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針對上述問題，南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院周敏團(tuán)隊(duì)開發(fā)了一種響應(yīng)式的載有rAAVs的微針貼片（AMNP），用于治療內(nèi)膜增生，實(shí)現(xiàn)血管周圍的基因遞送。這些補(bǔ)片主要由生物相容性明膠組成，尖端內(nèi)嵌 rAAVs 用于血管周圍基因遞送，后層混合多巴胺用于粘附和響應(yīng)。得益于多巴胺成分，補(bǔ)片不僅實(shí)現(xiàn)了與血管內(nèi)膜的緊密附著，還延長了用于基因治療的 rAAVs 的轉(zhuǎn)染時(shí)間。通過 rAAVs 過表達(dá) miR-145 可以調(diào)節(jié)平滑肌細(xì)胞的表型，從而緩解血管內(nèi)膜增生?；谶@些特點(diǎn)，在大鼠頸動脈模型中評估了 AMNP 的實(shí)用性，結(jié)果表明 AMNP 能夠有效抑制或潛在逆轉(zhuǎn)內(nèi)膜增生的進(jìn)展。這些結(jié)果表明，AMNP 很有希望成為治療各種血管疾病的方法，因此具有廣闊的臨床應(yīng)用前景。該文章于2024年11月15日以《Multifunctional Microneedle Patches for Perivascular Gene Delivery and Treatment of Vascular Intimal Hyperplasia》為題發(fā)表于《ACS Nano》（DOI: 10.1021/acsnano.4c09527）。

研究示意圖

（1）微針貼片的制備和表征

圖1a呈現(xiàn)了明膠微針貼片的制備過程：首先，含有rAAVs的明膠溶液被加入模具中，并通過離心作用富集到微針尖端；隨后，加入摻雜不同濃度多巴胺（DA）的明膠溶液以形成背襯層；最后，經(jīng)過冷凍干燥或空氣干燥，制成完整的rAAVs負(fù)載微針貼片。圖1b為氫核磁共振（H NMR）光譜分析圖，揭示了多巴胺摻入明膠后不同濃度下的化學(xué)特征變化。其中，“Gel”代表純明膠，“Gel-LDA”為低濃度多巴胺組，“Gel-HDA”為高濃度多巴胺組。圖1c進(jìn)一步通過傅里葉變換紅外光譜（FTIR）分析，證實(shí)了多巴胺成功引入明膠材料中，特征峰的差異清晰展現(xiàn)了不同組分之間的化學(xué)結(jié)構(gòu)變化。圖1d展示了顯微鏡下不同干燥方法（空氣干燥和冷凍干燥）制備的微針貼片外觀對比。結(jié)果顯示，冷凍干燥制備的微針針尖更尖銳且排列更規(guī)整，而多巴胺的加入并未明顯影響針尖外形及孔隙結(jié)構(gòu)。圖1e通過掃描電子顯微鏡（SEM）觀察到微針內(nèi)部結(jié)構(gòu)的差異：冷凍干燥的微針內(nèi)部呈現(xiàn)多孔結(jié)構(gòu)，而空氣干燥的微針內(nèi)部則較為致密。這表明冷凍干燥方法更適合病毒載體（rAAVs）的穩(wěn)定保存。

圖1 微針貼片的制備和表征。（a）制作過程示意圖；（b）多巴胺（DA）和無（Gel）、低多巴胺（Gel-LDA）和高多巴胺（Gel-HDA）濃度明膠貼片的傅里葉變換紅外光譜（FTIR）；（c）凝膠、凝膠-LDA、凝膠-HDA貼片和多巴胺的1H NMR；（d）使用不同技術(shù)制作的微針的顯微照片：（i, i', iii, iii'）空氣干燥和（ii, ii', iv, iv'）冷凍干燥；（e）使用不同技術(shù)制作的微針的掃描電子顯微鏡（SEM）圖像：（i, i', iii, iii'）空氣干燥和（ii, ii', iv, iv'）冷凍干燥。比例尺：（d, i-iv）為250 μm，（d, i'-iv'）為100 μm，（e, i-iv）為40 μm，（e, i'-iv'）為8 μm

