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糖尿病性潰瘍（DUs）是糖尿病的嚴(yán)重并發(fā)。糖尿病的高血糖環(huán)境導(dǎo)致創(chuàng)面微環(huán)境局部多發(fā)病變，如血管生成受，活性氧（ROS）過度表達(dá)，從而延緩糖尿病潰瘍的愈合。受損的血管生成限制了營養(yǎng)和氧氣向傷口部位的運(yùn)輸，并誘導(dǎo)了持續(xù)的炎癥。ROS與DNA、脂質(zhì)和細(xì)胞的其他成分發(fā)生反應(yīng)，損害正常的細(xì)胞功能。同時(shí)，ROS是激活促炎信號(hào)通路的重要介質(zhì)，可上調(diào)促炎因子和趨化因子的表達(dá)。促炎因子的過度表達(dá)使巨噬細(xì)胞極化失調(diào)，這些免疫細(xì)胞進(jìn)一步產(chǎn)生更多的ROS和炎癥因子，形成延長炎癥期和阻止傷口愈合的惡性循環(huán)。由于傷口愈合由多個(gè)階段組成，因此需要分階段進(jìn)行處理，單一的治療效果可能會(huì)限制治療的有效性。創(chuàng)面分期治療，早期清除活性氧，后期持續(xù)促進(jìn)創(chuàng)面愈合，是糖尿病創(chuàng)面治療的一個(gè)有希望的方向。

針對上述問題，暨南大學(xué)郭瑞團(tuán)隊(duì)設(shè)計(jì)了一種智能微針（V@MP/C@MN），它通過雙向釋放抗炎劑和生長因子來促進(jìn)傷口愈合。V@MP/C@MN 的基礎(chǔ)材料是透明質(zhì)酸 （HA），它封裝了含有 VEGF 的 SCSMA 微球 （V@MP） 和 CONPs，用于傷口愈合。將多功能 V@MP/C@MN 植入皮膚傷口部位后，HA 迅速溶解，CONPs 迅速釋放到更深的真皮層，以減少炎癥期的氧化應(yīng)激，為傷口愈合提供有利的微環(huán)境。隨著 SCSMA 的降解，VEGF 從微球中緩慢釋放，以刺激增殖期的血管生成，恢復(fù)傷口環(huán)境的營養(yǎng)和氧氣供應(yīng)。V@MP 和 CONPs 還協(xié)同促進(jìn) M2 型巨噬細(xì)胞的極化并縮短炎癥期。為糖尿病潰瘍提供了一種新的多功能協(xié)同治療策略。該文章于2024年10月1日以《A biphasic drug-releasing microneedle with ROS scavenging and angiogenesis for the treatment of diabetic ulcers》為題發(fā)表于《Acta Biomaterialia》（DOI: DOI: 10.1016/j.actbio.2024.09.045）。

研究示意圖

（1）CONPs 和 V@MP 特征

圖(a)的透射電子顯微鏡（TEM）圖像顯示，CONPs具有層狀結(jié)構(gòu)。圖(b)的動(dòng)態(tài)光散射（DLS）結(jié)果表明，CONPs的水合粒徑為112 ± 0.74 nm，適合微針加載。圖(c)的能譜分析（EDS）顯示，Ce和O元素均勻分布。圖(d)的X射線光電子能譜（XPS）分析表明，CONPs表面含有63.2% Ce³⁺和36.8% Ce⁴⁺，這有助于模擬SOD酶活性，具備清除ROS的能力。圖(e)和(f)的FT-IR和1H NMR光譜驗(yàn)證了SCSMA的成功合成。V@MP微球通過微流控設(shè)備制備，水合粒徑為35.34 ± 1.66 μm（圖g），且形狀規(guī)則（圖h）。在體外藥物釋放實(shí)驗(yàn)中，CONPs在5分鐘內(nèi)迅速釋放，而BSA則在14天內(nèi)緩慢釋放（圖i），形成雙相釋放模式，有助于傷口抗氧化和血管生成。

