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研究背景：

糖尿?。?/span>DM）是一種以高血糖為特征的慢性代謝性疾病，其發(fā)病率逐年上升，糖尿病骨缺損作為其并發(fā)癥之一因復(fù)雜的病理機(jī)制受到廣泛關(guān)注。高糖環(huán)境會(huì)通過抑制線粒體氧化磷酸化（OXPHOS），減少ATP生成并導(dǎo)致活性氧（ROS）過量產(chǎn)生，進(jìn)一步引發(fā)細(xì)胞衰老和成骨抑制。同時(shí)，ROS還能影響巨噬細(xì)胞極化，破壞骨生成與骨吸收的平衡，細(xì)胞衰老分泌的衰老相關(guān)分泌表型（SASP）因子亦會(huì)惡化周圍微環(huán)境，抑制骨愈合。納米酶作為天然酶的模擬物，具有酶催化活性，可通過清除ROS緩解氧化應(yīng)激。二氧化錳（MnO₂）與鐵蛋白納米籠結(jié)合形成的MnO₂-鐵蛋白納米酶（MF納米酶）表現(xiàn)出優(yōu)異的ROS清除能力，但易在細(xì)胞溶酶體內(nèi)降解，限制了其應(yīng)用。SS31陽離子肽作為線粒體靶向藥物，可穩(wěn)定電子傳遞鏈、減少mtROS泄漏，并與納米顆粒結(jié)合以增強(qiáng)療效。此外，3D打印技術(shù)在糖尿病骨缺損修復(fù)中展現(xiàn)出重要價(jià)值，低溫沉積建模（LDM）技術(shù)可制備多孔骨再生支架，有利于細(xì)胞黏附、遷移和營養(yǎng)擴(kuò)散，同時(shí)避免高溫對(duì)生物活性物質(zhì)的影響。

針對(duì)上述問題，上海交通大學(xué)附屬第六醫(yī)院陶詩聰團(tuán)隊(duì)設(shè)計(jì)了一種基于PAEK-COOH和45S5生物活性玻璃（BG）的低溫沉積建模（LDM）3D打印多級(jí)孔隙支架（PBG），并與MF@SS31（MF@S）納米酶結(jié)合，用于加速糖尿病骨缺損的修復(fù)。該P(yáng)BG-MF@S（PAEK-COOH/45S5 BG-MF@SS31）支架可填充骨缺損區(qū)域，提供機(jī)械支撐，同時(shí)45S5 BG增強(qiáng)了支架的骨整合性能。隨著PBG-MF@S支架的逐步降解，MF@S納米酶滲透到糖尿病骨缺損的微環(huán)境中，并靶向周圍細(xì)胞的線粒體，從而維持線粒體功能，減少ROS的泄漏與積累。同時(shí)，衰老細(xì)胞被激活再生，免疫功能失調(diào)通過減少SASP因子和炎癥因子的分泌，以及調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞極化逐步恢復(fù)，進(jìn)而加速骨缺損區(qū)域的骨沉積。該文章于2024年04月13日以《3D Cryo-Printed Hierarchical Porous Scaffolds Harmonized with Hybrid Nanozymes for Combinatorial Mitochondrial Therapy: Enhanced Diabetic Bone Regeneration via Micromilieu Remodeling》為題發(fā)表于《Advanced Functional Materials》（DOI：10.1002/adfm.202403145）。

