IF：14.3《Adv.Sci》浙大楊國利：具有免疫反應性和靶向線粒體轉移以增強骨再生的工程分層水凝膠
專欄：學術前沿
發(fā)布日期：2025-02-08
作者：
骨缺損由于老化、嚴重創(chuàng)傷和疾病而普遍存在，對患者的生活質量造成重大影響。盡管傳統的骨替代材料如自體移植、同種異體移植和異種移植在臨床上被廣泛用于骨缺損修復，但它們可能引發(fā)免疫反應和局部炎癥，導致治療失敗并可能加劇病情。炎癥微環(huán)境在骨缺損修復初期的重要性，以及巨噬細胞在調節(jié)骨髓間充質干細胞（BMSC）成骨分化中的關鍵作用。同時，在炎癥環(huán)境下，BMSC的線粒體功能障礙會導致能量代謝異常，阻礙骨再生過程。
然而，目前的治療方法并不能解決由局部炎癥引起的BMSC能量支持不足和線粒體功能障礙問題。巨噬細胞作為先天性免疫細胞，其在骨損傷響應中的極化轉變對正常骨再生至關重要，但目前的治療方法無法有效調節(jié)這一過程。因此，研究者正在尋求新的治療材料和機制，以更有效地控制炎癥反應并促進骨再生。
針對上述問題，浙江大學楊國利、浙江工業(yè)大學楊晉濤及佐治亞理工學院張冬團隊合作開發(fā)一種工程化的分層水凝膠，該水凝膠能夠響應免疫環(huán)境，通過靶向線粒體轉移來恢復BMSC的線粒體生物能量，從而促進骨再生。這種水凝膠結合了抗炎藥物和巨噬細胞靶向的納米凝膠，旨在通過調節(jié)巨噬細胞的極化和增強線粒體功能，為骨缺損治療提供新策略。這項研究不僅提供了新的治療思路，而且對于理解線粒體轉移在骨缺損修復中的作用以及免疫和生物能量調節(jié)治療策略在組織再生中的重要性具有研究價值和實際應用前景。該文章于2024年09月11日以《An Engineered Hierarchical Hydrogel with Immune Responsiveness and Targeted Mitochondrial Transfer to Augmented Bone Regeneration》為題發(fā)表于《Advanced Science》（DOI：10.1002/advs.202406287）。
圖1. 示意圖顯示了實現靶向生物調節(jié)的工程分層水凝膠。工程化分層水凝膠可以提供適合成骨的機械環(huán)境，并通過調節(jié)炎癥和促進細胞間線粒體轉移來調節(jié)BMSC的能量代謝。轉移的線粒體可以通過降低 BMSC 中的 ROS 水平并增加 ATP 和 OXPHOS 水平來增強成骨分化和骨修復
（1）隧道納米管介導巨噬細胞和 BMSC 之間的線粒體轉移 該段展示了巨噬細胞與骨髓間充質干細胞（BMSC）之間的線粒體轉移機制，揭示了這一過程在骨缺損修復中的潛在作用。通過單細胞RNA測序分析（圖2a），研究人員發(fā)現巨噬細胞分泌的信號蛋白如SPP1、TGF-β和GDF對成骨細胞系細胞具有顯著的靶向作用，而圖2b和c的熱圖進一步強調了巨噬細胞在骨修復過程中與其他細胞群體的密切相互作用。利用掃描電子顯微鏡（SEM）圖像（圖2d和e），觀察到巨噬細胞與BMSC之間通過隧道納米管（TNT）形成了物理連接，并且在巨噬細胞膜上形成了多個接觸點。免疫標記實驗（圖2f）證實了Sec3和Sec5蛋白在TNT募集的肌動蛋白骨架處的共定位，以及Tom20-GFP標記的線粒體在TNT中的共定位。圖2g的免疫熒光圖像顯示了Miro1與Tom20-GFP標記的線粒體在TNT中的共定位，進一步證實了Miro1在線粒體轉移中的作用。通過敲除Miro1的實驗（圖2h和i），研究人員發(fā)現線粒體轉移效率顯著降低，這證實了Miro1介導的巨噬細胞向BMSC的線粒體轉移。這些發(fā)現表明，巨噬細胞與BMSC之間的線粒體轉移是通過TNT介導的，并且Miro1在這個過程中起著關鍵作用，對于維持細胞功能和促進骨缺損修復具有重要意義。
