最佳合成比例為1:10，即少量BP與足量SiPc-NH₂充分混合。

圖1. BP和SiPc-NH2粒子的生物相容性和合成比例的研究。（a）來(lái)自NC、SiPc-NH₂和BP組中的活/死測(cè)定的代表性圖像；（b）來(lái)自NC、SiPc-NH₂和BP組的CCK-8測(cè)定的OD值；（c）顯示每平方毫米活細(xì)胞和死細(xì)胞數(shù)目的活/死測(cè)定；（d）不同濃度的BP和SiPc-NH₂的ALP染色

（2）BP-SiPc-NH₂的表征

采用液相剝離法制備BP納米片，以NMP為剝離劑，有效防止其降解并提高產(chǎn)率。SEM顯示BP為二維片狀結(jié)構(gòu)，液相剝離后形成更小納米片（圖2a）。EDS分析顯示氮、磷、碳和硅在BP表面均勻分布，證明SiPc-NH?成功負(fù)載（圖2b）。FT-IR中出現(xiàn)SiPc-NH?特征峰，進(jìn)一步確認(rèn)其負(fù)載（圖2c）。XPS分析顯示P2p?/?和P2p?/?峰分別在129.7 eV和130.7 eV，額外峰在133.7 eV處（圖2d,e）。SiPc-NH?的引入增加了NIR驅(qū)動(dòng)的ROS生成量（圖2f），改善了BP納米片的分散性（圖2g），可能由于其兩側(cè)氨基基團(tuán)擴(kuò)展。比較BP和BP-PC的降解前后圖像和紫外光譜，發(fā)現(xiàn)BP-PC一個(gè)月內(nèi)部分降解，而BP顯著降解（圖2h,i）。20 W NIR光照射時(shí)，SiPc-NH?顯著提高加熱速率（圖2j,k）。因此，SiPc-NH?增強(qiáng)了BP的熱生成和ROS產(chǎn)生能力，降低了降解速率，改善了分散性，有助于提高生物安全性和抗菌性能。圖2i展示GelMA、BP@GelMA和BP-PC@GelMA的SEM圖像，具有多孔表面結(jié)構(gòu)。在PBS中降解一個(gè)月后，表面粗糙度增加甚至部分損傷，證實(shí)其優(yōu)異的降解性能（圖2m）。在SBF中浸泡兩周后，水凝膠表面形成礦化晶體（圖2n–q）。檢測(cè)水凝膠加熱效果，BP-PC組1分鐘內(nèi)溫度超過(guò)40°C，具有快速升溫殺滅病原菌的潛力（圖2r,s）。

圖2. BP、BP-PC、BP@GelMA和BP-PC@GelMA的表征_{。（a）BP和BP-PC的TEM圖像；（b）BP-PC的元素圖譜；（c）BP和BP-PC的FT-IR光譜；（e）BP和BP-PC的XPS測(cè)量和高分辨率P2p譜；（f）BP和BP-PC在不同濃度（10、15、20 mg L}?1）下的ROS生成量；（g）BP和BP-PC在不同濃度（10、15、20 mg L?1）下的分散穩(wěn)定性；（h）降解前后BP-PC的照片和UV光譜；（i）降解前后BP的照片和UV光譜；（j，k）在808 nm NIR光照射（功率密度為2.0 W cm?2）下，記錄BP和BP-PC的溫度變化；（l）GelMA、BP@GelMA和BP-PC@GelMA的SEM圖像；（m）在不同組的PBS中降解一個(gè)月后的表面形態(tài)；（n-q）在SBF中浸泡兩周后不同組的表面礦化結(jié)果；（r，s）當(dāng)用808 nm NIR光（功率密度2.0 W cm?2）照射時(shí)，不同基團(tuán)下的水凝膠的溫度響應(yīng)效應(yīng)