（1）MF@S 納米酶的合成和表征

研究表明，人重組鐵蛋白重鏈（HFn）具有出色的蛋白支架性能，其籠狀結(jié)構(gòu)可原位包裹MnO?顆粒，模擬生物酶的功能。透射電子顯微鏡（TEM）的結(jié)果如圖1A所示，空鐵蛋白（APF）具有中空結(jié)構(gòu)，而MF納米酶的中空結(jié)構(gòu)消失，表明MnO₂顆粒已成功嵌入APF內(nèi)。進(jìn)一步測(cè)試MF納米酶的生物酶功能，結(jié)果如圖1B、C所示，其具有類似過氧化氫酶（CAT）和超氧化物歧化酶（SOD）的活性，并且酶活性隨MF納米酶濃度增加而增強(qiáng)，同時(shí)其過氧化物酶（POD）活性較低。此外，MF納米酶與帶正電荷的肽SS31通過靜電相互作用結(jié)合形成MF@S納米酶（圖1D）。動(dòng)態(tài)光散射（DLS）和尺寸分布結(jié)果如圖1E、F所示，SS31、MF納米酶和MF@S納米酶的Zeta電位分為19.47 ± 10.12 mV、?24.59 ± 4.67 mV和?0.04 ± 0.48 mV，SS31、MF納米酶和MF@S納米酶的平均直徑分別為425.70 ± 85.78、30.59 ± 2.16 和203.90 ± 62.91 nm，證實(shí)了兩者的電荷相互作用。TEM進(jìn)一步觀察了SS31、MF納米酶和MF@S納米酶的形態(tài)特征，結(jié)果如圖1G所示，MF納米酶為均勻的球形，而MF@S納米酶表面包覆了一層SS31。通過拉下實(shí)驗(yàn)和表面等離子體共振（SPR）實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了SS31與MF納米酶的結(jié)合能力，結(jié)果顯示SS31與HFn的解離常數(shù)（KD）為4.381 μm，表明二者結(jié)合緊密（圖1H-J）。

圖1. SS31增強(qiáng)的二氧化錳（MnO₂）-鐵蛋白生物仿生納米酶（MF@S納米酶）的特性。A. 鐵蛋白（APF）和仿生設(shè)計(jì)的二氧化錳-鐵蛋白納米酶（MF納米酶）的TEM圖像；B. MF納米酶的類似過氧化氫酶（CAT）的相對(duì)活性；C. MF納米酶的相對(duì)超氧化物歧化酶（SOD）樣活性；D. MF納米酶的催化活性和MF@S納米酶的合成示意圖；E. SS31、MF納米酶和MF@S納米酶的Zeta電位；F. SS31、MF納米酶和MF@S納米酶的粒度分布；G. SS31、MF納米酶和MF@S納米酶的TEM圖像；H. 用Western印跡法檢測(cè)重組人鐵蛋白重鏈（HFn）；I. SS31-FITC 的熒光強(qiáng)度；J. SPR檢測(cè)顯示了HFn與SS31的相互作用

（2）探索MF@S納米酶的生物學(xué)功能

為了揭示MF@S納米酶的潛在生物功能，采用RNA-seq分析其對(duì)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（HBMSCs）基因轉(zhuǎn)錄的影響，發(fā)現(xiàn)188個(gè)顯著差異表達(dá)基因（DEGs），其中57個(gè)顯著下調(diào)，131個(gè)顯著上調(diào)（圖2A）。通過GO（圖2B）、KEGG（圖2C）、WikiPathways（圖2D）和Reactome（圖2E）進(jìn)行通路富集分析，結(jié)果顯示與炎癥及抗炎相關(guān)通路、血管生成相關(guān)通路、成骨相關(guān)通路、氧化應(yīng)激相關(guān)通路等。此外，GSEA分析進(jìn)一步表明，除血管生成、炎癥和成骨通路外，還涉及細(xì)胞遷移、細(xì)胞粘附、細(xì)胞分裂及氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的衰老通路（圖2F）。這些結(jié)果表明，MF@S納米酶可能影響成骨、血管生成、炎癥、氧化應(yīng)激及衰老等多種生物學(xué)通路。

圖2. 使用 RNA-seq 探索MF@S納米酶的生物學(xué)功能。A. 響應(yīng) MF@S 納米酶處理的差異表達(dá)基因的火山圖；B-F. RNA-seq 后 GO、KEGG、WikiPathways、Reactome 和 GSEA 通路富集分析的結(jié)果