圖1. CONPs 和 V@MP 的表征。A) CONPs 的 TEM 圖像。B) CONPs 的 DLS 分析。C) CONPs 的 EDS 圖像。D) CONPs 中 Ce 3d 的 XPS 分析。E) SCSMA 的 FT-IR 和 F) 1H NMR 光譜。G) V@MP 的粒度分析。H) 空白微球的光學(xué)顯微鏡圖像。I) 模擬藥物 FITC-BSA 從微球中釋放

（2）V@MP/C@MN 的特性及其抗氧化性

圖(a)的掃描電子顯微鏡（SEM）圖像顯示，微針尖端呈金字塔形，有助于快速、準(zhǔn)確地穿透皮膚深層。圖(b)的壓縮測試表明，微針具有良好的機(jī)械強(qiáng)度，能夠承受皮膚穿刺所需的最小力。圖(c)和(d)展示了在豬皮膚上的微針貼片，說明其具備透皮遞藥的能力。圖(e)的共聚焦激光掃描顯微鏡（CLSM）圖像顯示，微針的藥物遞送深度可達(dá)350 μm。圖(f)至(i)分析了V@MP/C@MN的抗氧化性能。H?O?測試結(jié)果表明，C@MN和V@MP/C@MN顯著降低了H?O?含量。DPPH自由基清除實(shí)驗(yàn)顯示，C@MN和V@MP/C@MN的自由基清除率分別為45.02%和60.84%。SOD酶活性測試顯示，C@MN和V@MP/C@MN的SOD酶活性分別為53.73%和70.87%。溶解氧測試結(jié)果表明，V@MP/C@MN能夠?qū)?O?轉(zhuǎn)化為氧氣，溶解氧含量達(dá)6.1 mg/mL。這些結(jié)果表明，V@MP/C@MN微針系統(tǒng)能夠有效減少ROS水平，緩解氧化應(yīng)激。

圖2. 微針的表征和抗氧化特性的測定。A) 微針的掃描電鏡圖像。B) 當(dāng)傳感器靠近并按壓針尖時(shí)針尖所受的壓力（n = 3）。C) 含有 DOX 的 MN 圖像。D) 用豬皮刺穿 MN 的圖像。E) 含有 DOX 的 MN 皮下藥物釋放結(jié)果。F) 不同部分微針的 H2O2 清除能力（n = 3）。G) 不同微針組分的自由基清除活性測試（n = 3）。H) 微針不同部分的 SOD 酶活性（n = 3）。I) 微針的類過氧化氫酶（CAT）活性（n = 3）

（3）V@MP/C@MN 可減少 ROS 生成并促進(jìn)體外 M2 極化

圖(a)顯示， V@MP/C@MN組的ROS清除效果最顯著，表明其具有優(yōu)異的抗氧化能力（圖c）。圖(b)至(e)分析了V@MP/C@MN在誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化中的作用。V@MP/C@MN在促進(jìn)M2表型方面更具優(yōu)勢，顯示出更強(qiáng)的免疫調(diào)節(jié)能力。總體而言，V@MP/C@MN微針系統(tǒng)能夠有效清除ROS并促進(jìn)巨噬細(xì)胞由M1向M2轉(zhuǎn)化，有助于炎癥和氧化應(yīng)激相關(guān)病變的治療。

圖3. 體外微針誘導(dǎo)的 ROS 減少和 M2 極化。A) 微針和正常細(xì)胞培養(yǎng)基（對照組）處理 HUVECs 細(xì)胞 24 小時(shí)后的 ROS 檢測。用 DCFH-DA 染色（綠色）。B) 流式細(xì)胞術(shù)分析巨噬細(xì)胞 CD86 和 CD206 的表達(dá)（n = 3）。C) 基于流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果的 CD206 陽性細(xì)胞定量分析和 D) M1/M2 值（n = 3）。E) ROS 熒光強(qiáng)度的定量統(tǒng)計(jì)（n = 3）

