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關(guān)節(jié)軟骨位于活動骨骼的末端，其自愈能力有限，且一旦發(fā)生退行性病變，常常導(dǎo)致骨關(guān)節(jié)炎（OA）的發(fā)作。OA的關(guān)鍵病理過程之一是軟骨組織的退化，特別是在軟骨缺損的部位，治療這些缺損帶來了巨大的挑戰(zhàn)。近年來，間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）靶向再生已被認(rèn)為是軟骨組織工程的重要途徑之一，且被認(rèn)為是治療OA的最有效策略之一。然而，基于干細(xì)胞的治療也存在局限性，例如，干細(xì)胞在定向誘導(dǎo)軟骨形成方面的能力較弱，以及軟骨修復(fù)過程中的機(jī)械強(qiáng)度降低。此外，軟骨組織固有的無血管和無神經(jīng)特性使得關(guān)節(jié)軟骨缺損的治療更加復(fù)雜。為了解決這些問題，基因療法，尤其是利用功能性RNA和生物材料輔助框架，已成為軟骨再生中的一種前景廣闊的策略。微小RNA（miRNA）因其能夠精準(zhǔn)調(diào)控靶基因及其相關(guān)途徑的空間和時間表達(dá)，已被發(fā)現(xiàn)對軟骨發(fā)育和軟骨形成具有重要作用。特別是在OA患者的軟骨祖細(xì)胞/干細(xì)胞（CPCs）中，miR140-5p水平的顯著降低與OA的發(fā)生密切相關(guān)。因此，miR140-5p的靶向遞送和表達(dá)調(diào)控成為一種潛在的治療策略，為軟骨再生提供了新的研究方向。

針對上述問題，北京協(xié)和醫(yī)院翁習(xí)生團(tuán)隊開發(fā)并制備了一種自愈水凝膠（miR140-5p-CaP@mSF-HA-NB），用于控制軟骨再生的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子miR140-5p的釋放。水凝膠通過紫外線輻射交聯(lián)，由胺化透明質(zhì)酸和改性光敏劑（NB）組成。為了提高支架的結(jié)構(gòu)完整性并增強(qiáng)基因傳遞效率，礦化絲素蛋白蛋白和負(fù)載miR140-5p的MON-PEI納米顆粒被添加到水凝膠中。該自愈合水凝膠的設(shè)計，采用透明質(zhì)酸（HA-NB）與改性透明質(zhì)酸（AHA）之間的動態(tài)希夫堿鍵連接，這種特殊的結(jié)構(gòu)賦予了水凝膠出色的自修復(fù)能力。每當(dāng)水凝膠受到外力破壞，破損的部分可以在接觸后迅速通過席夫堿鍵的重新形成恢復(fù)原狀，避免了水凝膠在體內(nèi)應(yīng)用時的損壞。這一獨(dú)特特性使得該水凝膠在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，尤其是關(guān)節(jié)治療中，具有極高的應(yīng)用潛力。此外，基于透明質(zhì)酸的自愈水凝膠因其卓越的潤滑性能，特別適合用于關(guān)節(jié)內(nèi)的治療，能夠有效減輕軟骨損傷帶來的臨床挑戰(zhàn)。因此，這種基因激活水凝膠在治療關(guān)節(jié)軟骨缺損方面具有重要的臨床應(yīng)用潛力。該文章于2024年11月05日以《Self-Healing Hyaluronic Acid-based Hydrogel with miRNA140-5p Loaded MON-PEI Nanoparticles for Chondrocyte Regeneration: Schiff Base Self-AssemblyApproach》為題發(fā)表于《 Bioactive Materials 》（DOI：10.1002/advs.20240）。

