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細(xì)胞可以通過(guò)全細(xì)胞運(yùn)動(dòng)，如擴(kuò)散、遷移或體積膨脹，在三維空間上改變其局部生態(tài)位。這些行為持續(xù)數(shù)小時(shí)至數(shù)天，影響包括分化在內(nèi)的長(zhǎng)期細(xì)胞命運(yùn)。涉及細(xì)胞周圍生態(tài)位物理變形的細(xì)胞行為通常由涉及多個(gè)亞細(xì)胞水平信號(hào)變化的機(jī)械轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑介導(dǎo)，從ECM -細(xì)胞膜界面-細(xì)胞骨架和細(xì)胞核。盡管黏附配體和細(xì)胞骨架在細(xì)胞機(jī)械傳感中的作用已被廣泛研究，但細(xì)胞核的機(jī)械傳感作用尚未得到廣泛研究。先前的研究報(bào)道了快速的亞細(xì)胞動(dòng)力學(xué)，如細(xì)胞骨架的變化和局灶黏附，發(fā)生在秒的時(shí)間尺度。然而，對(duì)三維環(huán)境中全細(xì)胞運(yùn)動(dòng)的研究，如細(xì)胞擴(kuò)散、遷移和體積膨脹，都集中在更長(zhǎng)的時(shí)間尺度上，從幾小時(shí)到幾天不等。目前尚不清楚三維全細(xì)胞運(yùn)動(dòng)是否可以在更快的時(shí)間尺度上發(fā)生，以及這種快速的細(xì)胞運(yùn)動(dòng)如何影響細(xì)胞的長(zhǎng)期命運(yùn)，如分化。

針對(duì)上述問(wèn)題，美國(guó)斯坦福大學(xué)楊帆團(tuán)隊(duì)報(bào)告了在分鐘時(shí)間尺度上發(fā)生在滑動(dòng)水凝膠中的全細(xì)胞運(yùn)動(dòng)，稱為細(xì)胞翻轉(zhuǎn)，其特征是三維細(xì)胞動(dòng)力學(xué)和水凝膠變形，由秒到分鐘尺度的細(xì)胞骨架和核活動(dòng)引起。抑制或促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞翻滾的研究表明，這種行為增強(qiáng)了向軟骨細(xì)胞的分化。此外，它還與全局染色質(zhì)可及性的降低有關(guān)，而這是增強(qiáng)分化所必需的。細(xì)胞翻滾也發(fā)生在分化為其他譜系的過(guò)程中，其促進(jìn)分化的作用在不同的水凝膠平臺(tái)上得到了驗(yàn)證。研究結(jié)果表明，細(xì)胞翻滾是干細(xì)胞分化的一個(gè)額外調(diào)節(jié)因子，由快速生態(tài)位變形和核機(jī)械轉(zhuǎn)導(dǎo)介導(dǎo)。該文章于2024年9月30日以《Cell tumbling enhances stem cell differentiation in hydrogels via nuclear mechanotransduction》為題發(fā)表于《Nature Materials》上。（DOI：10.1038/s41563-024-02038-0）。

（1）MSC軟骨形成增強(qiáng)與細(xì)胞翻滾有關(guān)

為研究局部ECM如何調(diào)節(jié)MSC分化，研究團(tuán)隊(duì)使用PEG基SG和CG系統(tǒng)評(píng)估MSC軟骨形成。SG具有可滑動(dòng)的交聯(lián)結(jié)構(gòu)，使細(xì)胞可根據(jù)力重新組織水凝膠網(wǎng)絡(luò)（圖1a）。SG和CG的交聯(lián)均為不可逆的共價(jià)鍵，且在細(xì)胞時(shí)間尺度上表現(xiàn)彈性（圖1c右）。通過(guò)動(dòng)態(tài)光散射微觀流變學(xué)，團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)SG在局部比CG更柔軟約5倍，使細(xì)胞更易變形局部環(huán)境（圖1c左）。結(jié)果顯示，SG顯著增強(qiáng)了MSC軟骨形成，第21天軟骨基質(zhì)沉積增加（圖1b）?；罴?xì)胞成像顯示，SG中的MSC表現(xiàn)出動(dòng)態(tài)翻滾和局部快速變形，而CG中的MSC幾乎靜態(tài)（圖1d-h）。AFM測(cè)試表明，SG在變形時(shí)力響應(yīng)漸進(jìn)，允許更大變形，便于細(xì)胞重組局部基質(zhì)并促進(jìn)翻滾（圖1i-j）。