（3）BP@GelMA和BP-PC@GelMA成骨性能的研究

為了進(jìn)一步分析BP@GelMA和BP-PC@GelMA中的細(xì)胞活力，采用了活死染色技術(shù)。結(jié)果顯示，所有實(shí)驗(yàn)組中均有大量活細(xì)胞，僅少數(shù)細(xì)胞死亡，與NC組相比無(wú)顯著差異（圖3a）。隨后，研究了BP@GelMA和BP-PC@GelMA的最佳成骨濃度，以確定后續(xù)實(shí)驗(yàn)的濃度。分析顯示，在0–25 μg/mL濃度范圍內(nèi)，ALP染色結(jié)果與NC組相比有顯著差異，顯示出良好的成骨效果，且隨著濃度增加效果增強(qiáng)（圖3b）。綜合考慮生物相容性和成骨潛力，后續(xù)實(shí)驗(yàn)中使用25 μg/mL的BP@GelMA和BP-PC@GelMA。

此外，研究了BP@GelMA和BP-PC@GelMA對(duì)細(xì)胞遷移的影響。在培養(yǎng)12和24小時(shí)后，Transwell實(shí)驗(yàn)和劃痕實(shí)驗(yàn)顯示，兩種材料均顯著增強(qiáng)了rOBs的遷移能力（圖3c,d）。值得注意的是，BP-PC@GelMA組的遷移細(xì)胞數(shù)量更多，顯示出更顯著的促遷移效果。此外，劃痕實(shí)驗(yàn)表明，BP-PC@GelMA組在24小時(shí)后實(shí)現(xiàn)了100%的愈合率，凸顯了其在促進(jìn)細(xì)胞遷移和組織再生方面的功效。接下來(lái)，研究了BP@GelMA和BP-PC@GelMA復(fù)合材料的成骨潛力。ALP是早期成骨細(xì)胞分化的關(guān)鍵標(biāo)志物。在誘導(dǎo)的第7天，ALP染色顯示BP-PC@GelMA組的ALP含量升高，表明BP-PC@GelMA涂層促進(jìn)了成骨細(xì)胞分化（圖3e）。在誘導(dǎo)的第14天，礦化結(jié)節(jié)的形成也顯示出類似的結(jié)果，支持其作為晚期成骨分化的關(guān)鍵指標(biāo)。在先前的研究中，已確定GelMA不影響rOBs的增殖或成骨分化。因此，未單獨(dú)設(shè)置GelMA組進(jìn)行比較分析。關(guān)于成骨相關(guān)蛋白的表達(dá)，BP-PC@GelMA組的RUNX2、ALP和COL-1水平顯著升高（圖3f）。

圖3. BP@GelMA和BP-PC@GelMA的成骨潛力研究_{。（a）存活/死亡試驗(yàn)的代表性圖像；（b）不同濃度的BP@GelMA和BP-PC@GelMA的ALP染色；（c，d）在不同組下培養(yǎng)12和24小時(shí)后進(jìn)行的Transwell和劃痕試驗(yàn)；（e）每組ALP和ARS染色的代表性圖像；（f）成骨分化相關(guān)蛋白ALP、COL-1和RUNX2在不同組間rOB中的表達(dá)水平}

（4）BP@GelMA和BP-PC@GelMA的體外光熱抗菌效果研究

如圖4a,b所示，在沒(méi)有近紅外（NIR）照射的情況下，所有實(shí)驗(yàn)組均顯示出顯著的細(xì)菌生長(zhǎng)，瓊脂平板上存在大量金黃色葡萄球菌和大腸桿菌菌落。在NIR光照射3分鐘后，BP@GelMA和BP-PC@GelMA組均表現(xiàn)出顯著的光熱效應(yīng)。BP@GelMA組中仍殘留少量孤立的細(xì)菌菌落，而BP-PC@GelMA組的菌落幾乎完全被清除。將NIR照射時(shí)間延長(zhǎng)至5分鐘后，兩組的細(xì)菌菌落數(shù)量急劇減少，幾乎完全消失。進(jìn)一步的定量分析表明，經(jīng)過(guò)3分鐘NIR照射后，BP@GelMA對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抗菌率分別達(dá)到98%和99.7%。5分鐘后，抗菌率保持在100%。對(duì)于BP-PC@GelMA組，僅需3分鐘NIR照射即可對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌達(dá)到100%的抗菌率，5分鐘后效果仍保持在100%。相應(yīng)的掃描電子顯微鏡（SEM）圖像顯示，SiPc-NH₂的引入增強(qiáng)了NIR輻射觸發(fā)的抗菌效果。這些效果表現(xiàn)為顯著的細(xì)胞皺縮、細(xì)菌聚集和模糊的細(xì)胞邊界，表明細(xì)菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)受損?；钏廊旧@示，BP-PC@GelMA組中活菌密度較低，需進(jìn)一步研究（圖4c）。總體而言，這些發(fā)現(xiàn)證實(shí)了光熱療法能夠有效破壞微生物結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致其死亡和清除（圖4d）。