(1) CaP@mSF和MON-PEI納米顆粒的特性

mSF 和 CaP@mSF 的紅外光譜（圖 1A）顯示，mSF 在 1650 cm^-1處的吸收峰對應(yīng)于酰胺 I 帶 C=O 的拉伸振動吸收峰。將磷酸鈣涂覆在 mSF 表面后，酰胺 I 帶 C=O 的吸收峰出現(xiàn)了向低波長的位移（1634 cm^-1），表明 Ca2? 與微纖維的羧基之間發(fā)生了相互作用。在 XRD 圖譜（圖 1B）中，mSF 在20.7°處的寬峰屬于 β-折疊晶區(qū)，表明 mSF 存在有序的內(nèi)部結(jié)構(gòu)。經(jīng)過 7 天的生物礦化，CaP@mSF的吸收峰出現(xiàn)在29.64°、31.64°、35.98°、39.64°和47.02°，證明了磷酸鈣在 mSF 表面存在。在熱重曲線（圖 1C）中，mSF 和 CaP@mSF 都在約 100°C 時失去約 8.333% 的水分。扣除水分后，mSF 的殘留比例為 30.451%，CaP@mSF 的殘留比例為 37.3%，表明所制備的 CaP@mSF 中磷酸鈣的比例約為 6.849%。微纖維絲浸泡在礦化介質(zhì)中，并在礦化過程中使用磁力攪拌防止 mSF 凝結(jié)。經(jīng)過 7 天礦化，鈣磷完全涂覆在 mSF 樣品表面。掃描電子顯微鏡（圖 1D）結(jié)果顯示，未礦化的 mSF 在第 0 天呈現(xiàn)光滑的微纖維結(jié)構(gòu)；在第 4 天 mSF 表面出現(xiàn)了磷酸鈣晶體；經(jīng)過 7 天礦化后，mSF 表面幾乎完全被磷酸鈣覆蓋。圖 1E 展示了所制備的介孔有機(jī)硅（MON）材料的透射電子顯微鏡圖像，呈現(xiàn)出類似雪花的多孔分支結(jié)構(gòu)，這歸因于加入了BTES，提升了其接枝聚乙烯亞胺（PEI）和載入 SiRNA 的能力。在 MON-COOH 的制備過程中，介孔硅粒子的粒徑明顯增大，可能是由于 MON-COOH 粒子間通過靜電吸附聚集了羧基和氨基。經(jīng)過 PEI 接枝后，MON-PEI 的粒徑恢復(fù)到與 MON 和 MON-NH₂ 類似的水平，表明 MON-COOH 中的羧基和 PEI 接枝減弱了粒子間的靜電相互作用。最終，MON-PEI 的 Zeta 電位為 34.1 ± 0.21 mV，為 SiRNA 裝載提供了有利條件（圖 1H、F、G ）。圖 1I 中 MON-PEI/miR140-5p 復(fù)合物的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果。隨著 N/P 比例的增加，MON-PEI 與 miR140-5p 形成穩(wěn)定復(fù)合物，證明其在基因遞送中的有效性。N/P 比例超過 20 時，miR140-5p 遷移受限，表明成功包裹 RNA，從而提高了載荷穩(wěn)定性。

圖1. A) mSF 和 CaP@mSF 的紅外光譜圖；B) mSF 和 CaP@mSF 的 X 射線衍射譜圖；C) mSF 和 CaP@mSF 的熱重曲線；D) mSF 在 0d、4d 和 7d 的礦化度；E) MON 納米顆粒的TEM；F) MON、MON-MH2、MON-COOH 和 MON-PEI 的平均粒徑；G) MON、MON-MH2、MON-COOH 和 MON-PEI 的 zeta 電位；H) MON、MON-MH2、MON-COOH 和 MON-PEI 的粒度分布圖；I) MON-PEI 納米粒子與 miR140-5p 的凝膠電泳

(2) 生物聚合物粘合劑和CaP@mSF-HA-NB水凝膠的評價

在紅外光譜（圖 2A）中，HA-NB 和 AHA 在約 1650 cm?1 處顯示出酰胺 I 帶 C=O 的吸收峰，表明成功修飾。核磁共振（圖 2B）進(jìn)一步確認(rèn)了HA-NB中苯環(huán)氫的存在，證明了NB基團(tuán)成功接枝到透明質(zhì)酸上。紫外光譜（圖 2C）顯示，HA-NB在350 nm和307 nm處具有吸收峰，支持了NB結(jié)構(gòu)中的大π鍵的存在，并證明了UV照射后NB的結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化，形成了能夠與AHA氨基反應(yīng)的醛基結(jié)構(gòu)。圖 2E 展示了水凝膠的自愈合能力。將水凝膠切開后，綠色染料加入水凝膠中，當(dāng)兩個切面接觸時，它們會迅速恢復(fù)結(jié)合，顯示出自愈合特性。此外，水凝膠在水環(huán)境中自然膨脹并逐漸降解，釋放含miR140-5p的MON-PEI納米顆粒，釋放過程主要通過分子擴(kuò)散完成。掃描電子顯微鏡（圖 2D）顯示，水凝膠的孔隙尺寸和密度隨著HA-NB濃度的增加而變化。隨著HA-NB濃度的增加，水凝膠的交聯(lián)度增強(qiáng)，導(dǎo)致孔隙尺寸減小，孔隙密度增加。圖 2F、G顯示了UV固化水凝膠的彈性模量（G'）和粘性模量（G''）隨時間和頻率的變化，所有組別均保持G' > G''，表明水凝膠在適當(dāng)條件下保持穩(wěn)定的凝膠狀態(tài)。隨著HA-NB濃度的增加，G'顯著增強(qiáng)，表明水凝膠的力學(xué)強(qiáng)度有所提升。