圖1. 增強(qiáng)的MSC軟骨形成與分鐘尺度的三維細(xì)胞翻滾有關(guān)。 a. 示意圖說(shuō)明 SG 與 CG，具有移動(dòng)或靜態(tài)交聯(lián)和配體。b. 代表性Safranin O染色顯示 MSCs 在 SG（頂部）和 CG（底部）中經(jīng)過(guò) 21 天的軟骨誘導(dǎo)后沉積 sGAG。c. 通過(guò)基于動(dòng)態(tài)光散射的微流變學(xué)（左；每種條件N ?= 3 種凝膠）和本體平行板剪切流變學(xué)（右）獲得的SG和 CG 的代表性儲(chǔ)存和損耗模量。d-h. 細(xì)胞翻滾的特征。d. SG（頂部）和 CG（底部）中單個(gè)活細(xì)胞的延時(shí)圖像序列。e . d中SG（頂部）和 CG（底部）中相應(yīng)細(xì)胞的標(biāo)記水凝膠的延時(shí)圖像序列。f. SG（頂部）和 CG（底部）中單個(gè)細(xì)胞隨時(shí)間變化的疊加顏色編碼輪廓。g. 時(shí)間上細(xì)胞形狀的相關(guān)系數(shù)，比較時(shí)間t > 0時(shí)的細(xì)胞形狀?與時(shí)間t=0 時(shí)的形狀?。h. 細(xì)胞長(zhǎng)軸的質(zhì)心速度（左）和角速度（右）。i. 從 SG、CG 和 SG50:CG50 上的 AFM 點(diǎn)壓痕獲得的力-應(yīng)變曲線（左）。從力-應(yīng)變曲線得出的 SG、CG 和 SG50:CG50 中具有相同大小的力的應(yīng)變（右）。 j. SG50:CG50 中的細(xì)胞翻滾（左）質(zhì)心速度和長(zhǎng)軸角速度（右）

（2）翻滾與增強(qiáng)的亞細(xì)胞動(dòng)力學(xué)有關(guān)

考慮到細(xì)胞翻滾與快速動(dòng)力學(xué)相關(guān)，研究團(tuán)隊(duì)進(jìn)一步探索亞細(xì)胞層級(jí)的動(dòng)力學(xué)，包括外基質(zhì)、細(xì)胞骨架和細(xì)胞核。通過(guò)跟蹤水凝膠中熒光珠的位移，研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)，與CG相比，SG中的細(xì)胞翻滾在15分鐘內(nèi)引發(fā)顯著增強(qiáng)的細(xì)胞周圍基質(zhì)變形，最大達(dá)1μm（圖2a）。由于翻滾與基質(zhì)變形有關(guān)，團(tuán)隊(duì)推測(cè)SG中的細(xì)胞骨架動(dòng)力學(xué)更強(qiáng)。利用Lifeact標(biāo)記的MSCs，觀察到SG中秒級(jí)的F-actin動(dòng)態(tài)增強(qiáng)，特別是在動(dòng)態(tài)突起處（圖2b-f）。進(jìn)一步計(jì)算F-actin的動(dòng)態(tài)面積變化，結(jié)果表明SG中的F-actin動(dòng)力學(xué)顯著更高（圖2d-f）。盡管傳統(tǒng)認(rèn)為細(xì)胞核主要存儲(chǔ)遺傳物質(zhì)，但證據(jù)表明其也感知機(jī)械力。研究團(tuán)隊(duì)通過(guò)活細(xì)胞核染色（5分鐘間隔）發(fā)現(xiàn)SG中的細(xì)胞核流動(dòng)性顯著增強(qiáng)，平均速度是CG的5倍，且在16小時(shí)內(nèi)移動(dòng)距離更大（圖2g-i）。在翻滾過(guò)程中，細(xì)胞和細(xì)胞核的運(yùn)動(dòng)速度和方向呈強(qiáng)正相關(guān)（圖2j，k）。