（3）MF@S納米酶的抗氧化、遷移、血管化和抗衰老作用

在糖尿病中，高血糖微環(huán)境會(huì)誘導(dǎo)大量活性氧（ROS）的生成，顯著影響細(xì)胞功能。為模擬高ROS水平的病理環(huán)境，研究采用叔丁基過氧化氫（TBHP）處理細(xì)胞，并通過2′,7′-二氯二氫熒光素二乙酸鹽（DCFH-DA）檢測(cè)MF@S納米酶的ROS清除能力，結(jié)果如圖3A所示，TBHP顯著提高了細(xì)胞內(nèi)ROS水平，而SS31、MF納米酶和MF@S納米酶均能夠顯著降低ROS水平，表明其具有優(yōu)異的抗氧化性能。在高ROS條件下，Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，TBHP處理顯著抑制了HMEC-1和HBMSCs的遷移能力，而SS31、MF納米酶和MF@S納米酶均能恢復(fù)細(xì)胞遷移能力，其中MF@S納米酶效果最為顯著（圖3B）。在血管生成能力測(cè)試中，管腔形成實(shí)驗(yàn)表明，ROS顯著降低了HMEC-1形成毛細(xì)血管樣結(jié)構(gòu)的能力，而MF@S納米酶顯著恢復(fù)了這一能力（圖3C）。基于RNA-seq分析，還研究了MF@S納米酶對(duì)氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞衰老的影響，衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）活性檢測(cè)如圖3D所示，TBHP處理顯著增加了SA-β-gal陽性細(xì)胞的比例，而SS31、MF納米酶和MF@S納米酶能夠有效抑制ROS誘導(dǎo)的細(xì)胞衰老，其中MF@S納米酶的效果最為顯著。這些結(jié)果表明，MF@S納米酶具有卓越的抗氧化、促進(jìn)細(xì)胞遷移和血管生成能力，并能有效抑制氧化應(yīng)激引起的細(xì)胞衰老。

圖3. MF@S納米酶對(duì)抗氧化、遷移、血管形成和抗衰老的影響。A. 2'，7'-二氯熒光素二乙酸酯（DCFH-DA）測(cè)定不同處理后叔丁基過氧化氫（TBHP）刺激的永生化人微血管內(nèi)皮細(xì)胞（HMEC-1）細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）水平的熒光圖像分析；B. 不同處理后HMEC-1和人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（HBMSCs）與TBHP刺激細(xì)胞的遷移評(píng)估；C. 不同處理后TBHP刺激細(xì)胞的HMEC-1的成管測(cè)定；D. SA-β-gal染色顯示TBHP刺激細(xì)胞在不同處理后HBMSCs的細(xì)胞衰老

（4）MF@S 納米酶的體外年輕化作用

EdU增殖實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了MF@S納米酶的細(xì)胞年輕化作用。結(jié)果顯示，在對(duì)照組和MF@S組中，細(xì)胞核均呈現(xiàn)大量綠色熒光標(biāo)記，而TBHP組的綠色熒光細(xì)胞顯著減少；但在TBHP+MF@S組中，細(xì)胞核的EdU標(biāo)記顯著增加（圖4A）。同時(shí)，免疫熒光檢測(cè)衰老標(biāo)志物γ-H2AX的實(shí)驗(yàn)表明，TBHP組顯示大量綠色熒光標(biāo)記，提示DNA損傷，而TBHP+MF@S組綠色熒光顯著減少（圖4B）。這些結(jié)果表明，高ROS環(huán)境會(huì)抑制DNA合成、增加DNA損傷并加速細(xì)胞衰老，而MF@S納米酶可以減少ROS引起的DNA損傷，從而在高ROS環(huán)境下實(shí)現(xiàn)HBMSCs的年輕化。此外，通過檢測(cè)衰老標(biāo)志物p16和p21的mRNA相對(duì)表達(dá)水平，進(jìn)一步確認(rèn)了MF@S納米酶的年輕化效果，結(jié)果如圖4C所示，ROS誘導(dǎo)后，p16和p21的表達(dá)水平顯著升高，而與TBHP組相比，TBHP+MF@S組顯著降低了這兩種基因的表達(dá)。同時(shí)，檢測(cè)分泌性表型相關(guān)因子（SASP）包括基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP1、MMP10）、IL-1β、腫瘤壞死因子α（TNF-α）、IL-8及C-X-C基序趨化因子配體3（CXCL3）的mRNA表達(dá)水平顯示，TBHP刺激顯著增加了SASP因子的表達(dá)，而MF@S納米酶能夠顯著抑制這些因子的表達(dá)。這些結(jié)果表明，MF@S納米酶在高ROS微環(huán)境下通過降低DNA損傷、抑制衰老相關(guān)基因和SASP因子的表達(dá)，具有顯著的細(xì)胞年輕化作用。