（2）MN的機(jī)械性能和粘附性測試

圖2展示了明膠微針貼片的化學(xué)交聯(lián)機(jī)制、界面黏附性能及相關(guān)力學(xué)測試結(jié)果。圖2a呈現(xiàn)了明膠與多巴胺在高碘酸鈉（NaIO?）催化下進(jìn)行交聯(lián)反應(yīng)的化學(xué)過程，揭示了明膠與多巴胺分子之間的化學(xué)交聯(lián)機(jī)制；圖2b展示了明膠-多巴胺（Gel-DA）水凝膠與組織之間的界面黏附機(jī)制，通過功能基團(tuán)與組織表面的相互作用實(shí)現(xiàn)了較強(qiáng)的界面黏附性能。圖2c為三組不同微針貼片（純明膠Gel、低濃度多巴胺Gel-LDA、高濃度多巴胺Gel-HDA）的外觀照片以及微針在不同受力（壓縮）狀態(tài)下的形態(tài)變化，結(jié)果顯示所有微針尖端均在相似受力下發(fā)生彎曲或折斷；圖2d為微針貼片的受力-位移曲線圖，反映了不同微針貼片在壓縮條件下的機(jī)械強(qiáng)度及受力情況；圖2e為柱狀圖，測試了不同濃度明膠對微針最大耐受壓縮力的影響，發(fā)現(xiàn)明膠濃度增加可增強(qiáng)微針的機(jī)械強(qiáng)度，而多巴胺濃度對微針的機(jī)械強(qiáng)度影響不明顯。圖2f和g分別為搭接剪切測試（lap shear test）的示意圖及典型的受力-位移曲線圖，用于評估微針貼片與組織的剪切強(qiáng)度；圖2h和i為拉伸測試（tensile test）的示意圖及典型的受力-位移曲線圖，用于評估微針貼片與組織界面的拉伸強(qiáng)度；圖2j和k為180°剝離測試（peel test）的示意圖及典型的受力-位移曲線圖，用于評估微針貼片與組織間的剝離強(qiáng)度與黏附性能；圖2l為剪切強(qiáng)度與拉伸強(qiáng)度的柱狀圖對比分析，表明含高濃度多巴胺（Gel-HDA）組的黏附強(qiáng)度遠(yuǎn)高于純明膠（Gel）組，說明多巴胺顯著增強(qiáng)了貼片的組織黏附性能；圖2m為黏附能的柱狀圖比較，結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)高濃度多巴胺（Gel-HDA）能夠明顯提高微針貼片與組織界面的黏附能量。綜上所述，這些結(jié)果表明多巴胺的加入雖然未明顯提高微針本身的機(jī)械強(qiáng)度，但顯著增強(qiáng)了微針貼片對組織的黏附性，使其更適合用于局部藥物遞送。

圖2 微針的機(jī)械性能和粘附性測試。（a）合成過程示意圖；（b）Gel-DA交聯(lián)和粘附組織的原理示意圖；（c）微針在機(jī)械強(qiáng)度測試前（i-i', i-ii'', iii-iii''）和測試后（i''-iii'''）的光學(xué)圖像；（d）不同凝膠-DA比率的微針的軸向斷裂力；（e）具有代表性的微針剝離力隨時(shí)間變化的曲線；（f-m）測量三種不同貼片在豬主動脈膜上的粘附性能：（f, h, j）剪切、拉伸和剝離過程的示意圖和照片；（g, i, k）相應(yīng)的力-位移曲線；（l）剪切強(qiáng)度和拉伸強(qiáng)度統(tǒng)計(jì)；（m）界面韌性統(tǒng)計(jì)

（3）微針穿透和降解性能的表征

圖3a為微針貼片應(yīng)用于血管的示意圖，展示了微針如何穿透血管外膜，實(shí)現(xiàn)病毒載體（rAAVs）的快速釋放，同時(shí)背襯層則實(shí)現(xiàn)病毒載體的持續(xù)緩釋。圖3b是熒光顯微鏡下微針尖端裝載熒光納米顆粒（模擬病毒顆粒）的圖像，證實(shí)了微針尖端成功負(fù)載藥物。圖3c為微針穿透瓊脂凝膠后的光學(xué)和熒光顯微鏡圖像，展示了清晰的穿刺孔和顆粒釋放擴(kuò)散情況，證實(shí)了微針的穿透和藥物釋放能力。圖3d通過激光共聚焦顯微鏡（LSCM）拍攝了微針穿透離體豬動脈組織后熒光顆粒的組織內(nèi)分布情況，說明微針具備有效穿透血管并深度釋放藥物的能力，釋放深度可達(dá)約350 μm。圖3e和f分別展示了三種成分的微針尖端（Gel、Gel-LDA、Gel-HDA）和背襯層在PBS中不同時(shí)間點(diǎn)的降解狀態(tài)，結(jié)果顯示多巴胺的加入顯著延長了微針尖端的降解時(shí)間，且隨著多巴胺濃度的升高，背襯層的降解速度顯著降低。圖3g為三種微針貼片材料在PBS中降解過程中重量損失的定量曲線圖，明確展現(xiàn)了多巴胺濃度升高后降解速率顯著降低的趨勢。圖3h進(jìn)一步展示了高濃度多巴胺組（Gel-HDA）的背襯層在PBS中隨時(shí)間推移的降解百分比變化曲線，說明Gel-HDA背襯層具有長效穩(wěn)定性，有助于長期持續(xù)藥物釋放。以上圖示結(jié)果證實(shí)了微針貼片良好的穿刺能力、藥物釋放性能，以及多巴胺加入顯著延長降解時(shí)間，有助于更好的臨床應(yīng)用效果。