圖2.細(xì)胞翻滾與MSCs中增強(qiáng)的數(shù)秒到數(shù)分鐘尺度的細(xì)胞骨架和核動(dòng)力學(xué)有關(guān)。a. 左：通過(guò)跟蹤SG（上）和CG（下）的埋頭位移確定的15分鐘內(nèi)矩陣變形的代表性熱圖。b. 左：SG（上）和CG（下）細(xì)胞中F-actin的代表性圖像。c. 三個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)中觀察到的SG（上）和CG（下）30 s內(nèi)F-actin突出物的代表性變化。d. 連續(xù)兩個(gè)時(shí)間段間F-actin動(dòng)態(tài)面積（獲得面積+損失面積）的計(jì)算示意圖。e.  SG中一個(gè)單元和CG中一個(gè)單元?jiǎng)討B(tài)區(qū)域的幅度和波動(dòng)的代表性示例（間隔5秒，總周期為5分鐘）。f. F-actin動(dòng)力學(xué)定量作為平均動(dòng)態(tài)面積（間隔5-s，總周期為5 min）。g. SG（上）和CG（下）單個(gè)細(xì)胞核的延時(shí)圖像序列。h. SG和CG細(xì)胞核的代表性運(yùn)動(dòng)軌跡。i. 核移動(dòng)速度（5分鐘間隔，總周期16h）（左）和總移動(dòng)距離（超過(guò)16h）（右）的量化。j. 細(xì)胞和細(xì)胞核運(yùn)動(dòng)的代表性例子（左）的速度和（右）的角度的單個(gè)細(xì)胞在細(xì)胞翻滾隨著時(shí)間的推移。k. 細(xì)胞翻滾過(guò)程中細(xì)胞與細(xì)胞核速度和角度（方向）相關(guān)性的Spearman相關(guān)值

（3）翻滾驅(qū)動(dòng)MSC軟骨形成的機(jī)制

研究團(tuán)隊(duì)進(jìn)一步檢查了21天培養(yǎng)期間細(xì)胞翻滾的持續(xù)時(shí)間，在SG分化的第0天（包封后）、第2天和第4天進(jìn)行了分鐘級(jí)活細(xì)胞成像。到第4天，SG中的MSC翻滾顯著下降至CG水平（圖3a），伴隨亞細(xì)胞動(dòng)力學(xué)的減少，包括基質(zhì)變形（圖3b, c）、F-actin動(dòng)力學(xué)（圖3d）和核運(yùn)動(dòng)速度（圖3e）的降低。這表明MSC軟骨形成的前3-4天翻滾最為活躍，提示早期動(dòng)力學(xué)對(duì)軟骨形成至關(guān)重要。為驗(yàn)證SG增強(qiáng)軟骨形成是否需要關(guān)鍵的翻滾時(shí)間窗，研究團(tuán)隊(duì)在不同時(shí)間用blebbistatin處理SG中的MSC以抑制翻滾，結(jié)果顯示軟骨形成顯著下降至CG水平（圖3f, g）。第3天后抑制對(duì)軟骨形成影響較小，表明前3天是增強(qiáng)軟骨形成的關(guān)鍵時(shí)間窗口?？傮w而言，早期（<4天）驅(qū)動(dòng)翻滾的機(jī)制對(duì)于增強(qiáng)MSC軟骨形成至關(guān)重要。