圖4. MF@S納米酶在HBMSCs中的年輕化作用。A. 不同處理后EdU分析的熒光圖像；B.γ-H2AX染色檢測(cè)不同處理后的DNA損傷；C. 不同處理后p16、p21和SASP因子（MMP1、MMP10、IL-1β、TNF-α、IL-8、CXCL3）的相對(duì)mRNA表達(dá)水平

（5）體外MF@S納米酶對(duì)HBMSCs的成骨分化

通過堿性磷酸酶（ALP）染色和茜素紅S（ARS）染色評(píng)估HBMSCs的成骨分化能力。ALP活性是成骨分化的早期標(biāo)志，結(jié)果顯示，與正常條件（對(duì)照組）相比，高ROS微環(huán)境（TBHP組）顯著抑制了ALP的表達(dá)。然而，與TBHP組相比，SS31、MF納米酶和MF@S納米酶顯著增強(qiáng)了ALP的表達(dá)，其中MF@S納米酶組的ALP活性最高（圖5A）。茜素紅S染色用于評(píng)估鈣結(jié)節(jié)的形成，結(jié)果與ALP染色一致，MF@S納米酶組在所有高ROS環(huán)境組中顯示最強(qiáng)、分布最廣的鈣結(jié)節(jié)染色（圖5B）。此外，通過RT-qPCR檢測(cè)了高ROS環(huán)境下MF@S納米酶對(duì)成骨相關(guān)基因（如I型膠原COL1A1和RUNX2、骨形態(tài)發(fā)生蛋白2（BMP2）和骨橋蛋白（OPN））表達(dá)的影響。結(jié)果如圖5C所示，TBHP顯著抑制了這些基因的表達(dá)，而SS31、MF納米酶和MF@S納米酶均能夠減輕高ROS對(duì)成骨相關(guān)基因表達(dá)的抑制作用，其中MF@S納米酶效果最為顯著。

圖5. 體外MF@S納米酶對(duì)HBMSCs的成骨分化。A. ALP染色用于評(píng)估HBMSCs在高ROS條件下不同處理14 d后的成骨能力；B. ARS染色評(píng)估了在高ROS條件下14 d的不同處理后的成骨能力；C. 正常條件下MF@S納米酶處理后成骨相關(guān)基因（COL1A1、RUNX2、BMP2、OPN）的相對(duì)mRNA表達(dá)水平