（4）V@MP/C@MN 可促進(jìn)體外細(xì)胞遷移和血管生成

圖(a)為劃痕實(shí)驗(yàn)，顯示在低血清環(huán)境下，V@MP/C@MN組的HUVECs細(xì)胞在24小時(shí)內(nèi)顯著向劃痕區(qū)域遷移，空白區(qū)域逐漸縮小，遷移率達(dá)89.96%（圖f）。這表明V@MP/C@MN能夠在體外有效促進(jìn)細(xì)胞遷移。圖(b)展示了血管生成實(shí)驗(yàn)，顯示V@MP/C@MN組形成明顯的血管網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。圖(c)至(e)分別量化了不同組的總管長度、節(jié)點(diǎn)數(shù)量和連接數(shù)。V@MP/C@MN組的管長增加了3.74倍，節(jié)點(diǎn)和連接數(shù)也顯著增加，表明其有效促進(jìn)了血管生成。該效果可能與V@MP中VEGF與內(nèi)皮細(xì)胞的結(jié)合有關(guān)，SCSMA基材有效負(fù)載了VEGF。因此，V@MP/C@MN具備顯著的促血管生成潛力，有望在體內(nèi)促進(jìn)血管新生，加速傷口愈合。

圖4. 體外細(xì)胞遷移和血管生成能力微針檢測。A) 用于細(xì)胞劃痕試驗(yàn)的 HUVEC 光學(xué)圖像。B) 使用不同微針培養(yǎng)的 HUVEC 的體外管形成。C) 血管網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中管總長度、D) 節(jié)點(diǎn)數(shù)量和 E) 連接點(diǎn)數(shù)量的定量評估（n = 3）。F) 細(xì)胞遷移率量化（n = 3）

（5）V@MP/C@MN促進(jìn)體內(nèi)糖尿病潰瘍愈合

圖(a)展示了在不同時(shí)間點(diǎn)各組傷口的愈合過程照片。圖(b)顯示，隨著時(shí)間推移，各組傷口面積逐漸縮小，其中V@MP/C@MN組愈合速度最快，第14天愈合率達(dá)到97.9%。圖(c)為第14天的H&E染色結(jié)果，顯示對照組的肉芽組織最厚，且無毛囊等成熟皮膚附屬物，而V@MP/C@MN組則有致密的表皮和排列良好的真皮層，且可見清晰的毛囊。圖(d)的肉芽組織寬度統(tǒng)計(jì)顯示，與對照組相比，所有處理組的肉芽組織寬度顯著減少，其中V@MP/C@MN組最小，僅為0.53 mm。

圖5.對糖尿病傷口的治療效果。A) 5 組大鼠在第 0、3、7、10 和 14 天傷口面積變化的圖像和示意圖。B) 傷口閉合率的定量分析（n = 3）。C) 第 14 天傷口的 H&E 染色。D) 肉芽組織寬度定量分析（n = 3）

圖(a)的Masson染色結(jié)果顯示，對照組在第14天時(shí)僅有少量稀疏無序的膠原纖維，而V@MP/C@MN組則有更多的膠原沉積，纖維密度、厚度和排列均更為整齊，表明傷口愈合效果接近健康皮膚。圖(e)統(tǒng)計(jì)了各組的膠原沉積量，V@MP/C@MN組顯著高于其他組。圖(b)和(c)分別為IL-4和IL-6的免疫熒光染色結(jié)果，V@MP/C@MN組的IL-4（抗炎因子）顯著增加，而IL-6（促炎因子）顯著減少（圖f和g）。此外，圖(d)的DHE染色顯示，第3天時(shí)V@MP/C@MN組的ROS水平顯著降低，減少了2.31倍（圖h），與體外ROS清除實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。

圖6所示。傷口組織的組織病理學(xué)分析。A)第14天各組大鼠傷口馬松三色染色。B)第3天傷口IL-4免疫熒光染色。C)第3天傷口IL-6免疫熒光染色。D)第3天傷口DHE免疫熒光染色。E)不同處理組膠原沉積定量分析（N = 3） F) IL-4熒光強(qiáng)度定量分析（N = 3） F) IL-6熒光強(qiáng)度定量分析（N = 3） H) DHE熒光強(qiáng)度定量分析（N = 3）

