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創(chuàng)傷性腦損傷（Traumatic Brain Injury, TBI），這是一種由外力引起的大腦功能障礙，它是一個全球性的健康挑戰(zhàn)。每年大約有5000萬人因TBI導(dǎo)致殘疾，全球負(fù)擔(dān)高達(dá)4000億美元。當(dāng)前，全球的動蕩和沖突導(dǎo)致更多的軍人TBI患者，以及長期精神功能障礙的患病率增加。越來越多的證據(jù)表明，TBI從急性期過渡到慢性期時的復(fù)雜病理變化（如炎癥、水腫等）會逐漸導(dǎo)致長期的神經(jīng)功能障礙，甚至增加死亡率。因此，早期干預(yù)對于改善TBI的進(jìn)展和幸存者的預(yù)后至關(guān)重要。然而，目前TBI的治療受限于治療選擇有限、口服和靜脈給藥的循環(huán)時間延長，以及血腦屏障（BBB）的阻礙。這些因素往往嚴(yán)重?fù)p害患者的康復(fù)。因此，迫切需要先進(jìn)的局部給藥技術(shù)和材料來克服這些限制，并進(jìn)一步促進(jìn)對創(chuàng)傷后大腦區(qū)域急性期的及時干預(yù)。

近期，中南大學(xué)湘雅醫(yī)院的王楊教授領(lǐng)導(dǎo)的研究小組驗(yàn)證了一種新型水凝膠（命名為甘草酸G-黃連素B-大黃素R復(fù)合凝膠，簡稱GBR凝膠）的概念。這種水凝膠是由黃連素（B）和大黃素（R）構(gòu)成的納米粒子溶液，并內(nèi)嵌甘草酸（G）。研究表明，GBR凝膠能夠促進(jìn)谷氨酸能神經(jīng)傳遞途徑的強(qiáng)化，保持神經(jīng)元功能的正常運(yùn)行，支持少突膠質(zhì)細(xì)胞前體（OPCs）的分化與成熟，最終減輕大腦內(nèi)的炎癥反應(yīng)。這一發(fā)現(xiàn)為在創(chuàng)傷性腦損傷（TBI）的急性階段進(jìn)行局部藥物治療提供了一種潛在的有效策略。這項(xiàng)研究的成果于2024年10月9日以《中藥小分子藥物載藥水凝膠在創(chuàng)傷性腦損傷治療中的增強(qiáng)作用》為題，在《ACS Nano》雜志上發(fā)表（DOI：doi.org/10.1021/acsnano.4c09097）

圖1 全小分子自組裝小分子水凝膠局部給藥增強(qiáng)治療 TBI 的示意圖

研究結(jié)果：

（1） GBR-凝膠的制備、優(yōu)化、篩選與特性表征

在中醫(yī)中，甘草、黃連和大黃常被組合使用來治療TBI。大黃和黃連的主要活性成分分別是大黃酸（Berberine）和小檗堿（Rhein）（圖2A）。大黃酸和小檗堿被制成黃色 BR 顆粒溶液，二者并不能形成水凝膠，隨后通過調(diào)節(jié)甘草酸（glycyrrhizic）的含量產(chǎn)生不同濃度的 GBR 凝膠（圖2B）。在室溫下儲存 90 天后，未觀察到 GBR 凝膠的物理外觀發(fā)生變化（圖 2C）。GBR 凝膠形成多孔網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，BR 顆粒負(fù)載在表面（圖2D）。此外，GBR 凝膠具有出色的注射性（圖2E、F），這是局部給藥的重要先決條件。這有助于適應(yīng)各種不規(guī)則的損傷區(qū)域。然后，作者評估了 GBR 凝膠的流變特性。應(yīng)變掃描表明，當(dāng)應(yīng)變超過 11% 時，G’’超過 G’，表明 GBR 凝膠從凝膠轉(zhuǎn)變?yōu)槿芤籂顟B(tài)（圖 2G）。自愈性測試顯示（圖2H），GBR 凝膠出色自修復(fù)特性。圖2I顯示大腦彈性模量相匹配的值。