（6）MF@S 納米酶的體外抗破骨細(xì)胞分化作用

   骨骼系統(tǒng)是一個(gè)動(dòng)態(tài)且持續(xù)重塑的結(jié)構(gòu)，在正常情況下，骨吸收與骨形成之間保持平衡，從而維持骨骼的完整性和強(qiáng)度，在骨缺損修復(fù)過程中，抑制破骨細(xì)胞的形成可以減少缺損部位的骨吸收，從而促進(jìn)骨缺損的愈合。通過TRAP染色評(píng)估破骨細(xì)胞的酶活性，結(jié)果如圖6A所示，在分化培養(yǎng)7天后，TBHP組中TRAP陽性破骨細(xì)胞數(shù)量最多，其次是對(duì)照組，而TBHP+MF@S組和MF@S組中破骨細(xì)胞數(shù)量明顯減少。使用FITC-鬼筆環(huán)肽（F-actin）和DAPI染色進(jìn)一步評(píng)估破骨細(xì)胞的多核化和F-actin環(huán)的形成，結(jié)果如圖6B所示，TBHP組顯示出大量巨大的多核細(xì)胞和熒光F-actin環(huán)，而MF@S組和TBHP+MF@S組僅觀察到少量小型多核細(xì)胞和F-actin環(huán)，這些結(jié)果表明，高ROS微環(huán)境促進(jìn)了破骨細(xì)胞的分化，而MF@S納米酶能夠抑制破骨細(xì)胞的分化，即使在高ROS條件下亦如此。進(jìn)一步通過骨切片評(píng)估破骨細(xì)胞誘導(dǎo)的骨吸收，結(jié)果顯示，TBHP組和對(duì)照組的骨切片上存在大量骨吸收陷窩，其吸收面積和深度顯著高于TBHP+MF@S組和MF@S組（圖6C）。這表明，MF@S納米酶能夠有效抑制破骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨吸收，從而有助于骨缺損的修復(fù)。

圖6. MF@S納米酶的體外抗破骨細(xì)胞分化作用。A. TRAP染色用于評(píng)估破骨細(xì)胞分化；B. 破骨細(xì)胞的熒光圖像；C. 破骨細(xì)胞挖掘的吸收空隙的SEM圖像

（7）MF@S納米酶體外調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞極化

在糖尿病骨缺損的高血糖微環(huán)境中，失調(diào)的巨噬細(xì)胞極化在慢性炎癥中起關(guān)鍵作用，因此，研究了MF@S納米酶對(duì)巨噬細(xì)胞極化的影響。通過免疫熒光染色標(biāo)記不同亞型的巨噬細(xì)胞，使用iNOS標(biāo)記M1型巨噬細(xì)胞，CD206標(biāo)記M2型巨噬細(xì)胞。結(jié)果如圖7A所示，與對(duì)照組相比，經(jīng)SS31、MF納米酶或MF@S納米酶處理的細(xì)胞中，iNOS陽性細(xì)胞數(shù)量減少，其中MF@S組的iNOS陽性細(xì)胞最少。在M2型巨噬細(xì)胞極化實(shí)驗(yàn)中，MF@S組觀察到大量CD206陽性細(xì)胞，SS31組和MF組也有部分CD206陽性細(xì)胞，而對(duì)照組中僅有少量CD206陽性細(xì)胞。進(jìn)一步通過流式細(xì)胞術(shù)評(píng)估MF@S納米酶對(duì)M1型巨噬細(xì)胞極化的影響，結(jié)果顯示，MF@S組的CD86陽性細(xì)胞比例最低，其次是SS31組、MF組和對(duì)照組；在M2型巨噬細(xì)胞極化實(shí)驗(yàn)中，MF@S組的CD206陽性細(xì)胞比例最高，其次是SS31組、MF組和對(duì)照組（圖7B）。這些結(jié)果表明，MF@S納米酶能夠顯著抑制M1型巨噬細(xì)胞的極化，同時(shí)促進(jìn)M2型巨噬細(xì)胞的極化，有助于緩解炎癥并改善骨缺損微環(huán)境。

圖7. 體外通過MF@S納米酶調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞極化。A. 不同處理后巨噬細(xì)胞極化的熒光圖像；B. 不同處理后M1巨噬細(xì)胞（F4/80和CD86）和M2巨噬細(xì)胞（F4/80和CD206）極化的流式細(xì)胞術(shù)分析

