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關節(jié)軟骨缺乏血管、淋巴管、神經和干細胞，因此在受損后無法進行自我修復。傳統(tǒng)治療方法可以在一定程度上恢復關節(jié)軟骨功能，但其治療效果往往不盡如人意。軟骨組織工程為解決關節(jié)軟骨缺陷提供了一有前景的解決方案。然而，該領域仍面臨諸多挑戰(zhàn)，包括需要結構仿生、快速個性化定制和原位誘導軟骨組織再生，這些問題阻礙了其向臨床實踐的轉化應用。關節(jié)軟骨由透明軟骨、鈣化軟骨和軟骨下骨三層組成，每一層都具有獨特的細胞外基質組成、結構組織和細胞密度。這種復雜的解剖結構導致了物理、機械和生物特性的梯度，這些梯度對骨軟骨（OC）缺陷的修復有著重要影響。因此，創(chuàng)造有利于軟骨和骨組織再生的微環(huán)境對于推進軟骨組織工程策略和在骨軟骨缺損治療中取得積極成果至關重要。

針對上述問題和挑戰(zhàn)，蘭州大學范增杰教授課題組通過3D打印技術開發(fā)了一種可快速定制、具有干細胞捕獲和歸巢能力的仿生軟骨支架，該支架由三種預先設計的生物墨水模塊單元組成，每個模塊單元發(fā)揮具有不同的功能。如圖1所示，所制備的打印支架不僅準確再現了關節(jié)軟骨組織的三層結構和材料梯度，還具有良好的獲抗壓強度(6.3 MPa)。對于該仿生支架的底層墨水模塊單元，使用適體HM69通過SA的羧基與HM69的胺基之間的酰胺化反應對SA進行修飾；此外，還引入了70%KH570改性的HANFs。在中間層模塊化單元中，沒有對水凝膠基底進行改性，而是引入了40%的KH570改性HANFs。至于頂層，將裝有 SDF-1α 的 PLGA 納米顆粒封裝入水凝膠基底，沒有添加任何 KH570 改性的 HANFs。該支架在其底層和頂層集成了干細胞捕獲層和歸巢層。這種設計能夠通過適體相互作用在體內特異性捕獲骨髓間充質干細胞(BMSCs)，然后通過SDF-1α濃度梯度的趨化性將其動員到透明軟骨層上。在支架的微環(huán)境中，這些骨髓間充質干細胞在每一層分化為不同的細胞，有效地促進了關節(jié)軟骨缺損的修復。

圖1 仿生軟骨支架生物墨水模塊單元組成和制造工藝示意圖

（1）仿生軟骨支架的物理化學、形態(tài)和機械特性

圖2 物理化學、形態(tài)和機械性能表征

圖2A-D中的結果表明制備仿生軟骨支架所用材料的成功合成。對于打印出來的支架(圖2E)，其SEM呈現出明顯的三層結構，如在上層，可以清晰地觀察到PLGA納米球尺寸分布均勻。而在中下層，也可以清晰地觀察到同質的HANFs。由于HANFs的增強作用以及其與PAM水凝膠的化學交聯(lián)作用，打印的支架具有較高的形狀保持能力和優(yōu)異的力學性能。即使在折疊和卷曲狀態(tài)下，它們仍然可以保持結構的完整性(圖2F)。應力應變試驗進一步驗證了其優(yōu)異的力學性能(圖2G,H)。研究者認為HANFs在改善機械支柱方面發(fā)揮了非常關鍵的作用。

（2）仿生軟骨支架對BMSCs的招募能力

干細胞捕獲是原位誘導再生的第一步。在體外實驗組研究人員將BMSCs種在Transwell孔板的上室，而具有招募能力的打印支架則放置在Transwell孔板的下室。結果表明，經SDF-1α包封的HM69和PLGA納米球功能化后的打印支架（如GS69組）在培養(yǎng)24 h后表現出比其他支架更高的招募能力（圖3A）。此外，研究者評估了打印支架在體內BMSCs的募集情況。用免疫熒光染色特異性骨髓間充質干細胞標志物CD44來量化骨髓間充質干細胞的歸巢能力。結果表明，在HM69和SDF-1α功能化的打印支架上培養(yǎng)的骨髓間充質干細胞CD44和F-actin的陽性表達量較高，尤其是GS69和HS69組。這證實了HM69和SDF-1的功能化修飾是誘導骨髓間充質干細胞在體內歸巢和遷移的有效方法(圖3B)。