圖3 微針穿透和降解性能的表征。（a）可溶解微針和在針尖釋放rAAVs的示意圖；（b）頭端帶有熒光納米顆粒的微針貼片的宏觀圖像；（c）插入瓊脂糖凝膠后針孔周圍染色的熒光顯微鏡圖像；（d）插入豬主動脈后微針孔的激光掃描共聚焦顯微鏡（LSCM）圖像；（e）微針在37°C下的溶解過程；（f）37°C下，貼片背層在PBS中的溶解過程；（g）背襯層的降解率（n=3，獨(dú)立樣本）。比例尺：（b）為100 μm，（c）為150 μm，（d）為100 μm，（e）為150 μm，（f）為500 μm

（4）微針貼片中 rAAV 的轉(zhuǎn)染能力

圖4a為微針貼片體外實(shí)驗(yàn)的總體流程示意圖，展示了負(fù)載rAAV-GFP的微針貼片（AMNP）與動脈平滑肌細(xì)胞（VSMCs）共培養(yǎng)的過程，用于評估病毒顆粒（rAAVs）的轉(zhuǎn)染效率和生物相容性。圖4b通過激光共聚焦顯微鏡（LSCM）觀察了不同處理組（空白組、直接加入rAAV-GFP組、微針貼片負(fù)載rAAV-GFP組）平滑肌細(xì)胞內(nèi)綠色熒光蛋白（GFP）的表達(dá)情況，其中綠色熒光強(qiáng)度直接反映了病毒的基因轉(zhuǎn)染效率，結(jié)果顯示微針貼片的轉(zhuǎn)染效果與直接加入病毒的轉(zhuǎn)染效果類似，但微針制備過程略微降低了病毒活性。圖4c-e為流式細(xì)胞術(shù)（FCM）對不同處理組VSMCs轉(zhuǎn)染GFP的陽性率分析圖：圖4c為空白對照組細(xì)胞未見明顯熒光；圖4d為直接用病毒（rAAV-GFP）轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，GFP表達(dá)陽性率較高；圖4e為微針貼片（rAAV-GFP patch）轉(zhuǎn)染的VSMCs組，其轉(zhuǎn)染率略低于直接病毒轉(zhuǎn)染組。圖4f為不同處理組細(xì)胞（血管平滑肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞）的活性染色圖像（細(xì)胞存活染色），其中空白組為陽性對照，Negative為陰性對照，Patch為實(shí)驗(yàn)組，結(jié)果顯示微針貼片組的細(xì)胞存活狀態(tài)良好，與空白組相似，表明微針貼片具有良好的細(xì)胞相容性。圖4g為含病毒的明膠微針貼片對細(xì)胞（內(nèi)皮細(xì)胞和VSMCs）的細(xì)胞毒性評價(jià)（OD值測定），結(jié)果顯示各實(shí)驗(yàn)組的OD值與對照組差異不明顯，進(jìn)一步證實(shí)微針貼片對細(xì)胞無明顯毒性，具有良好的生物相容性。圖4h為不同處理組中GFP陽性細(xì)胞比例的統(tǒng)計(jì)結(jié)果柱狀圖，結(jié)果表明微針處理后病毒顆粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞的比例稍低于直接病毒組，說明凍干過程輕微降低了病毒載體的轉(zhuǎn)染活性，但整體仍保持較高的轉(zhuǎn)染效率。

