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近年來，前交叉韌帶（ACL）損傷的發(fā)生率持續(xù)上升，導(dǎo)致膝關(guān)節(jié)不穩(wěn)定、疼痛及功能障礙，并增加軟骨損傷和骨關(guān)節(jié)炎的風(fēng)險(xiǎn)。ACL通過細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）形成韌帶與骨之間的機(jī)械連接，但損傷后缺乏有效的自我修復(fù)能力，目前重建手術(shù)仍是主要治療手段。PET人工韌帶因其高機(jī)械強(qiáng)度和術(shù)后恢復(fù)快等優(yōu)點(diǎn)在ACL重建中廣泛應(yīng)用，但其惰性和疏水性導(dǎo)致術(shù)中摩擦產(chǎn)生的碎片持續(xù)激活M1巨噬細(xì)胞，誘導(dǎo)慢性炎癥微環(huán)境，同時(shí)移植物-骨界面形成無序纖維瘢痕組織，阻礙血管和骨組織生長(zhǎng)，導(dǎo)致骨隧道擴(kuò)大和移植物融合不良，成為臨床應(yīng)用中的關(guān)鍵挑戰(zhàn)。現(xiàn)有的表面改性策略（如β-TCP、絲素蛋白、石墨烯和羥基磷灰石）盡管改善了成骨能力，但忽視了對(duì)纖維瘢痕組織和炎癥的調(diào)控。

針對(duì)上述問題，華南理工大學(xué)劉昌勝院士團(tuán)隊(duì)開發(fā)了一種多層免疫調(diào)節(jié)水凝膠涂層來控制愈合過程中移植物-骨界面的早期炎癥。該功能涂層包括兩個(gè)關(guān)鍵模塊：(i)抗炎糖模塊，其中糖胺聚糖(GAG)類似物——硫酸多糖(SCS)調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞極化并結(jié)合生長(zhǎng)因子，從而減少炎癥細(xì)胞因子的釋放并防止瘢痕組織形成。（ii）潤滑模塊由GelMA水凝膠組成，模擬細(xì)胞外基質(zhì)（ECM），支持細(xì)胞生物相容性，同時(shí)實(shí)現(xiàn)SCS的可控釋放。此外，原生ACL表面具有水合潤滑層，可減輕典型生理?xiàng)l件下的機(jī)械刺激。受此啟發(fā)，該研究團(tuán)隊(duì)將具有增強(qiáng)交聯(lián)密度和更多交聯(lián)點(diǎn)的8臂PEGDA納入GelMA水凝膠的分子網(wǎng)絡(luò)中。PEGDA水凝膠和水分子之間的氫鍵穩(wěn)定了潤滑區(qū)域，降低了機(jī)械摩擦，并減少了最初的炎癥刺激。此外，它還提高了凝膠的機(jī)械強(qiáng)度和穩(wěn)定性。這種抗炎方法有望顯著影響ACL重建，并在生物醫(yī)學(xué)中具有更廣泛的應(yīng)用潛力。該文章于2024年11月15日以《Immunoregulative coating for scarless healing in anterior cruciate ligament reconstruction》為題發(fā)表于《Bioactive Materials》上（DOI: 10.1016/j.bioactmat.2024.11.007）。

研究示意圖

（1）水凝膠的制備與表征

該團(tuán)隊(duì)開發(fā)了一種雙網(wǎng)絡(luò)水凝膠GelMA-PEGDA（PGH），作為SCS控制釋放的載體（SCS@PGH）（圖1A）。通過¹H-NMR在5.4和5.6 ppm處的新信號(hào)證實(shí)了GelMA成功偶聯(lián)甲基丙烯酸（MA），甲基丙烯酸化程度約為39%。結(jié)合PEGDA后，進(jìn)一步增強(qiáng)了水凝膠的結(jié)構(gòu)，并通過加入SCS和光引發(fā)劑（LAP）在藍(lán)光下形成二次網(wǎng)絡(luò)SCS@PGH。SEM圖像顯示，PGH和SCS@PGH均具有數(shù)百微米的多孔結(jié)構(gòu)，SCS的加入未顯著改變孔隙大小（圖1B）。此外，SCS的引入使zeta電位由-2 mV略微下降，增強(qiáng)了水凝膠與生長(zhǎng)因子的靜電相互作用（圖1C）。頻率掃描（0.1-10 Hz）表明，SCS@PGH的存儲(chǔ)模量（G'）始終高于損耗模量（G″），達(dá)到25 kPa，表現(xiàn)出穩(wěn)定的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)（圖1D），其彈性模量略高于PGH，可能由氫鍵和靜電相互作用增強(qiáng)所致（圖1E）。SCS的加入將水凝膠的膨脹率從150%降低至120%，但未顯著影響孔隙度，確保了充分的營養(yǎng)和氣體交換（圖1F）。壓縮試驗(yàn)顯示SCS@PGH的壓縮模量為1.0-1.5 kPa（圖1G, H）。甲苯胺藍(lán)定量分析結(jié)果表明，SCS在初期快速釋放，隨后釋放速率減緩并達(dá)到平臺(tái)期（圖1I）。