圖3. 早期細(xì)胞翻滾是增強(qiáng)MSC軟骨形成的必要條件。a. 誘導(dǎo)成軟骨不同天數(shù)細(xì)胞長(zhǎng)軸質(zhì)心速度（左）和角速度（右）。b. 通過(guò)跟蹤在不同天的軟骨誘導(dǎo)的嵌入頭位移確定的15分鐘內(nèi)基質(zhì)變形的代表性熱圖。c. 量化不同軟骨誘導(dǎo)天數(shù)15 min內(nèi)最大基質(zhì)位移。d. 在誘導(dǎo)成軟骨的不同天數(shù)，活細(xì)胞F-actin動(dòng)力學(xué)的定量（間隔5-s，總時(shí)間為5分鐘）。e. 誘導(dǎo)成軟骨不同天數(shù)的核速度量化。f. Blebbistatin治療方案強(qiáng)調(diào)在21天軟骨誘導(dǎo)期的不同天的治療。g. 三個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)中觀察到，在不同時(shí)間的blebbistatin阻斷SG后，21天軟骨誘導(dǎo)后sGAG沉積的冷凍切片樣品上具有代表性的Safranin O組織學(xué)

（4）翻滾與受抑制的染色質(zhì)狀態(tài)有關(guān)

越來(lái)越多的證據(jù)表明，細(xì)胞核和染色質(zhì)對(duì)外力具有高度機(jī)械敏感性。鑒于細(xì)胞核在翻滾過(guò)程中更活躍，研究團(tuán)隊(duì)假設(shè)這種行為改變了核的機(jī)械感知和染色質(zhì)狀態(tài)，從而調(diào)節(jié)SG的軟骨形成。為驗(yàn)證此假設(shè)，該團(tuán)隊(duì)通過(guò)層粘連蛋白A/C和表觀遺傳標(biāo)記H3K9me3表征MSC的核機(jī)械負(fù)荷，發(fā)現(xiàn)SG中的MSCs在這兩種標(biāo)記物上表現(xiàn)出更高表達(dá)和更強(qiáng)的核層定位（圖4a-d），表明翻滾增加了核機(jī)械負(fù)荷。為全面了解翻滾對(duì)MSC染色質(zhì)可及性的影響，團(tuán)隊(duì)在SG和CG包封后16小時(shí)使用ATAC-seq進(jìn)行染色質(zhì)可及性測(cè)定。 前10,000個(gè)基因組區(qū)域的PCA分析顯示SG和CG來(lái)自不同集群，且SG的基因組區(qū)域整體可及性下降（圖4e-g），表明翻滾與異染色質(zhì)形成有關(guān)。接下來(lái)，該團(tuán)隊(duì)在前3天使用催產(chǎn)素、GSK343和garcinol分別抑制H3K9me3、H3K27me3和AcK，這些處理顯著減少了第21天的軟骨形成（圖4h），證實(shí)異染色質(zhì)的形成對(duì)于增強(qiáng)軟骨形成至關(guān)重要。此外，盡管翻滾未改變AcK的誘導(dǎo)，組蛋白乙酰化仍在軟骨形成中發(fā)揮重要作用，因?yàn)樗赡鼙３至俗V系特異性基因的可及性。

圖4. 細(xì)胞翻滾與被抑制的整體染色質(zhì)狀態(tài)有關(guān)，這是在三維上增強(qiáng)MSC軟骨形成所必需的。a, b. 24小時(shí)軟骨誘導(dǎo)后與核機(jī)械負(fù)荷和染色質(zhì)可及性相關(guān)標(biāo)記物的代表性western blotting圖像(a)和定量 (b)。c. 軟骨誘導(dǎo)24小時(shí)后SG（上）和CG（下）不同標(biāo)記物的代表性免疫熒光圖像。d. 基于不同標(biāo)記物的免疫熒光成像，量化信號(hào)強(qiáng)度沿核邊界距離的核定位。e-g. 誘導(dǎo)成軟骨16小時(shí)后的ATAC-seq分析。e. 方差最大的前10000個(gè)可達(dá)染色質(zhì)區(qū)域的主成分分析。f. 火山圖表示SG與CG差異分析后基因組區(qū)域的可達(dá)性模式。g. SG和CG之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的前50個(gè)基因組區(qū)域熱圖。h. 上圖：21天軟骨誘導(dǎo)期前3天不同染色質(zhì)抑制劑的治療方案。下圖：三個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)中觀察到的不同染色質(zhì)抑制劑誘導(dǎo)成軟骨21天后sGAG沉積的冷凍切片樣品上具有代表性的Safranin O組織學(xué)