（8）低溫三維打印分層多孔支架

通過LDM技術(shù)制備了PBG、PBG-SS31、PBG-MF和PBG-MF@S支架（圖8A），其整體外觀如圖8B所示，掃描電子顯微鏡（SEM）用于分析支架的表面形貌，結(jié)果表明，這些支架由正交排列的纖維構(gòu)成，纖維表面分布有微孔，形成分級(jí)多孔的海綿狀結(jié)構(gòu)（圖8C）。進(jìn)一步對(duì)纖維內(nèi)部結(jié)構(gòu)進(jìn)行SEM分析，結(jié)果顯示如圖8D所示，所有支架的纖維橫截面呈蜂窩狀，支架的孔隙率分別為75.90±1.75%（PBG）、71.96±4.62%（PBG-SS31）、75.01±1.48%（PBG-MF）和76.19±1.61%（PBG-MF@S）。

圖8. PAEK-COOH/45S5 BG-MF@SS31（PBG-MF@S）支架的特性。A. PBG-MF@S支架制造過程示意圖；B. 四種支架的照片；C. 四種支架表面形態(tài)的SEM圖像；D. 纖維橫截面的SEM圖像

（9）PBG-MF@S 支架的生物相容性

在四種支架（PBG、PBG-SS31、PBG-MF和PBG-MF@S）支架上培養(yǎng)HMEC-1和HBMSCs 3天后，使用Live/Dead試劑盒對(duì)其進(jìn)行染色。結(jié)果如圖9A所示，支架上幾乎沒有死亡細(xì)胞，絕大多數(shù)細(xì)胞存活并呈綠色熒光。隨后，通過掃描電子顯微鏡（SEM）觀察細(xì)胞在支架上的黏附和形態(tài)特征，結(jié)果如圖9B所示，細(xì)胞在支架的微孔作用下牢固黏附并鋪展，四種支架之間在生物相容性上沒有顯著差異，表明它們均具有優(yōu)異的細(xì)胞相容性。

圖9. PBG-MF@S支架的體外生物相容性。A. 在不同支架上培養(yǎng)3天后HMEC-1和HBMSCs的活/死染色；B. HMEC-1和HBMSCs在不同支架上培養(yǎng)3天后的SEM圖像

（10）PBG-MF@S 體內(nèi)骨再生作用

該研究評(píng)估了PBG-MF@S支架對(duì)糖尿病大鼠5毫米關(guān)鍵尺寸顱骨缺損骨再生的影響。通過微型計(jì)算機(jī)斷層掃描（micro-CT）分析植入12周后的新骨形成情況，結(jié)果如圖10A所示，三維重建和橫截面視圖表明，對(duì)照組的骨缺損未修復(fù)，而所有支架組（PBG、PBG-SS31、PBG-MF和PBG-MF@S）均顯著增加了骨組織的再生量，其中PBG-MF@S組的新骨再生量最多，該結(jié)果表明，在糖尿病大鼠的關(guān)鍵尺寸骨缺損中，自行修復(fù)難以實(shí)現(xiàn)，而PBG-MF@S支架在促進(jìn)骨組織再生方面表現(xiàn)出卓越的效果。通過蘇木精-伊紅（H&E）染色（圖10B）和Masson三色染色（圖10C）進(jìn)一步評(píng)估骨生成能力，結(jié)果顯示，對(duì)照組在骨缺損處幾乎沒有新骨組織和膠原沉積，而PBG-MF@S支架的新骨形成和膠原沉積水平最高，其次是PBG-MF、PBG-SS31和PBG支架。此外，PBG-MF@S支架在支架內(nèi)部和周圍區(qū)域均表現(xiàn)出豐富的纖維結(jié)締組織和再生骨組織，而其他支架組的再生骨組織主要集中在支架的內(nèi)部或周圍區(qū)域。通過免疫熒光（IF）染色用于評(píng)估I型膠原（COLI）的表達(dá)，結(jié)果如圖10D所示，PBG-MF@S支架的COLI表達(dá)水平最高且最為成熟，其次是PBG-MF、PBG-SS31和PBG支架，而對(duì)照組的COLI表達(dá)最少。這些結(jié)果表明，PBG-MF@S支架在糖尿病關(guān)鍵尺寸骨缺損模型中具有顯著促進(jìn)新骨形成的能力。