圖2. A) AHA、HA-NB 和 HA 的紅外光譜；B) AHA、HA-NB 和 HA 的核磁共振譜；C) AHA、HA-NB 和 HA 的紫外光譜圖；D) 不同比例 HA-NB/AHA 水凝膠的掃描電鏡；E) CaP@mSFHA-NB 水凝膠的自愈合能力；F、G）：不同組水凝膠的流變特性

(3) miR140-5p-CaP@mSF-HA-NB表現(xiàn)出高生物相容性并促進(jìn)hBMSCs的軟骨分化

通過細(xì)胞計數(shù)試劑盒-8（CCK-8）檢測，hBMSC在與不同濃度的CaP@mSF-HA-NB提取物共同培養(yǎng)5天后，發(fā)現(xiàn)10%、25%和50%的提取物顯著促進(jìn)了細(xì)胞增殖（圖3A）。然而，在100%濃度下，細(xì)胞增殖與0%組無顯著差異，表明該材料具有良好的生物相容性。為了驗證CaP@mSF-HA-NB對miR140-5p的傳遞效果，使用定量實時PCR檢測miR140-5p模擬物在hBMSC中的轉(zhuǎn)染效率。結(jié)果顯示，miR140-5p-CaP@mSF-HA-NB組的miR140-5p表達(dá)顯著高于單獨(dú)處理miR140-5p組（圖3B2），說明該復(fù)合材料能夠更有效地穩(wěn)定miR140-5p，增強(qiáng)其在體外的穩(wěn)定性。進(jìn)一步使用RNA提取、RT-PCR和轉(zhuǎn)錄組測序（RNA-Seq）檢測四組細(xì)胞（NC模擬物、miR140-5p模擬物、miR140-5p-CaP@mSF-HA-NB、NC-CaP@mSF-HA-NB）的軟骨生成基因表達(dá)情況。結(jié)果表明，miR140-5p-CaP@mSF-HA-NB組的軟骨生成基因COL2A1和ADAMTS5的表達(dá)顯著高于其他組（圖3B3），提示miR140-5p-CaP@mSF-HA-NB組能有效誘導(dǎo)hBMSC向軟骨分化。RNA-Seq分析顯示miR140-5p-CaP@mSF-HA-NB組與NC組之間存在顯著的基因表達(dá)差異。KEGG分析揭示，miR140-5p-CaP@mSF-HA-NB組富集了與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、PI3K-Akt、MAPK、TGF-β等與軟骨生成和骨生成相關(guān)的信號通路（圖3E）。GSEA分析也顯示，在與關(guān)節(jié)炎相關(guān)的通路中，差異表達(dá)基因（DEGs）呈現(xiàn)顯著富集（圖3F）。此外，DEGs列表中出現(xiàn)了多種特異性表達(dá)于軟骨細(xì)胞的基因，進(jìn)一步支持了miR140-5p-CaP@mSF-HA-NB組能夠顯著促進(jìn)hBMSC的軟骨生成趨勢（圖3G）。

圖3. A) CCK-8結(jié)果描述了不同濃度的CaP@mSF-HA-NB提取物與細(xì)胞培養(yǎng)基混合培養(yǎng)5天后hBMSCs的增殖情況；B)細(xì)胞轉(zhuǎn)染培養(yǎng)48 h后，NC、miR140-5p、NC-CaP@mSF-HA-NB、miR140-5p-CaP@mSF-HA-NB四組細(xì)胞中miR140-5p、ADAMTS5、COL2A1的表達(dá)情況；C) RNA-Seq熱圖顯示NC、miR140-5p、NC-CaP@mSF-HA-NB和miR140-5p-CaP@mSF-HA-NB四組的deg；D) miR140-5p-CaP@mSF-HA-NB vs NC組轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)散點圖；E) miR140-5p-CaP@mSF-HA-NB vs NC組DEGs的KEGG分類；F) miR140-5p-CaP@mSF-HA-NB vs NC中DisGeNET富集分析的GSEA結(jié)果；G)骨性關(guān)節(jié)炎膝關(guān)節(jié)DEGs列表（C0409959, DisGeNET） miR140-5p-CaP@mSF-HA-NB vs NC