圖1. 水凝膠的制備與表征。A)合成水凝膠的化學(xué)結(jié)構(gòu)。B)水凝膠的SEM圖像。C) PGH和SCS@PGH的Zeta電位。D)水凝膠的儲(chǔ)存模量（G′）和損耗模量（G″）。E)兩種水凝膠在完全膨脹狀態(tài)下的壓縮彈性模量。F)兩種水凝膠的溶脹比。G)壓縮曲線和H) PGH和SCS@PGH水凝膠的壓縮模量。I)SCS@PGH中SCS的累積釋放曲線

（2）涂層的制備與表征

通過O?等離子體處理制備的水凝膠涂層在PET膜與水凝膠之間形成弱交聯(lián)，確保涂層牢固附著于基材。隨后，將不同水凝膠溶液涂覆在PET表面，制得具備潤滑與抗炎性能的PGH/PET和SCS@PGH/PET涂層。SEM與AFM分析表明，涂層表面均勻光滑，凍干后呈多孔結(jié)構(gòu)（圖2A）。EDS驗(yàn)證了SCS@PGH/PET中C、O、N、S等元素的均勻分布（圖2B），確認(rèn)了SCS的成功摻入。AFM數(shù)據(jù)顯示，SCS@PGH/PET的表面粗糙度由PET的105 nm降至1.37 nm（圖2C），而WCA測(cè)試表明，涂層顯著提升了親水性，從而促進(jìn)細(xì)胞黏附與流體滲透（圖2D）。FTIR與XPS分析進(jìn)一步確認(rèn)了涂層的化學(xué)組成，其中在1240 cm?1和815 cm?1處分別檢測(cè)到O=S=O和C-O-S基團(tuán)特征峰，XPS檢測(cè)到S2P峰（圖2E、F）。機(jī)械性能測(cè)試表明，PGH/PET與SCS@PGH/PET組摩擦系數(shù)約為0.2，比純PET降低66.67%（圖2G-I），展現(xiàn)出優(yōu)越的潤滑性與拉伸強(qiáng)度。MTT實(shí)驗(yàn)表明水凝膠涂層顯著提高細(xì)胞增殖率，尤其在SCS@PGH組中表現(xiàn)突出（圖2J）。活/死染色與肌動(dòng)蛋白染色進(jìn)一步證實(shí)涂層增強(qiáng)了HUVEC細(xì)胞的黏附與延展性，利于細(xì)胞的快速定植與組織修復(fù)（圖2K）。綜合來看，SCS@PGH/PET涂層在潤滑性能、生物相容性及細(xì)胞支持方面表現(xiàn)優(yōu)異，為組織修復(fù)提供了理想的涂層材料。

圖2. 涂層的制備與表征。A)涂層的SEM顯微照片。B)顯示SCS@PGH/PET元素分布的EDS圖。C) PGH/PET和SCS@PGH/PET的AFM圖像。D)不同涂層的水接觸角。E) FTIR光譜。F) XPS光譜。G)抗拉強(qiáng)度，H)不同涂層失效時(shí)的應(yīng)變。I)摩擦?xí)r間曲線系數(shù)。J)不同涂層對(duì)HUVECs細(xì)胞活力的影響。K) HUVECs的活細(xì)胞/死細(xì)胞染色和共聚焦熒光圖像