圖4 微針貼片中rAAV的轉(zhuǎn)染能力。（a）rAAV和ASMCs共培養(yǎng)、觀察和分析示意圖；（b）GFP陽性ASMCs的激光掃描共聚焦顯微鏡（LSCM）圖像及DAPI和F-actin染色；（c-e）轉(zhuǎn)染rAAVs的ASMCs的GFP陽性細(xì)胞圖像和流式細(xì)胞術(shù)分析；（f）活細(xì)胞和死細(xì)胞染色；（g）ECs和ASMCs的CCK-8染色；（h）共培養(yǎng)后平均熒光強(qiáng)度分析；（i）共培養(yǎng)后GFP陽性細(xì)胞百分比分析。n=5，獨(dú)立樣本。比例尺：（b）為60 μm，（c-f）為100 μm

（5）rAAV-MN 貼片處理新內(nèi)膜增生模型的結(jié)果

圖5a為微針貼片治療新生內(nèi)膜增生的示意圖，描述了通過球囊導(dǎo)管損傷血管內(nèi)膜建立動物模型后，將微針貼片貼附于血管外膜，通過釋放病毒載體（rAAVs）進(jìn)行基因治療，實(shí)現(xiàn)局部基因治療的機(jī)制。圖5b為活體熒光成像，顯示不同處理方式（空白組、注射組、微針貼片組）的病毒轉(zhuǎn)染效率差異。結(jié)果顯示，微針貼片組在左側(cè)頸動脈區(qū)域局部出現(xiàn)明顯的綠色熒光，表明貼片給藥具有顯著的局部靶向性，而注射給藥和空白組則無明顯局部熒光表達(dá)。圖5c為離體動脈的多種染色分析，包括HE染色（組織結(jié)構(gòu)）、von Kossa染色（鈣沉積）、彈力纖維染色（EVG）以及免疫熒光染色（α-SMA綠色、CD31紅色），用于評估各組動脈組織病變的嚴(yán)重程度。結(jié)果顯示，微針貼片組的內(nèi)膜增生顯著減少，內(nèi)皮層完整性得到改善，驗(yàn)證了微針貼片治療對抑制內(nèi)膜增生的顯著效果。圖5d通過Western blot檢測α-SMA和OPN蛋白的表達(dá)水平，明確微針貼片治療組（Exp）的相關(guān)致病蛋白表達(dá)明顯降低，進(jìn)一步證實(shí)其對內(nèi)膜增生的有效抑制作用。圖5e為彩色多普勒超聲（CDFI）圖像，用于評估各組血管的通暢程度及血流速度。結(jié)果顯示，貼片治療組的血管管腔狹窄情況明顯改善，表明治療效果顯著。圖5f和g分別為骨橋蛋白（OPN）和α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）的定量統(tǒng)計(jì)圖，評估血管內(nèi)膜增生程度。結(jié)果顯示，治療組的OPN和α-SMA表達(dá)水平顯著降低，表明微針貼片有效抑制了病理性內(nèi)膜增生和平滑肌細(xì)胞的異常增殖。圖5h為血管管腔狹窄率柱狀圖，顯示微針貼片組的管腔狹窄率顯著降低，表明治療顯著改善了血管狹窄情況。圖5i為各組治療后不同時(shí)間（0和1個(gè)月）的血流速度比較柱狀圖，證實(shí)貼片組的血流速度接近正常值，說明貼片治療能夠長期有效抑制內(nèi)膜增生導(dǎo)致的血管狹窄。圖5j和k分別為新生內(nèi)膜面積和內(nèi)膜/中膜面積比例的柱狀圖對比，結(jié)果顯示微針貼片治療后新生內(nèi)膜面積明顯減少，內(nèi)膜/中膜面積比例顯著降低，進(jìn)一步驗(yàn)證了微針貼片治療對內(nèi)膜增生的良好抑制效果。

圖5 rAAV-MN貼片處理新內(nèi)膜增生模型的結(jié)果。（a）模型建立、處理和樣本分析的實(shí)驗(yàn)方案示意圖；（b）體內(nèi)成像；（c）1個(gè)月后的Von Kossa、EVG和免疫熒光（IF）染色（綠色α-SMA/紅色CD31/藍(lán)色DAPI）；（d）增殖標(biāo)志蛋白OPN和α-SMA蛋白的Western blot（WB）結(jié)果；（e）術(shù)后1個(gè)月的頸動脈多普勒血流成像；（f）蛋白質(zhì)OPN的WB圖像統(tǒng)計(jì)；（g）蛋白質(zhì)α-SMA的WB圖像統(tǒng)計(jì)；（h）通過qPCR測定的miR-145的表達(dá)；（i）術(shù)后即刻和術(shù)后1個(gè)月的血流速度統(tǒng)計(jì)；（j）內(nèi)膜/中膜比率分析；（k）新內(nèi)膜面積分析。n=4，獨(dú)立樣本。比例尺：100 μm