圖2. 巨噬細胞和BMSC通過隧道納米管連接。a) 熱圖說明巨噬細胞發(fā)出的信號強度。b) 圓形圖顯示巨噬細胞與其他各種群體之間相互作用強度的直觀描述。c) 熱圖顯示 GDF 通路在不同細胞群之間傳遞信號的功能。d) SEM 圖像顯示巨噬細胞（綠色）和 BMSC（藍色）之間的 TNT（白色箭頭）。e) SEM 圖像顯示 TNT 和巨噬細胞之間的相互作用（紅色箭頭）。黃色箭頭顯示與巨噬細胞融合的 TNT 芽。f) 代表性共焦圖像顯示 TNT 介導的 Tom20-GFP 標記線粒體從巨噬細胞轉移至 BMSC。TNT 內胞外蛋白 Sec3（粉紅色）和 Sec5（灰色）的共定位。肌動蛋白用鬼筆環(huán)肽紅染色。g) 免疫熒光圖像顯示 Miro1（粉色）與 Tom20-GFP 標記的線粒體（綠色）的共定位。用Tom20-GFP轉染的巨噬細胞與BMSC共培養(yǎng)。將共培養(yǎng)物固定 24 小時并用抗 Miro1 抗體（粉紅色）進行免疫標記。使用鬼筆環(huán)肽紅對肌動蛋白進行染色（紅色）。圖像顯示 TNT 中線粒體（綠色）和 Miro1（粉色）的共定位。h, i) 顯示巨噬細胞中 shRNA 介導的 Miro1 部分敲低后線粒體轉移減少的圖 (h)。孵育前，用 Mitotracker Deep Red（紅色）標記巨噬細胞。數據標準化為對照中的線粒體轉移(i)。 *P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001
（2）用于骨再生策略的工程分層水凝膠 這種水凝膠通過結合抗炎藥物二甲基異戊二烯酸（DMI）和靶向巨噬細胞的兩性離子納米凝膠（MDV），旨在調節(jié)免疫反應并促進細胞間的線粒體轉移。圖3a的原理圖展示了植入式可注射水凝膠的基本生物學要求，突出了適宜的彈性模量對于組織工程的重要性。通過圖3b的楊氏模量測試，研究人員發(fā)現MDV納米凝膠的加入顯著增強了水凝膠的機械強度，為骨修復和再生提供了適宜的細胞外基質環(huán)境。圖3c展示了水凝膠在模擬體內條件下對羅丹明B的釋放行為，其中MDV納米凝膠顯示出較高的藥物釋放百分比，實現了高效的基因轉染和降低的細胞毒性。圖3d的流變學分析表明，水凝膠具有快速的溶膠-凝膠轉變能力，適合作為注射材料。圖3e的自我愈合測試證明了水凝膠通過可逆席夫堿鍵具有良好的自我修復能力。圖3f和圖3g的降解實驗顯示了水凝膠在不同酶和pH值條件下的降解效率，以及隨時間變化的孔隙結構，表明水凝膠具有良好的生物降解性。圖3h的釋放曲線顯示了水凝膠在不同pH值環(huán)境下對DMI和Miro1的控釋能力，這在炎癥環(huán)境中尤為關鍵。 特別是，載有Miro1的MDV納米凝膠能夠促進從巨噬細胞到BMSC的線粒體轉移過程，調節(jié)BMSC中的ROS、ATP和OXPHOS水平，從而影響細胞內線粒體功能和代謝狀態(tài)，促進骨再生組織的形成和生長。這些發(fā)現強調了細胞間線粒體轉移在骨缺損修復中的重要性，并突出了免疫和生物能量調節(jié)治療策略在組織再生中的潛力。