(4) MiR140-5p-CaP@mSF-HA-NB治療促進(jìn)OA細(xì)胞模型軟骨細(xì)胞增殖

圖4A和圖4B在IL-1β誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎模型中，C28/I2細(xì)胞的增殖明顯受到抑制。相比于對照組，IL-1β組的細(xì)胞增殖顯著下降。然而，經(jīng)過miR140-5p-CaP@mSF-HA-NB治療后，C28/I2細(xì)胞的增殖率恢復(fù)至正常水平。使用流式細(xì)胞術(shù)對細(xì)胞凋亡進(jìn)行評估（圖4C，圖4D），結(jié)果顯示，與對照組相比，IL-1β組細(xì)胞凋亡顯著增加。而miR140-5p-CaP@mSF-HA-NB治療后，細(xì)胞凋亡顯著減少，幾乎完全逆轉(zhuǎn)了IL-1β引起的凋亡效應(yīng)。這些結(jié)果與EdU染色法的檢測結(jié)果一致，表明miR140-5p-CaP@mSF-HA-NB促進(jìn)了OA細(xì)胞的增殖并減緩了其凋亡。流式細(xì)胞術(shù)還進(jìn)行了細(xì)胞周期分析，評估了C28/I2細(xì)胞在不同周期階段的分布情況。IL-1β組的G1期細(xì)胞比例顯著高于對照組，且S期細(xì)胞比例明顯降低，提示IL-1β組細(xì)胞存在G1期停滯現(xiàn)象。而miR140-5p-CaP@mSF-HA-NB治療后，IL-1β誘導(dǎo)的細(xì)胞周期變化得到了有效逆轉(zhuǎn)（圖4E，圖4F）。這些結(jié)果表明，IL-1β誘導(dǎo)的細(xì)胞周期停滯可能與OA模型中的細(xì)胞老化有關(guān)，導(dǎo)致RNA和蛋白質(zhì)合成減緩，從而抑制細(xì)胞增殖。miR140-5p-CaP@mSF-HA-NB治療能夠逆轉(zhuǎn)C28/I2細(xì)胞的衰老，恢復(fù)其增殖能力。綜上所述，miR140-5p-CaP@mSF-HA-NB治療顯著改善了OA細(xì)胞模型中的細(xì)胞增殖、凋亡和細(xì)胞周期的變化，展示了其在骨關(guān)節(jié)炎治療中的潛力。

圖4. A) 用 EdU 染色法評估五組對 C28/I2 增殖的影響：新一代細(xì)胞通過EdU（綠色），DAPI 染色的細(xì)胞核為藍(lán)色，EdU（綠色）和 DAPI（藍(lán)色）的合并圖顯示重疊；B) 增殖細(xì)胞的統(tǒng)計結(jié)果的統(tǒng)計結(jié)果；C) 流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示五個實驗組 C28/I2 細(xì)胞的細(xì)胞凋亡情況；D)細(xì)胞凋亡的統(tǒng)計結(jié)果；E) 流式細(xì)胞術(shù)分析描述了五個實驗組中 C28/I2 細(xì)胞的細(xì)胞周期分布；F)流式細(xì)胞儀中細(xì)胞周期分布的統(tǒng)計結(jié)果

(5) MiR140-5p-CaP@mSF-HA-NB治療減輕OA細(xì)胞模型軟骨細(xì)胞炎癥

該研究采用ELISA檢測了IL-6、TNF-α和NO在不同實驗組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的濃度。結(jié)果表明，IL-1β組的IL-6、TNF-α和NO水平顯著高于空白組；而miR140-5p-CaP@mSF-HA-NB組則顯示出顯著降低的炎癥因子水平，尤其是IL-6、TNF-α和NO，與IL-1β組相比，差異顯著（圖5A）。這些結(jié)果表明，miR140-5p-CaP@mSF-HA-NB能夠有效減少IL-6、TNF-α和NO的濃度，從而緩解炎癥反應(yīng)。過量的活性氧（ROS）可以誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞凋亡，激活炎癥因子的產(chǎn)生，并加速關(guān)節(jié)軟骨的降解。為了量化不同實驗組中的ROS水平，研究通過流式細(xì)胞術(shù)對包括空白組、IL-1β組、IL-1β + CaP@mSF-HA-NB組、IL-1β + miR140-5p-CaP@mSF-HA-NB組以及IL-1β + NC-CaP@mSF-HA-NB組在內(nèi)的各組進(jìn)行了ROS水平檢測。結(jié)果顯示，IL-1β 組的ROS水平為7.64%，顯著高于空白組的1.27%。而miR140-5p-CaP@mSF-HA-NB治療組的ROS水平降至1.73%，接近空白組水平，表明該處理能夠顯著降低ROS水平，減輕氧化損傷，從而有效緩解炎癥反應(yīng)（圖5B和圖5C）。綜合來看，miR140-5p-CaP@mSF-HA-NB通過減少炎癥因子（如IL-6、TNF-α和NO）的水平以及降低ROS的積累，顯著改善了關(guān)節(jié)炎細(xì)胞模型中的炎癥反應(yīng)，并有望為治療骨關(guān)節(jié)炎提供新的治療思路。