圖2 GBR-gel的特性。(A) 大黃、黃連和甘草的中藥圖像，以及大黃素、小檗堿和甘草酸的化學(xué)結(jié)構(gòu)。(B) BR顆粒溶液（i）、G-gel（ii）和GBR-gel（iii）的代表性圖像。(C) 在室溫下不同時間的同一GBR-gel的圖像。(D) GBR-gel的代表性掃描電子顯微鏡（SEM）圖像（左、中）和示意圖（右）。(E) 將GBR-gel用注射器注入超純水中，呈現(xiàn)出條帶狀配置。(F) 代表性圖像展示了通過注射GBR-gel形成各種幾何形狀。(G) GBR-gel的應(yīng)變依賴性振蕩剪切流變性質(zhì)。(H) GBR-gel自愈性測試。(I)大腦彈性模量相匹配的值

（2） GBR-Gel 的自組裝機(jī)制

闡明分子間相互作用對于理解 GBR 凝膠的自組裝過程至關(guān)重要。利用圓二色譜 （CD） 光譜比較 GBR 凝膠和 G 凝膠，顯示 GBR 凝膠的峰有輕微的紅移，但具有相似的峰形（圖 3A）。使用質(zhì)譜法對 GBR-凝膠的組裝結(jié)構(gòu)進(jìn)行進(jìn)一步分析，均檢測出大黃酸和小檗堿的單體形式，在 BR 溶液中，檢測出大黃酸-小檗堿組合。GBR 凝膠的質(zhì)譜鑒定出大黃酸-小檗堿復(fù)合物以及甘草酸單體的存在（圖3B-D）。這一過程為理解GBR-凝膠的自組裝機(jī)制提供了重要依據(jù)。

圖3 (A) BR顆粒溶液、G-gel和GBR-gel的圓二色光譜（CD）。(B) GBR-gel的高分辨率質(zhì)譜。(C) BR溶液的高分辨率質(zhì)譜。(D) G-gel的高分辨率質(zhì)譜。(E) 不同濃度下GBR-gel的紫外-可見光譜（UV-vis）。(F) GBR干凝膠的XRD圖譜。(G) BR顆粒溶液、G-gel和GBR-gel的傅里葉變換紅外光譜。(H) GBR-gel自組裝過程的圖解

（3）GBR-凝膠相比G-凝膠在TBI后表現(xiàn)出更優(yōu)的抗炎性能

通過局部給藥評估了 GBR 凝膠和 G-凝膠在 CCI 誘導(dǎo)的 TBI 模型中的治療效果（圖 4A、B）。與 CCI 組相比，GBR 凝膠給藥后第 3 天和第 7 天的神經(jīng)功能缺損改善得更好（圖 4C）。GBR-gel 和 G-gel 給藥均顯著降低了第 1 天的足誤率（圖 4D）。組織病理學(xué)染色顯示，GBR凝膠能減輕CCI導(dǎo)致的神經(jīng)元壞死和核溶解（圖4E）。Nissl染色顯示，GBR凝膠顯著增加存活神經(jīng)元數(shù)量，并顯著減少凋亡神經(jīng)元數(shù)量，而G凝膠效果不顯著（圖3F-I）?？偟膩碚f，GBR凝膠在TBI治療中展現(xiàn)出更顯著的治療效果。