圖3. 用于骨再生策略的工程分層水凝膠。a) 示意圖闡明了組織工程中具有可逆交聯鍵合特征的植入可注射水凝膠的基本生物學先決條件。b) 不同分級水凝膠（CHMCB、CHMSB 和 CHMDV）以及不同 MDV 納米凝膠含量（0、25 和 50 mg/mL）的 CHMDV 的楊氏模量。插圖顯示了 CBMA、SBMA 和 DVBAPS (n = 3) 的化學結構。c) 37°C 生理鹽水（0.9 wt%）中羅丹明 B 從分層水凝膠中的釋放曲線。d) 短時間尺度凝膠行為和 e) 分層水凝膠連續(xù)步進應變掃描的流變學分析 (n = 3)。f) 分級水凝膠在胰蛋白酶、透明質酸酶和磷酸鹽緩沖鹽水（PBS，pH = 5.5 和 7.4）中的降解速率-時間曲線 (n = 3)。g) 干燥分層水凝膠的時間依賴性 SEM 圖像和 h) DMI 和 Miro 1 在不同 pH 環(huán)境下的釋放曲線 (n = 3)。比例尺為 20 μm（第 0 天）和 100 μm（第 3-15 天）
（3）裝載 Miro1-DNA 的 MDV 納米凝膠可以靶向巨噬細胞并調節(jié)線粒體轉移 研究人員深入探討了MDV納米凝膠在靶向巨噬細胞和調節(jié)線粒體轉移中的作用。通過圖4a的CCK-8細胞活性分析，研究人員證實了MDV納米凝膠在較高濃度下仍然保持低細胞毒性，表明其良好的生物相容性。圖4b的SEM圖像進一步展示了MDV納米凝膠能夠特異性地被巨噬細胞攝取，而不是BMSC，揭示了其出色的巨噬細胞靶向能力。 研究人員還評估了MDV納米凝膠作為基因載體的潛力。圖4c的熒光圖像顯示，與常用的PEI和Lipo3000轉染試劑相比，MDV納米凝膠在轉染Miro1-DNA時展現出更高的效率。免疫熒光圖像（圖4d和e）以及共聚焦圖像（圖4f）共同證實了MDV納米凝膠能夠促進Miro1的表達，并增強從巨噬細胞到BMSC的線粒體轉移。此外，流式細胞儀分析（圖4g和h）定量地證明了MDV納米凝膠處理后，巨噬細胞向BMSC的線粒體轉移效率顯著提高。這些結果表明，MDV納米凝膠不僅能有效靶向巨噬細胞，還能作為有效的基因載體提高Miro1-DNA的轉染效率，并通過促進線粒體轉移來增強受損細胞的修復能力。
圖4. 兩性離子 MDV 納米凝膠介導的線粒體轉移。a) CCK-8 分析顯示 MDV 納米凝膠 (250–2000 μg mL?1) 與巨噬細胞共培養(yǎng) 24 小時的濃度依賴性。b) SEM 圖像顯示 MDV 納米凝膠對巨噬細胞的特異性靶向（由白色箭頭表示）。c) 熒光圖像顯示 MDV 納米凝膠、PEI 或 Lipo3000 對 Miro1 質粒的轉染效率。d, e) 免疫熒光圖像顯示，在應用 MDV 納米凝膠后，Miro1 和 TNT 共定位。肌動蛋白用鬼筆環(huán)肽紅染色。f) 代表性共聚焦圖像顯示 Miro1（MDV 納米凝膠）介導的線粒體從巨噬細胞轉移到 BMSC。巨噬細胞與 BMSC 共培養(yǎng)前，使用 MitoTracker Deep Red 標記巨噬細胞線粒體（紅色）。g, h) 該圖顯示通過引入 Miro1（MDV 納米凝膠）增加了從巨噬細胞到 BMSC 的線粒體轉移。使用流式細胞術監(jiān)測線粒體轉移，并根據對照條件下的線粒體轉移標準化數據。*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001