圖4. BP@GelMA和BP-PC@GelMA的體外光熱抗菌作用_{。（a）金黃色葡萄球菌（S. aureus）在808 nm近紅外光（功率密度2.0 W cm}?2）照射3分鐘和5分鐘后的生長(zhǎng)情況；（b）大腸桿菌（E. coli）在808 nm近紅外光（功率密度2.0 W cm?2）照射3分鐘和5分鐘后的生長(zhǎng)情況；（c）BP和BP-PC處理之前和之后，細(xì)菌的SEM圖像及細(xì)菌菌落的代表性活/死測(cè)定圖像；（d）BP-PC抗菌機(jī)理示意圖

（5）BP-PC@GelMA增強(qiáng)大鼠顱骨缺損的體內(nèi)修復(fù)

為了評(píng)估體內(nèi)骨再生的效果，將三種不同的水凝膠構(gòu)建體GelMA、BP@GelMA和BP-PC@GelMA植入SD大鼠的顱骨缺損中，持續(xù)4周或8周（圖5a）。術(shù)后所有四組SD大鼠恢復(fù)良好，未出現(xiàn)因?qū)嶒?yàn)干預(yù)導(dǎo)致的死亡。

為了研究BP-PC@GelMA水凝膠對(duì)骨缺損愈合的影響，通過(guò)Micro-CT分析觀察了NC組、GelMA組、BP@GelMA組和BP-PC@GelMA組中新骨的形成情況。術(shù)后4周和8周，NC組和GelMA組在手術(shù)區(qū)域顯示出明顯的骨缺損。相比之下，BP-PC@GelMA組與其他三組相比，新骨形成顯著增強(qiáng)（圖5b）。通過(guò)定量形態(tài)學(xué)分析感興趣區(qū)域（ROI），BP-PC@GelMA組在術(shù)后4周的骨體積與組織體積比（BV/TV）顯著高于其他三組。術(shù)后8周，BP-PC@GelMA組的BV/TV達(dá)到68.08%，顯著超過(guò)其他組。此外，術(shù)后4周，BP-PC@GelMA組的骨小梁分離度（Tb.Sp）為0.72μm，顯著低于其他組。術(shù)后8周，BP-PC@GelMA組的Tb.Sp為0.45μm，顯著低于其他組（圖5c）。

通過(guò)HE染色和Masson三色染色評(píng)估新骨的質(zhì)量和數(shù)量。結(jié)果顯示，在術(shù)后4周時(shí)，BP@GelMA和BP-PC@GelMA組顯示出顯著的骨再生增強(qiáng)。這些組中新骨小梁的形成增加，表明成骨活性增強(qiáng)。在術(shù)后8周時(shí)，BP@GelMA和BP-PC@GelMA組顯示出新骨體積的逐步增加，其缺損邊緣和表面，成熟骨呈現(xiàn)深紅色，與NC組和GelMA組中藍(lán)色染色的新骨形成鮮明對(duì)比，表明BP@GelMA和BP-PC@GelMA支架在再生過(guò)程中促進(jìn)了更高水平的礦化和成熟（圖5d）。為了進(jìn)一步研究骨再生過(guò)程中的成骨分化，進(jìn)行了堿性磷酸酶（ALP）和I型膠原（COL-1）的免疫組化（IHC）染色。BP-PC@GelMA組中ALP和COL-1陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量顯著高于其他兩組（圖5e）。這表明BP-PC@GelMA有效增強(qiáng)了成骨分化并促進(jìn)了骨再生。

圖5. BP-PC@GelMA可增強(qiáng)顱骨缺損的體內(nèi)修復(fù)_{。（a）大鼠治療方案示意圖；（b）大鼠顱骨缺損的三維micro-CT掃描圖像；（c）骨體積分?jǐn)?shù)（BV/TV）和骨小梁間距（Tb.Sp.）的定量分析；（d）術(shù)后4周和8周時(shí)顱骨缺損的蘇木精-伊紅（HE）染色和Masson三色染色圖像；（e）顱骨缺損后8周進(jìn)行的堿性磷酸酶（ALP）和Ⅰ型膠原（COL-1）免疫組化（IHC）染色}