圖5. A) 5個實驗組C28/I2細(xì)胞中IL - 6、NO和TNF - α的ELISA結(jié)果；B) 5個實驗組C28/I2細(xì)胞中ROS水平的流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果；C)流式細(xì)胞術(shù)中ROS水平的統(tǒng)計結(jié)果

(6) MiR140-5p-CaP@mSF-HA-NB用于兔脛骨關(guān)節(jié)軟骨缺損的體內(nèi)治療

CT圖像（圖6A1,A2,B1,B2,C1,C2）和宏觀照片（圖6A3,B3,C3）顯示，miR140-5p-CaP@mSF-HA-NB組在軟骨缺損的修復(fù)上表現(xiàn)出顯著的效果。Safranin O-Fast Green染色為關(guān)節(jié)軟骨和下軟骨骨結(jié)構(gòu)提供了可視化的表現(xiàn)。通過染色圖像可以看到（圖6A4,A5,B3,B4,C3,C4），隨著從左至右處理組的變化，代表軟骨的紅色區(qū)域逐漸增多，顯示miR140-5p-CaP@mSF-HA-NB顯著促進(jìn)了軟骨修復(fù)。

圖6. A1、A2)空白組家兔股骨髁軟骨缺損的顯微CT掃描，B1、B2) NC-CaP@mSF-HA-NB組家兔股骨髁軟骨缺損的顯微CT掃描，C1、C2) miR140-5p-CaP@mSFHA-NB組家兔股骨髁軟骨缺損的顯微CT掃描，A3)空白組家兔股骨髁缺損大體形態(tài)，B3) NC-CaP@mSF-HA-NB組家兔股骨髁缺損大體形態(tài)，C3) miR140-5p-CaP@mSF-HA-NB組兔股骨髁缺損大體形態(tài)。A4,A5)空白組家兔股骨髁軟骨缺損的Safranin O-Fast綠色染色，B3,B4) NC-CaP@mSF-HA-NB組家兔股骨髁軟骨缺損的Safranin O-Fast綠色染色，C3,C4) miR140-5p-CaP@mSF-HA-NB組家兔股骨髁軟骨缺損的Safranin O-Fast綠色染色。

研究小結(jié)：

研究團(tuán)隊設(shè)計了一種通過紫外線交聯(lián)形成的自愈水凝膠，并通過席夫堿反應(yīng)實現(xiàn)原位組裝。為了進(jìn)一步提升治療效果，研究人員將用于遞送miR140-5p的介孔有機(jī)硅-聚乙烯亞胺（MON-PEI）納米顆粒加入到水凝膠中。在該設(shè)計中，水凝膠成功構(gòu)建了一個強(qiáng)大的交聯(lián)3D聚合物網(wǎng)絡(luò)，創(chuàng)造出一個模擬天然組織細(xì)胞外基質(zhì)的環(huán)境，為細(xì)胞提供了良好的支持。更為重要的是，納米顆粒內(nèi)封裝的miR140-5p能夠在適當(dāng)?shù)臅r機(jī)被釋放，并通過精準(zhǔn)調(diào)控特定的生物途徑，促進(jìn)軟骨修復(fù)和再生。該自愈水凝膠不僅能夠高效裝載miRNA，還由于其獨(dú)特的自修復(fù)特性，能更好地填充和修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨缺損部位。隨著水凝膠逐步降解，納米顆粒中的miR140-5p被成功釋放并轉(zhuǎn)染至目標(biāo)細(xì)胞，促進(jìn)軟骨的修復(fù)和再生。此外，該水凝膠還加入了礦化絲素蛋白，顯著提升了其力學(xué)性能，使其在關(guān)節(jié)腔中的應(yīng)用更具優(yōu)勢。經(jīng)過多重驗證，這種自愈水凝膠不僅表現(xiàn)出極佳的生物兼容性和修復(fù)能力，還為基因治療提供了一種創(chuàng)新且高效的遞送平臺。