圖10. PBG-MF@S支架對(duì)體內(nèi)促進(jìn)骨再生的影響。A. 植入支架12周的顯微CT圖像；B. 顱骨缺損組織切片的H&E染色圖像；C. 顱骨缺損的Masson三色染色組織切片的組織學(xué)圖像；D. COLI的免疫熒光（IF）染色

血管生成在成骨過程中起著重要作用，通過提供營養(yǎng)和氧氣支持骨組織的形成。通過Micro-CT掃描Microfil灌注的血管以可視化新生血管，結(jié)果如圖11A所示，對(duì)照組的血管生成水平最低，PBG支架組的血管生成仍較差，而PBG-SS31、PBG-MF和PBG-MF@S支架組均表現(xiàn)出顯著增強(qiáng)的血管生成，其中PBG-MF@S支架組效果最為顯著。此外，通過免疫熒光（IF）染色評(píng)估血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）的表達(dá)（圖11B），對(duì)照組（無支架植入）顯示出最低的熒光強(qiáng)度，而植入支架后VEGF表達(dá)顯著增加。相比PBG支架組，PBG-SS31、PBG-MF和PBG-MF@S支架組的VEGF表達(dá)水平更高，其中PBG-MF@S支架組的表達(dá)量最高。這些結(jié)果表明，PBG-MF@S支架能顯著促進(jìn)血管生成。為了研究巨噬細(xì)胞的極化，采用免疫熒光染色標(biāo)記M1型巨噬細(xì)胞（CD86）和M2型巨噬細(xì)胞（CD206）（圖11C、D）。結(jié)果顯示，PBG-MF@S組中CD206陽性細(xì)胞最多，而CD86陽性細(xì)胞最少；PBG-MF和PBG-SS31組也表現(xiàn)出大量CD206陽性細(xì)胞，依次高于PBG組和對(duì)照組。此外，對(duì)照組和PBG組檢測(cè)到大量CD86陽性細(xì)胞，而PBG-MF和PBG-SS31組僅檢測(cè)到少量CD86陽性細(xì)胞。這些數(shù)據(jù)表明，PBG-MF@S支架具有最強(qiáng)的免疫調(diào)節(jié)作用，能夠促進(jìn)M2型巨噬細(xì)胞極化并抑制M1型巨噬細(xì)胞極化。

圖11. PBG-MF@S支架對(duì)體內(nèi)促進(jìn)新生血管形成和調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞極化的作用。A. 支架植入7周后通過顯微CT重建新形成的血管；B. VEGF的IF染色；C，D. CD86（紅色）、CD206（綠色）和DAPI（藍(lán)色）的IF染色

研究小結(jié)：

該團(tuán)隊(duì)成功制造了一種3D冷凍打印的分層多孔支架，與雜交納米酶相協(xié)調(diào)，它提供了一種組合線粒體治療系統(tǒng)，以重塑糖尿病微生物并促進(jìn)糖尿病骨骼再生。該支架具有多級(jí)多孔結(jié)構(gòu)，為細(xì)胞向內(nèi)生長、粘附、遷移和營養(yǎng)交換提供了良好的條件。MF@S納米酶有效清除ROS，改善線粒體功能，使衰老細(xì)胞恢復(fù)活力，調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞極化，促進(jìn)成骨細(xì)胞分化，并抑制破骨細(xì)胞分化。PBG-MF@S 支架促進(jìn)膠原纖維沉積、新生血管形成和骨沉積，并加速骨缺損修復(fù)。研究結(jié)果表明，PBG-MF@S 支架在治療糖尿病骨缺損方面具有巨大潛力。