（6）V@MP/C@MN 在體內(nèi)誘導(dǎo) M2 極化

圖(A)為第3天和第7天的CD68/iNOS雙重染色圖像，綠色熒光代表M1型巨噬細(xì)胞。圖(B)統(tǒng)計(jì)了CD68/iNOS細(xì)胞數(shù)量，顯示對照組M1型巨噬細(xì)胞數(shù)量較多，而V@MP/C@MN組的M1型巨噬細(xì)胞數(shù)量顯著減少，特別是在第7天時(shí)減少了4.7倍。圖(C)分析M2型巨噬細(xì)胞的重極化情況，綠色熒光代表M2型巨噬細(xì)胞。圖(D)統(tǒng)計(jì)顯示，與對照組相比，V@MP/C@MN組在第3天和第7天的M2型巨噬細(xì)胞數(shù)量分別增加了2.55倍和2.74倍。V@MP/C@MN通過透皮遞送CONPs并迅速清除ROS，減少了促炎因子，從而促進(jìn)了巨噬細(xì)胞從M1型向M2型的正常轉(zhuǎn)換。

圖7. 微針誘導(dǎo)體內(nèi) M2 極化。A)組織在 3 天和 7 天時(shí)雙重染色 CD68 和 iNOS 的代表性圖像。B) 各組 CD68iNOS 細(xì)胞百分比的量化（n = 3）。C) 治療 3 天和 7 天后組織 CD68 和 CD206 雙重染色的代表性圖像。D) 治療 3 天和 7 天后各組（n = 3）CD68CD206 細(xì)胞百分比的量化

（7）V@MP/C@MN 促進(jìn)體內(nèi)血管生成

在第10天和第14天，利用Moore FLPI血流成像儀對創(chuàng)面周圍的血流進(jìn)行了評估（圖8A和C）。結(jié)果顯示，第10天V@MP/C@MN組的血流量為1081灌注單位，遠(yuǎn)高于對照組（303灌注單位）、MN組（422灌注單位）、C@MN組（501灌注單位）和V@MP@MN組（937灌注單位）。第14天，V@MP/C@MN組的血流量增加到1170灌注單位，比第10天增長了1.08倍。V@MP/C@MN和V@MP@MN組表現(xiàn)出更強(qiáng)的血管生成信號(hào)，能夠?yàn)閯?chuàng)口提供更多的血流。為進(jìn)一步評估血管生成的質(zhì)量，對第10天的組織進(jìn)行了CD31和α-SMA的熒光染色（圖8B和D）。結(jié)果顯示，V@MP/C@MN和V@MP@MN組的CD31和α-SMA陽性閉合環(huán)顯著增加，與前述的創(chuàng)口灌注變化趨勢一致。CD31反映的血管密度在對照組為0.01 ± 0.0015，在V@MP@MN組為0.2 ± 0.0415，而在V@MP/C@MN組為0.44 ± 0.0178。

圖8. 微針促進(jìn)血管生成。A) 第 10 天和第 14 天傷口損傷部位血管生成反應(yīng)的多普勒圖像。B) 第 10 天傷口組織 CD31 和 α-SAM 雙染色的代表性圖像。C) 多普勒血流的定量統(tǒng)計(jì)（N = 3）。D) 血管密度定量分析（N = 3）

【研究小結(jié)】

本研究開發(fā)了一種負(fù)載了V@MP 和 CONPs 的V@MP/C@MN 微針，作用于深層組織，促進(jìn)糖尿病潰瘍的愈合。智能 V@MP/C@MN 的使用實(shí)現(xiàn)了血管內(nèi)皮生長因子和 CONPs 的雙相釋放，并提高了 CONPs 的透皮率；減輕了氧化應(yīng)激，V@MP 促進(jìn)了血管生成；V@MP 和 CONPs 的聯(lián)合給藥協(xié)同促進(jìn)了 M2 巨噬細(xì)胞的表型極化。對V@MP/C@MN多種功能的體外和體內(nèi)系統(tǒng)研究表明，V@MP/C@MN在抗氧化、協(xié)同促進(jìn)巨噬細(xì)胞極化、血管生成和組織再生方面具有顯著療效，V@MP/C@MN多種治療功能的結(jié)合為改善糖尿病潰瘍的愈合提供了新的途徑。