圖4 局部GBR-gel給藥治療TBI的整體效果優(yōu)于G-gel。(A) 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的示意圖。實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了7天。行為實(shí)驗(yàn)包括mNSS（改良的神經(jīng)學(xué)嚴(yán)重程度評分）和足誤測試。(B) 由CCI（控制性皮質(zhì)撞擊）誘導(dǎo)的TBI模型和局部水凝膠給藥的代表性圖像。(C) 在給藥后不同時間點(diǎn)的mNSS。第0天代表在模型誘導(dǎo)的同一天進(jìn)行的評估。每組6只小鼠。(D) 在Sham、CCI、G-gel和GBR-gel組中，在不同時間點(diǎn)進(jìn)行的足誤測試。每組6只小鼠。(E) 在第7天，每組的腦組織中H&E染色的全切片圖像（上）和放大的腦周損傷皮層圖像（下）。右半球的藍(lán)色區(qū)域表示損傷腔區(qū)域。黑色虛線右側(cè)代表損傷腔區(qū)域。插圖是對局部區(qū)域放大的視圖。(F) 第7天腦周損傷皮層Nissl染色的代表性圖像。黑色虛線右側(cè)代表損傷腔區(qū)域。插圖是對局部區(qū)域放大的視圖。(G) 對每組腦周損傷皮層中存活神經(jīng)元進(jìn)行計(jì)數(shù)。每組5只小鼠。在40倍放大下，對每樣本的腦周損傷皮層中的五個視覺場進(jìn)行計(jì)數(shù)，平均值用于表示該樣本中存活神經(jīng)元的數(shù)量。(H) 第7天腦周損傷皮層的Tunel染色的代表性圖像（上）。白色虛線右側(cè)表示損傷腔區(qū)域。下圖顯示了放大的視圖。(I) 在第7天，通過Tunel染色對每組腦周損傷皮層中的凋亡陽性細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)

（4） GBR-Gel 比 G-Gel 改善了 TBI 后的抗炎特性

炎癥在加劇 TBI 后神經(jīng)損傷和其他繼發(fā)性損傷方面起著關(guān)鍵作用。作者檢測了星形膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物及炎癥因子表達(dá)。結(jié)果顯示，第7天GBR 凝膠組損傷皮層中過度活化的星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞顯著減少（圖5A-D），IL-6、IL-1β和TNF-α水平也顯著降低（圖5G-J）。使用ELISA測試也獲得了類似的結(jié)果（圖 5K-N）。綜上所述，這些結(jié)果都證實(shí)了GBR 凝膠的卓越抗炎作用。

圖5 在TBI后，局部使用GBR-gel治療增強(qiáng)了抗炎特性，而G-gel則沒有這種效果。 (A) 在第7天，對Sham組、CCI組、G-gel組和GBR-gel組的腦損傷周圍皮質(zhì)進(jìn)行了免疫熒光染色分析，使用Iba-1（紅色）、GFAP（綠色）和DAPI（藍(lán)色）進(jìn)行標(biāo)記。白色虛線右側(cè)表示損傷腔區(qū)域。 (B) 計(jì)算了每組腦損傷周圍皮質(zhì)中Iba-1⁺細(xì)胞的數(shù)量（n=7）。 (C) 計(jì)算了每組腦損傷周圍皮質(zhì)中GFAP⁺細(xì)胞的數(shù)量（n=7）。(D) 用示意圖表示GBR-gel治療后減弱的炎癥微環(huán)境。在第7天，對每組的損傷皮質(zhì)周圍進(jìn)行了IL-6（E）、IL-1β（G）和TNF-α（I）的免疫熒光染色。白色虛線右側(cè)表示損傷腔區(qū)域（n=5或6）。(K) 在第7天，使用酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）分析了腦損傷周圍皮質(zhì)中的炎癥細(xì)胞因子。在假手術(shù)組、CCI組和GBR-gel組中，第7天圍繞損傷皮質(zhì)的IL-6（L）、TNF-α（M）和IL-1β（N）的濃度（n=5）