（5）翻滾可以通過(guò)PLA2信號(hào)傳導(dǎo)調(diào)節(jié)MSC軟骨形成

鑒于細(xì)胞骨架-核耦合對(duì)細(xì)胞翻滾和增強(qiáng)軟骨形成至關(guān)重要，研究團(tuán)隊(duì)進(jìn)一步探索核機(jī)械傳感的作用。最近，核拉伸已被視為機(jī)械傳感器，可激活胞質(zhì)cPLA2信號(hào)傳導(dǎo)并產(chǎn)生花生四烯酸（ARA），從而增強(qiáng)細(xì)胞骨架動(dòng)力學(xué)（圖5a）。實(shí)時(shí)成像顯示SG的核在秒級(jí)時(shí)間尺度上變形增多（圖5b-d）。量化分析顯示，SG的核區(qū)波動(dòng)明顯高于CG（圖5c，d），表明細(xì)胞翻滾與核拉伸增加相關(guān)。隨后，該團(tuán)隊(duì)觀察到SG的核變形和cPLA2信號(hào)顯著增強(qiáng)，用blebbistatin抑制翻滾可降低cPLA2和p-cPLA2表達(dá)（圖5e）。接著，該團(tuán)隊(duì)評(píng)估了PLA2信號(hào)對(duì)翻滾的調(diào)節(jié)，用AACOCF3抑制PLA2減少了SG中的翻滾和核運(yùn)動(dòng)，而外源ARA補(bǔ)充則增強(qiáng)了這一過(guò)程（圖5f，g）。盡管ARA在CG中影響較小，但適度提高了核速度。最終，該團(tuán)隊(duì)在SG和CG的分化前3天用AACOCF3或ARA處理，結(jié)果顯示PLA2抑制減少了第14天的軟骨形成，而ARA促進(jìn)了SG中的軟骨基質(zhì)沉積（圖5h）。 上，翻滾與PLA2信號(hào)增強(qiáng)密切相關(guān)，可用于促進(jìn)三維分化。

圖5.細(xì)胞翻滾與增強(qiáng)的核拉伸和PLA2信號(hào)有關(guān)，這可以調(diào)節(jié)以增強(qiáng)MSC軟骨形成。a. PLA2-ARA核機(jī)械感應(yīng)途徑示意圖，細(xì)胞核通過(guò)該途徑感應(yīng)和轉(zhuǎn)導(dǎo)約束并激活肌動(dòng)球蛋白收縮性。b. 用H2B-eGFP標(biāo)記的部分細(xì)胞核的秒尺度延時(shí)圖像序列，突出了SG（上）和CG（下）的核變形。c. 一個(gè)SG和一個(gè)CG的核面積波動(dòng)超過(guò)60秒（3-s間隔）的代表性例子。d. SG和CG超過(guò)60 s的平均核面積波動(dòng)。e. 誘導(dǎo)成軟骨24小時(shí)后PLA2信號(hào)相關(guān)標(biāo)志物的代表性western blotting圖像（左）和定量圖像（右）。f. 細(xì)胞長(zhǎng)軸質(zhì)心速度（左）和角速度（右）對(duì)SG和CG中PLA2抑制和ARA補(bǔ)充的響應(yīng)。g.  SG和CG中PLA2抑制和ARA補(bǔ)充對(duì)核速度的響應(yīng)。h. 通過(guò)三個(gè)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)觀察到，通過(guò)抑制PLA2和在SG中補(bǔ)充ARA誘導(dǎo)成軟骨14天后，sGAG沉積的冷凍切片樣品上具有代表性的Safranin O組織學(xué)