（3）水凝膠包被移植物的體外免疫調(diào)節(jié)

為探討水凝膠涂層對(duì)巨噬細(xì)胞極化的影響，該研究團(tuán)隊(duì)通過體外培養(yǎng)模型研究了PGH/PET、SCS@PGH/PET和PET樣品對(duì)骨髓源性巨噬細(xì)胞（BMDM）的刺激作用（圖3A）。流式細(xì)胞術(shù)初步結(jié)果顯示，SCS顯著促進(jìn)M1向M2極化（圖3B、C）。免疫熒光染色表明，SCS@PGH/PET處理組的巨噬細(xì)胞CD206陽性標(biāo)記物明顯增加，形態(tài)以拉長(zhǎng)為主；而PET處理組CD197表達(dá)更高，形態(tài)以圓形單核細(xì)胞為主（圖3D）。PGH/PET組的CD197陽性細(xì)胞減少，CD206表達(dá)水平最低。M1和M2相關(guān)基因表達(dá)分析進(jìn)一步證實(shí)了這些結(jié)果（圖3E），顯示SCS顯著上調(diào)修復(fù)性抗炎基因（CD206、TGF-β、VEGF），并下調(diào)促炎基因（IL-1β、IL-6、TNF-α）。ELISA檢測(cè)共培養(yǎng)3天的細(xì)胞因子分泌量（圖3F）顯示，SCS處理組M1相關(guān)因子（TNF-α、IL-1β、IL-6）分泌減少，而M2相關(guān)因子分泌顯著增加，尤其是TGF-β增長(zhǎng)最為顯著。這些結(jié)果表明，SCS顯著促進(jìn)了促炎M1向抗炎M2的極化，同時(shí)調(diào)節(jié)炎癥因子的分泌，進(jìn)一步驗(yàn)證了水凝膠潤滑特性對(duì)改善巨噬細(xì)胞促炎狀態(tài)的積極作用。

圖3.Mφs對(duì)不同涂層的體外免疫應(yīng)答。A) Mφs在不同樣品上共培養(yǎng)示意圖。B) m - φs的極化C) CD197 （M1）和CD206 （M2）在樣品模擬3天后（n = 3）通過流式細(xì)胞術(shù)定量分析。D)不同樣品上3天后m - φs極化的熒光顯微鏡圖像。E)巨噬細(xì)胞相關(guān)基因M1和M2的相對(duì)mRNA表達(dá)水平。F)炎癥因子的ELISA分析

（4）包衣接枝處理Mφs CM對(duì)體外血管生成行為的影響

植入物引發(fā)的炎癥反應(yīng)常伴隨血管生成，為組織修復(fù)提供氧氣和營養(yǎng)。本研究評(píng)估了巨噬細(xì)胞對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞血管生成行為的影響，通過巨噬細(xì)胞條件培養(yǎng)基（CM）培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）開展實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示，SCS@PGH/PET組顯著增強(qiáng)HUVEC的遷移能力，48小時(shí)傷口愈合率達(dá)78%，為PET組的1.6倍（圖4A、B）。血管生成基因分析表明，SCS@PGH/PET組VEGF、Ang1和Esm-1基因表達(dá)顯著上調(diào)（圖4C）。免疫熒光染色顯示，SCS@PGH/PET組VEGFR2表達(dá)增強(qiáng)，表明潤滑水凝膠包被和SCS的加入通過激活受體促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移及功能（圖4D）。在離體主動(dòng)脈環(huán)模型中，SCS@PGH/PET組微血管生成顯著增強(qiáng)，表現(xiàn)為動(dòng)脈環(huán)發(fā)芽和尖端細(xì)胞突出（圖4E、F）。此外，巨噬細(xì)胞極化不僅促進(jìn)血管生成，還影響成骨分化。SCS@PGH/PET組在巨噬細(xì)胞CM刺激下，第7天堿性磷酸酶（ALP）染色最為顯著，表明成骨分化加快；茜素紅S染色進(jìn)一步證實(shí)礦化結(jié)節(jié)形成最多，表明成骨效率提升。這些結(jié)果表明，SCS通過調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞極化，不僅增強(qiáng)血管生成，還顯著促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化能力。