炎癥是導(dǎo)致 TBI 后繼發(fā)性腦水腫加重的關(guān)鍵決定因素。作者還進(jìn)行了一系列實(shí)驗(yàn)，以評估 GBR 凝膠減輕炎癥相關(guān)腦水腫的能力（圖 6A）。與 CCI 組相比，GBR 凝膠處理在第 7 天有效增加了腦濕干重比（圖 6B，C）。所有小鼠在第 3 天和第 7 天接受了MRI腦部掃描，GBR凝膠能降低CCI誘導(dǎo)的小鼠在T2加權(quán)圖像中的高信號范圍（圖6D）。T2映射提供了更直觀的可視化效果（圖6E，F(xiàn)）。同時，GBR凝膠能降低AQP-4與GFAP的共定位程度，進(jìn)一步減輕腦損傷后的水腫（圖6G, H）。簡而言之，GBR-gel 表現(xiàn)出出色的抗炎活性，有效緩解 TBI 后的繼發(fā)性腦水腫（圖 6H）。

圖6 GBR-gel減輕了TBI后炎癥相關(guān)的腦水腫。(A) 體內(nèi)腦水腫測試的示意圖。(B) 不同組別在第7天的全腦代表性圖片。(C) 在局部應(yīng)用GBR-gel后第7天，評估了腦水含量（n=5）。(D) 在Sham、CCI組和GBR-gel組中，分別在第3天和第7天進(jìn)行了T2加權(quán)成像（T2WI）。受傷區(qū)域用虛線圓圈標(biāo)示。(E) 在Sham、CCI和GBR-gel組中，分別在第3天和第7天進(jìn)行了T2圖測。受傷區(qū)域用虛線圓圈標(biāo)示。(F) 計(jì)算了平均T2圖測值（n=3）。 (G) 在第7天，評估了每組傷周皮層中AQP-4和GFAP的共定位。白色虛線右上方表示受傷腔體。最右側(cè)的圖像是局部放大圖。(H) 通過GBR-gel對TBI后炎癥相關(guān)腦水腫的示意圖

（5）GBR-凝膠減輕了少突膠質(zhì)前體細(xì)胞（OPC）分化的抑制作用

為了研究 TBI 后 GBR 凝膠影響的關(guān)鍵機(jī)制，在第 7 天對 Sham、CCI 和 GBR 凝膠組小鼠的挫傷周圍皮層進(jìn)行了單細(xì)胞 RNA 測序 （圖7 A）。為了捕獲 GBR 凝膠干預(yù)后變化最大的細(xì)胞類型，作者計(jì)算了每種細(xì)胞類型的相對變化率（圖 7B）。與 Sham 組相比，CCI 明顯增加了 OPCs 的比例，而GBR-gel 逆轉(zhuǎn)了這種異常變化。偽時間軌跡分析（圖 7C）。GBR凝膠能緩解TBI后未分化前體細(xì)胞的異常狀態(tài)，促進(jìn)OPC分化為OLG（少突膠質(zhì)細(xì)胞）。對成熟 OLG 標(biāo)志物 CC1 和 OLG 標(biāo)志物 Olig2 進(jìn)行免疫熒光共染色，進(jìn)一步驗(yàn)證了GBR凝膠在體內(nèi)促進(jìn)OPC分化、髓鞘形成和軸突再生的能力（圖7D- F） 。LFB染色來觀察損傷周圍皮層的陽性染色區(qū)域，發(fā)現(xiàn)TBI后這一區(qū)域比Sham組小鼠減少，但在GBR-gel治療后有所增加（圖7G，H）。在檢測髓鞘蛋白脂質(zhì)蛋白的分析中也得到了類似的結(jié)果（圖7I，K）。通過評估NF-H神經(jīng)絲蛋白的表達(dá)來進(jìn)一步檢查軸突再生。TBI后損傷周圍皮層NF-H的顯著降低表明軸突損傷（圖7J，L）。然而，GBR-gel上調(diào)了NF-H的表達(dá)，對軸突再生發(fā)揮了保護(hù)作用。簡而言之，GBR-gel給藥后OPC的分化和成熟有助于TBI后的髓鞘形成和軸突再生（圖7M）。