（4）Gel@MDI通過調節(jié)BMSC的能量代謝來調節(jié)其成骨分化能力 研究人員深入分析了Gel@MDI水凝膠對BMSC成骨分化能力的影響，特別關注了其在調節(jié)BMSC能量代謝方面的作用。圖5a和b的結果揭示了Gel@MDI水凝膠能夠降低BMSC中的活性氧（ROS）水平，這是通過MitoSox染色來評估的，并且通過熒光強度的量化進一步證實了這一點。圖5c和d中的共聚焦圖像和分析顯示，與M1型巨噬細胞共培養(yǎng)的BMSC表現出較低的線粒體膜電位（MMP），反映了線粒體功能的損害，而Gel@MDI水凝膠的應用則有助于恢復BMSC的MMP水平。 通過海馬XF分析平臺進行的代謝分析（圖5e）表明，Gel@MDI水凝膠上的BMSC展現出更高的基礎呼吸率、備用呼吸能力和ATP產量，這表明Gel@MDI通過調節(jié)巨噬細胞的極化和促進線粒體轉移，增強了BMSC的代謝狀態(tài)。此外，圖5f至i的結果進一步證實了Gel@MDI水凝膠能夠提高BMSC的線粒體呼吸和能量產生，這對于BMSC的成骨分化至關重要。 圖5j至m展示了Gel@MDI水凝膠顯著提高了BMSC的成骨能力，包括增加的ALP水平、更多的礦化結節(jié)以及成骨相關基因的表達。這些結果直接證明了Gel@MDI水凝膠通過改善BMSC的能量代謝和調節(jié)巨噬細胞的極化，顯著促進了BMSC的成骨潛力。Gel@MDI水凝膠作為一種新型的骨再生材料，通過精細調控免疫微環(huán)境和細胞代謝，展現出了在促進骨缺損修復方面的巨大潛力。
圖5. 線粒體轉移的代謝效應。a) 熒光圖像顯示分層 Gel@MDI 水凝膠上 BMSC 的 ROS 水平。MitoSox 染色（黃色）表示 BMSC 中的 ROS 水平。MitoTracker Deep Red 在共培養(yǎng)前標記巨噬細胞線粒體（紅色）。b) 用于定量 ROS 產生的熒光標記強度的平均值 (n = 6)。c, d) 代表性共焦圖像和相應的分析，以量化 Gel@MDI 上 BMSC 中的 MMP 水平。TMRM 染色反映 MMP 水平 (n = 6)。e) 示意圖顯示海馬平臺的代謝分析，以研究線粒體轉移對 BMSC 的影響。在 Gel@MDI 水凝膠上共培養(yǎng) 24 h 后，通過 FACS 分離巨噬細胞和 BMSC，并進一步利用 seahorse xfe96 平臺測量 BMSC 的代謝狀態(tài)。f) Seahorse XF Mito 應激測試中 BMSC 的耗氧率 (OCR) 顯示線粒體呼吸增加 (n = 8)。g) 基礎呼吸，h) 備用呼吸能力，i) BMSC 中的 ATP 產生 (n = 8)。j) 成骨分化后 7 天和 14 天在 CH（純凝膠）或分級水凝膠（Gel@MDI）上培養(yǎng)的 BMSC 的 ALP 染色和茜素紅 S 染色。k–m) 成骨分化后 7 天成骨相關基因 Col1a1、Alp、Runx2 和 Sp7 的表達 (n = 3)。*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001
（5）具有免疫調節(jié)和靶向線粒體轉移的分層水凝膠促進臨界尺寸顱骨缺損的再生 研究人員通過在小鼠模型中植入Gel@MDI水凝膠，評估了其在體內促進臨界尺寸顱骨缺損修復的能力。結果顯示，與對照組和純CH水凝膠組相比，Gel@MDI處理組在8周后顯示出顯著的骨再生，其特點是更多的鈣化和復雜的組織形成。通過micro-CT掃描圖像（圖6a和b），觀察到Gel@MDI組的骨體積/總組織體積（BV/TV）和小梁厚度（Tb.Th）顯著高于其他組，而小梁分離/間隙（Tb.Sp）則顯著更低（圖6c-e）。此外，H&E染色和Masson三色染色（圖6h）揭示了Gel@MDI組新形成的骨骼分布均勻且結構緊密。免疫熒光分析進一步表明，Gel@MDI促進了M2型巨噬細胞標記物CD206的表達，并降低了M1型巨噬細胞標記物iNOS的表達（圖6f-j），這表明Gel@MDI通過調節(jié)免疫微環(huán)境，促進了骨缺損的修復。