圖4. SCS在體外誘導(dǎo)m - φ介導(dǎo)的動(dòng)脈生成。A)細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)：光學(xué)圖像和B)涂層刺激后24和48 h的傷口愈合定量實(shí)驗(yàn)。C) m - φs CM中HUVECs血管生成相關(guān)mRNA的相對(duì)表達(dá)。D) VEGFR2標(biāo)記的免疫熒光染色。E)具有代表性的大鼠主動(dòng)脈環(huán)生長(zhǎng)圖像；F)與Mφs共培養(yǎng)7天血管新生芽的定量

（5）減少體內(nèi)炎癥

基于體外實(shí)驗(yàn)中優(yōu)異的免疫調(diào)節(jié)和促血管生成活性，該研究團(tuán)隊(duì)在小鼠ACLR模型中評(píng)估了水凝膠涂層對(duì)肌腱-骨界面組織修復(fù)的效果。H&E染色顯示，術(shù)后14天和28天，PET組存在顯著炎癥細(xì)胞浸潤及異常血管化，而PGH/PET組炎癥較少，SCS@PGH/PET組表現(xiàn)出微血管形成及骨組織整合（圖5A、B）。免疫熒光染色進(jìn)一步證實(shí)，SCS@PGH/PET組在巨噬細(xì)胞極化中顯著促進(jìn)了M2表型（CD206+）的數(shù)量增加，抑制了M1表型（CD197+），展現(xiàn)出優(yōu)越的抗炎性能（圖5C）。同時(shí)，SCS@PGH/PET組在瘢痕相關(guān)標(biāo)志物（Col 1和SMA）方面表現(xiàn)出持續(xù)的細(xì)胞外基質(zhì)重塑，第28天顯示Col 1有序排列增加，SMA陽性細(xì)胞減少（圖5D）。成骨標(biāo)志物OSX和增殖標(biāo)志物Ki67在SCS@PGH/PET組的表達(dá)明顯高于其他組（圖5E）。ELISA分析顯示，與PET組相比，PGH/PET和SCS@PGH/PET組顯著降低了M1相關(guān)炎癥因子（IL-1β、TNF-α），提高了M2相關(guān)愈合因子（IL-4、IL-10、TGF-β），其中SCS@PGH/PET組在術(shù)后早期（第2周）TGF-β水平升高，促進(jìn)炎癥向增殖階段的轉(zhuǎn)變（圖5F-K）。綜上，SCS@PGH/PET涂層通過調(diào)節(jié)炎癥細(xì)胞極化及相關(guān)因子釋放，顯著促進(jìn)肌腱-骨界面組織修復(fù)和功能恢復(fù)。

圖5.體內(nèi)炎癥減輕，瘢痕形成受到抑制。A)術(shù)后14天、B)術(shù)后28天各組蘇木精、伊紅（HE）染色(P: PET；S：疤痕組織界面；黑色箭頭表示新血管)。C)術(shù)后第14、28天各組界面CD197+CD206- m - φs （M1）、CD197?CD206+ m - φs （M2）、D) Col 1、E) Ki67、OSX免疫熒光染色（n = 3）。F)術(shù)后第14、28天TNF-α、G) IL-1β、H) IL-6、I) TGF-β、J) IL-10、K) IL-4水平（n = 4）

（6）抑制疤痕形成

Masson染色和偏振光顯微鏡顯示，SCS@PGH/PET組在肌腱-骨界面形成成熟的膠原排列和類似天然骨組織的各向異性膠原蛋白層，而PET和碳纖維移植物組僅觀察到少量再生骨和膠原（圖6A、B）。SCS@PGH/PET組在第4周TGF-β和pSmad3表達(dá)顯著降低，表明TGF-β信號(hào)激活減弱（圖6C-G）。去除巨噬細(xì)胞（Mφs）后，SCS@PGH/PET組膠原蛋白（Col1）表達(dá)增加，SMA減少，同時(shí)觀察到CD31+Emcn+血管顯著生成（圖6H-J）。結(jié)果表明，SCS@PGH/PET涂層通過調(diào)控Mφs，抑制疤痕組織形成，促進(jìn)膠原重建和血管生成。