圖7 GBR-gel減少異常升高的OPCs數(shù)量以及促進(jìn)OPCs分化。(A) 使用t分布隨機(jī)鄰域嵌入（t-SNE）技術(shù)對11種細(xì)胞類別進(jìn)行可視化。不同顏色的球體代表不同的細(xì)胞類別，每個點(diǎn)代表一個單獨(dú)的細(xì)胞（n = 15個皮層，5個假手術(shù)組，5個CCI組，和5個GBR-gel組）。(B) 每種細(xì)胞類型的相對變化率。(C) OPCs和少突膠質(zhì)細(xì)胞（OLG）的偽時間軌跡圖。細(xì)胞根據(jù)它們的Seurat聚類進(jìn)行標(biāo)記。(D) 在第7天，每個組的圍損傷皮層中CC1和Olig2的共定位。白色虛線右側(cè)表示損傷區(qū)域。最右側(cè)的圖像是局部放大圖。箭頭指向CC1⁺/Olig2⁺細(xì)胞。圍損傷皮層中CC1⁺/Olig2⁺細(xì)胞（E）和CC1^-/Olig2⁺細(xì)胞（F）的百分比被量化。每組7只小鼠。(G) 在第7天，圍損傷皮層的LFB（藍(lán)色）染色的代表性圖像。箭頭指向代表性的LFB陽性位置。(H) 使用ImageJ量化LFB陽性區(qū)域（n=6）。 (I) 使用ImageJ量化PLP的IntDen（積分密度）。每組6只小鼠。在20倍放大下分析了圍損傷皮層的兩個視野，平均值作為該樣本的IntDen。(J) 使用ImageJ量化NF-H的IntDen（n=6） (K) 在第7天，圍損傷皮層的PLP免疫熒光染色。(L) 在第7天，圍損傷皮層的NF-H免疫熒光染色。(M) GBR-gel干預(yù)后促進(jìn)OPCs分化的示意圖

(6) GBR-凝膠通過Gria2和Grin2b增強(qiáng)谷氨酸能突觸通路以促進(jìn)三方突觸

研究揭示了GBR凝膠在維持神經(jīng)元正常功能和促進(jìn)OPC分化方面的顯著效果。通過單細(xì)胞RNA測序分析，發(fā)現(xiàn)使用GBR凝膠治療后，谷氨酸能神經(jīng)元的數(shù)量有所上升（見圖7B）。與對照組相比，GBR凝膠治療組在谷氨酸能神經(jīng)元和OPC中發(fā)現(xiàn)了多個基因表達(dá)的差異。深入分析表明，GBR凝膠主要通過提高特定基因及其相關(guān)通路的表達(dá)來發(fā)揮其作用，其中谷氨酸突觸通路的表現(xiàn)尤為顯著（圖8A-C）。這些發(fā)現(xiàn)暗示GBR凝膠可能通過增強(qiáng)谷氨酸突觸通路來促進(jìn)OPC的分化和成熟（圖8D,E）。

在GBR凝膠的作用下，OPC通過Slc1a2轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白吸收谷氨酸，以維持其分化能力，并減輕創(chuàng)傷性腦損傷（TBI）后的谷氨酸毒性。同時，谷氨酸在谷氨酰胺合成酶和谷氨酰胺酶的催化下轉(zhuǎn)化為谷氨酰胺，并被送回谷氨酸能神經(jīng)元，以補(bǔ)充其正常生理活動所需的谷氨酸。此外，GBR凝膠還增強(qiáng)了谷氨酸能神經(jīng)元中Gria2和Grin2b的表達(dá)（圖8F），這兩種受體對于維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)的信號傳遞至關(guān)重要。同時，GBR凝膠也提高了關(guān)鍵的VGLUTs（例如Slc17a7）的表達(dá)，這對于谷氨酸能神經(jīng)傳遞至關(guān)重要。相應(yīng)地，在TBI模型小鼠中，Gria2⁺/Slc17a7⁺和Grin2b⁺/Slc17a7⁺細(xì)胞的數(shù)量顯著下降，而在GBR凝膠治療的小鼠中則有所增加（圖8I,J）。