（6）對(duì)BP-PC@GelMA處理的rOBs進(jìn)行定量蛋白質(zhì)組學(xué)測(cè)序分析

通過(guò)設(shè)定閾值（|log2 FC|≥0 and q-value≤0.05），篩選出差異表達(dá)蛋白（DEGs）?；鹕綀D顯示，BP-PC@GelMA組中共有254個(gè)基因表達(dá)發(fā)生顯著變化，其中157個(gè)上調(diào)，97個(gè)下調(diào)（圖6a）。熱圖中展示了前20個(gè)差異最顯著的基因（圖6b）。關(guān)鍵差異基因：Sle25a11（維持線粒體融合/分裂事件及嵴的形態(tài)，通過(guò)調(diào)節(jié)線粒體谷胱甘肽水平抑制細(xì)胞凋亡）、SDHC（參與線粒體電子傳遞鏈復(fù)合體II）、Hk2（維持線粒體外膜完整性，防止促凋亡分子釋放）、STX17（調(diào)控自噬體與溶酶體膜的融合）和 Mtfr11（調(diào)控線粒體形態(tài)穩(wěn)態(tài)及AMPK依賴的應(yīng)激誘導(dǎo)線粒體碎片化）。亞細(xì)胞定位分析顯示，12.2%的差異蛋白定位于線粒體（圖6c）。KEGG通路富集分析表明，BP-PC的成骨機(jī)制可能與溶酶體、自噬、氧化磷酸化及三羧酸循環(huán)（TCA）相關(guān)（圖6d）。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，Hippo和Wnt信號(hào)通路顯著富集（圖6e）。基因本體（GO）富集分析顯示，11.24%的差異蛋白與線粒體相關(guān)（圖6f）?；蚣患治觯℅SEA）證實(shí)，BP-PC處理的rOBs中Wnt信號(hào)通路上調(diào)，Hippo信號(hào)通路下調(diào)，氧化磷酸化相關(guān)通路活性增強(qiáng)，而ROS相關(guān)通路活性降低（圖6g）。

圖6. 定量蛋白質(zhì)組學(xué)測(cè)序分析_{。（a）對(duì)照組和BP-PC組之間差異蛋白質(zhì)組學(xué)分析的火山圖；（b）對(duì)照組和BP-PC組中差異蛋白質(zhì)的熱圖；（c）對(duì)照組和BP-PC組中差異蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位結(jié)果的餅圖；（d，e）對(duì)照組和BP-PC組差異蛋白KEGG富集分析的條形圖和氣泡圖；（f）對(duì)照組和BP-PC組的差異蛋白GO富集分析條形圖；（g）Hippo、Wnt、氧化磷酸化和ROS富集狀態(tài)的GSEA分析}

（7）BP-PC@GelMA通過(guò)Hippo和Wnt/β-連環(huán)蛋白信號(hào)通路的串?dāng)_調(diào)控線粒體穩(wěn)態(tài)