圖6. Gel@MDI 移植促進臨界尺寸骨缺損的再生。a) 顱骨缺損手術后水凝膠植入的圖示。b–e) 分別在術后 2 周對僅手術組 (Con)、CH（純凝膠）和分級水凝膠 (Gel@MDI) 組的骨再生進行顯微 CT 評估。新再生骨組織的定量分析，包括 c) BV/TV、d) Tb.Th 和 e) Tb.Sp (n = 3)。f) CD206 陽性染色區(qū)域和 g) iNOS 陽性染色區(qū)域的定量分析 (n = 4)。h) 顱骨缺損后 8 周，Con、Gel 或 Gel@MDI 組石蠟切片的 H&E 染色和 Masson 三色染色。i, j) iNOS 陽性染色區(qū)域和 CD206 陽性染色區(qū)域的共免疫熒光染色圖像 (n = 4)。*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001
研究人員還深入探討了Gel@MDI水凝膠調節(jié)的生物學過程。通過比較手術對照組和Gel@MDI組之間的差異表達基因，研究人員鑒定了449個差異表達基因，涉及神經再生、成骨分化和代謝相關途徑的富集（圖7a-c）?；蚣患治觯℅SEA）確認了Gel@MDI在“骨成熟”和“骨吸收”中的顯著作用。熱圖和箱線圖分析顯示，與對照組和Gel組相比，Gel@MDI組中成骨、抗炎和代謝基因的表達增加（圖7d），突出了其在骨免疫調節(jié)中的作用。這些結果表明，Gel@MDI水凝膠通過精細調控免疫反應和促進線粒體轉移，顯著提高了BMSC的能量代謝和成骨潛力，從而在體內對骨缺損修復具有顯著的促進作用，展現出在骨再生和修復方面的巨大潛力和應用前景。
圖7. 組織再生中與線粒體轉移調節(jié)相關的生物過程的探索。a) 火山圖顯示僅手術組 (Con) 和分層水凝膠 (Gel@MDI) 組之間差異表達的基因。b) 僅手術組 (Con)、CH 水凝膠 (Gel) 和分層水凝膠 (Gel@MDI) 組之間基因表達的熱圖。c) 生物過程（BP）、分子功能（MF）、KEGG、反應組和 Wiki 途徑富集分析揭示了差異表達基因可能參與的潛在途徑。d) “成骨”、“抗炎”和“代謝”途徑的熱圖和箱線圖分析。e) 示意圖顯示了 Gel@MDI 誘導的 BMSC 中促進成骨的可能機制
研究小結:
本研究創(chuàng)新性地開發(fā)了一種具有免疫響應和靶向線粒體轉移功能的工程化分層水凝膠（Gel@MDI），用于促進骨再生。Gel@MDI通過整合抗炎藥物DMI和巨噬細胞靶向的兩性離子納米凝膠（MDV），不僅能在炎癥環(huán)境中調節(jié)巨噬細胞的極化，還能提高巨噬細胞向骨髓間充質干細胞（BMSC）的線粒體轉移效率。
實驗結果顯示，Gel@MDI顯著增強了BMSC的代謝狀態(tài)，提高了成骨分化能力，并在小鼠的臨界尺寸顱骨缺損模型中展現出卓越的骨再生效果。這些發(fā)現為骨缺損治療提供了新的策略，證明了Gel@MDI在調節(jié)免疫微環(huán)境和促進骨組織修復中的潛力，為未來的骨再生材料設計和臨床應用提供了重要的指導。
|
創(chuàng)賽生物 提供高品質的醫(yī)療產品和服務 |
聯系我們
廣州創(chuàng)賽生物醫(yī)用材料有限公司 手機：180 2452 3356
|
掃碼關注
關注公眾號 掃碼加客服
|