總體而言，GBR凝膠通過激活谷氨酸能突觸通路，保持了神經(jīng)元的正?；顒?，增強(qiáng)了OPC的分化，并建立了谷氨酸能神經(jīng)元、OPC以及下一個谷氨酸能神經(jīng)元之間的三方調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，從而進(jìn)一步抑制了炎癥反應(yīng)（圖8K）。

圖8 GBR-gel給藥增強(qiáng)了谷氨酸能突觸途徑。(A) 在GNs（感覺神經(jīng)元）到OPCs的DEGs（差異表達(dá)基因）之間的重疊。確定了四類DEGs。(a) 在GNs和OPCs中均下調(diào)的差異基因。(b) 在GNs中下調(diào)但在OPCs中上調(diào)的差異基因。(c) 在OPCs中下調(diào)但在GNs中上調(diào)的差異基因。(d) 在GNs和OPCs中均上調(diào)的差異基因。(B) 使用STRING數(shù)據(jù)庫對GNs和OPCs中上調(diào)的DEGs進(jìn)行了KEGG通路分析。(C) 使用STRING數(shù)據(jù)庫對GNs和OPCs中上調(diào)的DEGs進(jìn)行了GO分析。結(jié)果根據(jù)假發(fā)現(xiàn)率（FDR）進(jìn)行排序，突出顯示了前10個生物過程（BP）、細(xì)胞組分（CC）和分子功能（MF）。(D) 維恩圖顯示了CCI特異性下調(diào)DEGs與基于scRNA-seq數(shù)據(jù)的GNs中谷氨酸能突觸途徑中的DEGs之間的共同DEGs。不同組別中GNs中Gria2和Grin2b的差異表達(dá)。(E) 維恩圖顯示了CCI特異性下調(diào)DEGs與基于scRNA-seq數(shù)據(jù)的OPCs中谷氨酸能突觸途徑中的DEGs之間的共同DEGs。不同組別中OPCs中Slc1a2的差異表達(dá)。(F) 小提琴圖顯示了來自scRNA-seq數(shù)據(jù)的Gria2、Grin2b和Slc17a7的定量。(G, H) 在第7天，對周圍梗死皮層的Slc17a7和Gria2或Slc17a7和Grin2b進(jìn)行了免疫熒光染色。白色虛線右側(cè)表示受損區(qū)域。(I, J) 量化了Slc17a7⁺/Gria2⁺細(xì)胞或Slc17a7⁺/Grin2b⁺細(xì)胞的數(shù)量。每組5只小鼠。每個樣本在40倍放大下觀察了五個視野。平均值被視為該樣本的Slc17a7+/Gria2+細(xì)胞或Slc17a7⁺/Grin2b⁺細(xì)胞。(K) 示意圖展示了GBR-gel通過谷氨酸能突觸途徑促進(jìn)OPCs和神經(jīng)元恢復(fù)正常功能

研究小結(jié)：

該研究提出了一種由三種小分子藥物自組裝形成的小分子水凝膠（GBR-gel），實(shí)現(xiàn)了對TBI的潛在治療增強(qiáng)。在神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域，這種水凝膠展現(xiàn)出了調(diào)節(jié)GN-OPC-GN三元突觸單元的能力，從而恢復(fù)了TBI后下調(diào)的谷氨酸能突觸通路。這種調(diào)節(jié)效應(yīng)促進(jìn)了OPCs的分化和成熟，有助于髓鞘形成和軸突再生，并發(fā)揮了免疫炎癥調(diào)節(jié)和神經(jīng)保護(hù)功能。最終，GBR-gel作為一種局部應(yīng)用系統(tǒng)，對TBI的治療具有潛在的影響，可能會改變管理TBI的藥物選擇。