（6）細(xì)胞翻滾發(fā)生在三維的各種場(chǎng)景中

  在確認(rèn)翻滾影響MSC軟骨形成后，研究團(tuán)隊(duì)進(jìn)一步探索其在MSC成骨和脂肪形成中的作用。組織學(xué)分析（圖6a,c）顯示，與CG相比，SG增強(qiáng)了MSC成骨和脂肪生成。包被后1小時(shí)起，該團(tuán)隊(duì)觀察到SG中的細(xì)胞在成骨和脂肪形成過(guò)程中持續(xù)翻滾，而CG中的細(xì)胞翻滾最?。▓D6b, d）。這些結(jié)果表明，細(xì)胞翻滾與增強(qiáng)的多譜系分化相關(guān)。隨后，該團(tuán)隊(duì)測(cè)試了翻滾在其他3D可降解和粘彈性水凝膠平臺(tái)上的表現(xiàn)，發(fā)現(xiàn)酶降解和粘彈性水凝膠同樣支持細(xì)胞翻滾，并顯著增強(qiáng)了MSC軟骨形成（圖6e-h）。這些結(jié)果表明，細(xì)胞翻滾是一種在三維環(huán)境中適用于多種細(xì)胞類型的物理行為，具有廣泛的細(xì)胞生物學(xué)和組織應(yīng)用潛力。

圖6.細(xì)胞翻滾與向其他譜系的三維分化增強(qiáng)有關(guān)，發(fā)生在各種水凝膠平臺(tái)上。a. SG（上）和CG（下）成骨誘導(dǎo)28天后，具有代表性的茜素紅S冷凍切片樣品的礦物沉積組織學(xué)。b.成骨誘導(dǎo)第0天細(xì)胞長(zhǎng)軸質(zhì)心速度（左）和角速度（右）。c. SG（上）和CG（下）誘導(dǎo)成脂28天后，固定全凝膠樣品的代表性油紅O染色，脂肪滴形成。d. 第0天細(xì)胞長(zhǎng)軸質(zhì)心速度（左）和角速度（右）。e. 在可降解CG（上）和CG（下）中誘導(dǎo)成軟骨14天后，sGAG沉積的冷凍切片樣品上具有代表性的紅花素O組織學(xué)。f. 誘導(dǎo)成軟骨第0天細(xì)胞長(zhǎng)軸質(zhì)心速度（左）和角速度（右）。g. 粘彈性CG（上）和CG（下）誘導(dǎo)成軟骨14天后sGAG沉積的冷凍切片樣品中具有代表性的紅花素O組織學(xué)。h. 誘導(dǎo)成軟骨第0天細(xì)胞長(zhǎng)軸質(zhì)心速度（左）和角速度（右）。i. 分鐘尺度細(xì)胞翻滾的示意圖，以及相關(guān)的時(shí)間尺度和分子機(jī)制

研究小結(jié)：

該研究團(tuán)隊(duì)報(bào)告了一種以前未知的細(xì)胞行為，稱為細(xì)胞翻滾，涉及局部包含的分鐘尺度的全細(xì)胞運(yùn)動(dòng)，這種運(yùn)動(dòng)使細(xì)胞周圍ECM物理變形，并調(diào)節(jié)長(zhǎng)期分化結(jié)果。該研究團(tuán)隊(duì)的研究強(qiáng)調(diào)了一個(gè)事實(shí)，即翻滾增強(qiáng)的分化涉及多個(gè)時(shí)間尺度：(1)發(fā)生在秒到分鐘尺度上的快速細(xì)胞翻滾、細(xì)胞骨架和核動(dòng)力學(xué)；(2)在誘導(dǎo)的最初幾天中，這些關(guān)鍵相互作用的時(shí)間和持續(xù)時(shí)間，隨后調(diào)節(jié)干細(xì)胞的長(zhǎng)期分化。因此，對(duì)數(shù)秒到數(shù)分鐘尺度的細(xì)胞- ECM相互作用的早期控制可以關(guān)鍵地調(diào)節(jié)細(xì)胞的長(zhǎng)期命運(yùn)。雖然該研究團(tuán)隊(duì)的研究主要集中在MSCs和軟骨形成上，但翻轉(zhuǎn)增強(qiáng)分化的生物學(xué)原理和時(shí)間尺度可能廣泛適用于在各種組織再生或疾病進(jìn)展背景下增強(qiáng)干細(xì)胞分化和調(diào)節(jié)其他細(xì)胞命運(yùn)。