基于KEGG定量蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果，評(píng)估不同BP和BP-PC處理下β-連環(huán)蛋白、YAP和TEAD的表達(dá)。BP-PC處理后，β-連環(huán)蛋白、YAP和TEAD表達(dá)顯著增加（圖7a）。為研究BP-PC@GelMA促進(jìn)成骨機(jī)制，評(píng)估其對(duì)rOBs線粒體功能和形態(tài)影響。TEM觀察發(fā)現(xiàn)，成骨誘導(dǎo)結(jié)合BP-PC@GelMA處理后，短棒狀線粒體數(shù)量顯著增加（圖7d）。MitoTracker染色顯示，BP-PC@GelMA處理后，rOBs線粒體呈分散網(wǎng)狀，圓形線粒體比例增加（圖7b）。定量分析表明，該組單個(gè)線粒體數(shù)量和分裂增加，網(wǎng)絡(luò)數(shù)量減少（圖7c）。進(jìn)一步評(píng)估線粒體功能，結(jié)果顯示BP-PC@GelMA組線粒體ATP輸出最高，表明其增強(qiáng)了rOBs線粒體ATP生成（圖7e）。此外，檢測(cè)BP-PC@GelMA清除細(xì)胞內(nèi)ROS能力，使用DCFH-DA評(píng)估ROS清除情況（圖7f）。H?O?刺激模擬高ROS環(huán)境。使用JC-1和MitoSOX Deep Red評(píng)估線粒體膜電位和ROS生成。共定位結(jié)果顯示，ROS誘導(dǎo)下，JC-1聚集體/單體比例顯著降低（圖7g），表明線粒體去極化和功能受損。為研究Hippo和Wnt信號(hào)通路串?dāng)_對(duì)線粒體穩(wěn)態(tài)影響，使用拮抗劑LF3和IK-930。通過(guò)TMRM染色分析線粒體膜電位，發(fā)現(xiàn)LF3和IK-930處理后膜電位降低（圖7h）。MitoTracker染色顯示，處理后rOBs線粒體數(shù)量和熒光強(qiáng)度減少，形成稀疏網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，遠(yuǎn)離細(xì)胞核。Hoechst染色顯示核熒光增強(qiáng)，提示潛在凋亡（圖7i,j）。TEM觀察到線粒體數(shù)量減少，多融合為拉長(zhǎng)形態(tài)（圖7k）。評(píng)估線粒體功能，結(jié)果顯示ATP輸出減少，降低rOBs中ATP生成（圖7l）。

圖7. BP-PC@GelMA對(duì)線粒體功能的影響_{。（a）β-連環(huán)蛋白、YAP、TEAD蛋白的表達(dá)及其定量分析；（b）通過(guò)激光共聚焦顯微鏡觀察rOBs線粒體網(wǎng)絡(luò)的形態(tài)學(xué)變化；（c）使用Kruskal-Wallis檢驗(yàn)對(duì)個(gè)體線粒體計(jì)數(shù)、足跡和網(wǎng)絡(luò)數(shù)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析；（d）通過(guò)透射電鏡觀察rOBs線粒體形態(tài)；（e）測(cè)定不同處理下rOBs線粒體ATP的產(chǎn)生；（f）不同處理組的ROS染色；（g）JC-1和mtSOX深紅色在不同處理組中的共定位染色；（h）不同組織的TMRM染色模式在各治療組中的表現(xiàn)；（i）通過(guò)激光共聚焦顯微鏡觀察線粒體動(dòng)力學(xué)的變化；（j）使用Kruskal-Wallis檢驗(yàn)對(duì)個(gè)體線粒體計(jì)數(shù)和網(wǎng)絡(luò)數(shù)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；（k）用LF3和IK-980處理后，通過(guò)TEM檢查rOBs的線粒體形態(tài)；（l）測(cè)定不同處理下rOBs線粒體ATP的產(chǎn)生}

（8）BP-PC@GelMA通過(guò)增強(qiáng)線粒體動(dòng)態(tài)依賴性成骨分化促進(jìn)成骨

分析了rOBs中線粒體分裂和融合標(biāo)志蛋白的表達(dá)模式，重點(diǎn)關(guān)注分裂相關(guān)Drp1、FIS1和MFF，以及融合相關(guān)Mfn1、Mfn2和OPA1。BP-PC@GelMA處理后，分裂相關(guān)基因Drp1和FIS1表達(dá)上調(diào)，F(xiàn)IS1表達(dá)量較NC組增加近四倍，MFF表達(dá)不變；融合標(biāo)志物中Mfn2表達(dá)增加，OPA1減少，Mfn1無(wú)明顯變化（圖8a）。MitoTracker活細(xì)胞成像顯示rOBs中線粒體分裂活躍（圖8b）。推測(cè)BP-PC@GelMA可能通過(guò)調(diào)控線粒體動(dòng)態(tài)影響分裂融合過(guò)程，發(fā)揮促成骨作用。