圖6.巨噬細(xì)胞對(duì)體內(nèi)膠原形成和瘢痕形成的影響。A)具有代表性的馬森氏三色染色圖像和B)前交叉韌帶重建術(shù)后14天和28天的偏振光。C) TGF-β和D) pSmad3免疫組化染色。E) Collagen， F) TGF-β和G) psmad3陽性細(xì)胞核（n = 3）的定量分析。H) m - φs消耗（氯膦酸脂質(zhì)體）示意圖和治療策略。I) Mφs耗損模型中Col 1恢復(fù)后的代表性熒光圖像（n = 3）。J) Mφs耗損后第14天各組界面F4/80、CD31和Emcn的免疫熒光染色（n = 3）

（7）SCS@PGH/PET對(duì)小鼠ACL重建模型的治療作用

通過高分辨率微計(jì)算機(jī)斷層掃描（μCT）評(píng)估SCS@PGH/PET在ACL重建中的療效，結(jié)果顯示其脛骨和股骨隧道尺寸顯著縮小，脛骨隧道中新骨形成信號(hào)明顯增強(qiáng)（圖7A、B）。定量分析表明，8周后SCS@PGH/PET組脛骨隧道直徑最?。?.446±0.032 mm），骨體積分?jǐn)?shù)（BV/TV）達(dá)34.0%±1.92%，為對(duì)照組的4.5倍（圖7C、D）。組織學(xué)評(píng)估顯示，該組種植體周圍形成明顯的骨隧道及整齊排列的膠原結(jié)構(gòu)，顯著提高骨整合水平（圖7E）。拔出力測(cè)試顯示，SCS@PGH/PET組拔出強(qiáng)度最高（約12N），為對(duì)照組的3倍（圖7F）。免疫熒光分析進(jìn)一步證明，8周后SCS@PGH/PET組opn陽性成骨細(xì)胞和Ki67表達(dá)顯著增加，同時(shí)觀察到CD31hi和Emcnhi血管結(jié)構(gòu)，表明其增強(qiáng)骨形成和血管網(wǎng)絡(luò)支持的能力（圖7G、H）。結(jié)果表明，SCS@PGH/PET涂層通過優(yōu)化種植體-骨界面的再生微環(huán)境，顯著促進(jìn)骨整合，加速愈合。

圖7.觀察各組小鼠前交叉韌帶重建8周后的治療效果。A)脛骨隧道中間和脛骨隧道的二維微CT切面圖像。B)有代表性的三維重建顯微CT圖像顯示缺損周圍再生骨。定量分析C)各組脛骨隧道中間入口的隧道橫截面直徑和D) BV/TV。E) HE和Masson染色，標(biāo)尺，200 μm。F)術(shù)后8周不同組生物力學(xué)試驗(yàn)及最終失效負(fù)荷的數(shù)碼相機(jī)圖像。G) OPN, Ki67，DAPI, Scale bars，200 μm染色的代表性熒光圖像。H)術(shù)后8周CD31hiEmcnhi （H型）內(nèi)皮細(xì)胞代表性免疫染色

研究小結(jié)：

該研究開發(fā)了一種SCS@PGH/PET水凝膠涂層來調(diào)節(jié)ACLR后的免疫微環(huán)境。這種水凝膠表現(xiàn)出特殊的特性，包括優(yōu)化的多孔結(jié)構(gòu)，用于細(xì)胞浸潤，以及對(duì)細(xì)胞粘附和增殖至關(guān)重要的潤滑性。經(jīng)證實(shí)，結(jié)合硫酸多糖和生物活性分子對(duì)調(diào)節(jié)m - φs極化從促炎M1到再生M2狀態(tài)至關(guān)重要，TGF-β等細(xì)胞因子受到調(diào)節(jié)。這種轉(zhuǎn)變對(duì)于減少疤痕形成、促進(jìn)愈合環(huán)境和加速血管生成至關(guān)重要。體外和體內(nèi)研究均證實(shí)了水凝膠對(duì)組織修復(fù)和再生的顯著影響。SCS@PGH/PET水凝膠涂層的發(fā)現(xiàn)為再生醫(yī)學(xué)中合成韌帶的設(shè)計(jì)和改進(jìn)提供了堅(jiān)實(shí)的科學(xué)基礎(chǔ)。