隨后，研究敲除FIS1對(duì)BP-PC@GelMA處理的rOBs線粒體動(dòng)態(tài)和成骨分化的影響。設(shè)計(jì)三條靶向FIS1的siRNA序列，選敲除效率最高的siFIS1-3（圖8c）。FIS1干擾使線粒體形態(tài)從松散環(huán)形變緊密網(wǎng)狀，長(zhǎng)度和表面積顯著增加（圖8d,e）。同時(shí)，BP-PC@GelMA處理后，成骨標(biāo)志物RUNX2、ALP和COL-1表達(dá)水平較NC組顯著下降（圖8f）。ALP染色和活性檢測(cè)結(jié)果一致，表明FIS1下調(diào)減弱BP-PC@GelMA對(duì)rOBs成骨分化的促進(jìn)作用（圖8g）。因此，BP-PC@GelMA通過(guò)調(diào)控線粒體動(dòng)態(tài)促進(jìn)rOBs成骨分化。

圖8. BP-PC@GelMA通過(guò)線粒體動(dòng)力學(xué)促進(jìn)成骨細(xì)胞分化_{。（a）處理7天后，通過(guò)PCR分析線粒體分裂（DRP1、FIS1、MFF）和融合標(biāo)記（MFN1、MFN2、OPA1）的表達(dá)；（b）使用激光共聚焦顯微鏡，通過(guò)MitoTracker對(duì)rOB進(jìn)行活細(xì)胞成像；（c）轉(zhuǎn)染后24小時(shí)，通過(guò)PCR證實(shí)最有效的FIS1敲除序列；（d）通過(guò)共聚焦顯微鏡評(píng)估線粒體網(wǎng)絡(luò)形態(tài)；（e）線粒體形態(tài)學(xué)的統(tǒng)計(jì)分析；（f）通過(guò)PCR評(píng)價(jià)各組間ALP、Runx2和Col-1的表達(dá)水平；（g）處理組（NC、siFIS1、siFIS1 + BP-PC）的相應(yīng)ALP染色結(jié)果}

（9）BP-PC@GelMA作為線粒體質(zhì)量控制（MQC）平臺(tái)增強(qiáng)rOBs的分化

為了研究BP-PC@GelMA處理后rOBs中線粒體自噬水平的變化，通過(guò)Western blot分析量化了rOBs中線粒體自噬標(biāo)志物L(fēng)C3的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，BP-PC@GelMA處理組的LC3表達(dá)顯著增加，表明該處理可能通過(guò)線粒體動(dòng)態(tài)的變化增強(qiáng)了線粒體自噬（圖9b,c）。LysoTracker Deep Red和MitoTracker Green FM的共定位為線粒體自噬的發(fā)生提供了有力證據(jù)，線粒體自噬是一種針對(duì)功能失調(diào)線粒體的重要細(xì)胞回收過(guò)程。在本研究中，這兩種熒光染料被用于有效監(jiān)測(cè)線粒體自噬的動(dòng)態(tài)。值得注意的是，成骨細(xì)胞（OBs）中溶酶體活性顯著增強(qiáng)，表現(xiàn)為L(zhǎng)ysoTracker Red熒光增加，同時(shí)GFP和LysoTracker Red陽(yáng)性（黃色）區(qū)域顯著增多，表明其積極參與線粒體自噬過(guò)程（圖9a）。為了研究線粒體生物發(fā)生是否在線粒體數(shù)量增加中起作用，檢測(cè)了rOBs中線粒體生物發(fā)生標(biāo)志物的表達(dá)。結(jié)果顯示，BP-PC@GelMA處理顯著提高了NRF1的表達(dá)，而TFAM的表達(dá)顯著降低。PGC-1α和NRF2的表達(dá)無(wú)明顯變化。此外，BP@GelMA組的NRF1和PGC-1α水平顯著增加。因此，推測(cè)BP納米片可能是通過(guò)BP-PC@GelMA處理促進(jìn)線粒體生物發(fā)生的關(guān)鍵成分（圖9d）。

圖9. BP-PC@GelMA通過(guò)MQC促進(jìn)成骨細(xì)胞分化_{。（a）用LysoTracker}? _{Red和MitoTracker?綠色FM進(jìn)行共定位染色；（b）自噬相關(guān)蛋白（LC3）的Western印跡分析；（c）LC3表達(dá)的定量分析；（d）線粒體生物發(fā)生相關(guān)基因（NRF1、PGC-1α、NRF2、TFAM）的PCR分析}