圖3 體內BMSCs的招募能力和體外BMSCs的招募能力

（3）仿生軟骨支架的生物相容性

圖4 打印支架上培養(yǎng)的骨髓間充質干細胞活/死染色、Phalloidin/Hoechst染色、EdU染色

良好的細胞相容性是保證合成材料在體內安全使用的必要條件。骨髓間充質干細胞在不同支架上培養(yǎng)1、3、5、7天，與對照組相比差異不顯著，說明所有支架均具有良好的細胞相容性（圖4A）。此外，Phalloidin/Hoechst染色觀察骨髓間充質干細胞的細胞骨架結構，不同支架上培養(yǎng)的細胞均呈現清晰的細胞骨架形態(tài)和正常的擴散狀態(tài)(圖4B)。最后，EdU摻入實驗研究了支架對BMSCs體外增殖能力的影響。結果表明，培養(yǎng)24 h后，GS69組與陰性對照組的細胞增殖數量無顯著差異，說明該組對細胞增殖無不良影響。

（4）打印支架對兔OC缺陷模型的體內修復效果

圖5 打印支架對兔OC缺陷模型的體內修復效果

通過術后6周的觀察，GS69組在軟骨缺損區(qū)域形成了完整且平滑的軟組織，相比之下，其他組只顯示出部分軟組織修復(圖5Aa)。術后12周，對照組、H組、G組、HS組和H69組的修復仍被抑制，缺損表面有不規(guī)則軟組織覆蓋。具有BMSCs募集功能的支架組(如GS、G69、GS69)缺損區(qū)顯示完整光滑的軟骨樣組織覆蓋，而HS69組由于缺乏HANFs支持，仍有部分塌陷(圖5Ab)。此外，研究者通過微型計算機斷層掃描（Micro-CT）分析進一步證實了GS69支架在6周和12周時對原位誘導的OC缺陷再生有顯著的積極作用，而其他組的修復效果不明顯（圖5Ac-Af）。對缺損內新形成骨的定量評估證實了上述觀察結果（圖5B）。梯度水凝膠支架組感興趣小梁體積的骨體積/總體積(BV/TV)值明顯高于對照組，這表明將HANFs加入水凝膠增強了骨的再生能力，使構建物與宿主骨之間形成緊密結合。國際軟骨修復協(xié)會（ICRS）宏觀評估也顯示（圖5C和5D），對照組第12周的ICRS平均評分≈7.00±0.82，屬于III級(異常)。相比之下，GS69組處理動物的ICRS平均評分為≈11.33±0.47，評分為II級(接近正常軟骨)。這些結果表明，GS69支架對兔子的骨軟骨缺損具有顯著的體內修復效果。

（5）修復軟骨的組織學分析

圖6 修復軟骨的組織學分析

染色結果顯示，6周時，對照組缺損區(qū)纖維有限，組織修復不成熟。12周時，缺損區(qū)有連續(xù)的組織，有少量軟骨細胞和更多的纖維組織。與其他組相比，GS69組軟骨缺損下面板在6周時填充了未降解的支架。12周時，軟骨再生成功，組織形態(tài)與正常透明軟骨相似。再生軟骨與周圍軟骨融合良好，軟骨下骨生長良好。此外，O’driscoll組織學評分結果顯示，GS69組的評分最高(第6周≈19.67±1.70;第12周≈26.67±0.47)?？傮w而言，組織學評價進一步證實了GS69支架促進軟骨再生的有效性。

（6）修復軟骨的免疫熒光分析

圖7 修復軟骨的免疫熒光

免疫熒光分析結果顯示，6周時，GS69組的ACAN和COL2A1陽性細胞率顯著高于其他各組，COL1和RUNX2陽性細胞率接近含HANFs組(圖7B、C)。隨著修復時間的延長至12周，GS69組中ACAN、COL2A、COL1、RUNX2陽性細胞比例增加。多數軟骨細胞分布形態(tài)規(guī)則，伴有ACAN和II型膠原細胞外基質染色。COL1和RUNX2的高表達可以證實骨髓腔附近有新骨形成。這些結果表明，單獨釋放SDF-1α對誘導BMSCs成軟骨分化的作用并不像之前其他研究顯示的那樣顯著，因此也提示促進干細胞分化的主要原因在于支架的力學性能和微環(huán)境的相互協(xié)調。

小結：

該研究提出了軟骨組織工程領域的幾項重大創(chuàng)新。打印的支架不僅準確地再現了關節(jié)軟骨組織的三層結構和材料梯度，而且通過羥基磷灰石納米纖維的增強和與水凝膠的化學鍵的建立，獲得了良好的抗壓強度。支架的復雜設計，提供了一種獨特而有效的方法來捕獲和動員骨髓腔內的骨髓間充質干細胞到損傷部位。該方法是后續(xù)干細胞粘附、增殖和分化的基本前提。此外，支架的仿生設計結合了材料和結構梯度模擬，為骨髓間充質干細胞在每層內分化成不同的細胞類型建立了理想的微環(huán)境。因此，這種方法允許定制受損的關節(jié)軟骨組織，并通過利用3D打印技術高效生產支架。通過在單個支架內合并多種功能，可以立即植入受損軟骨部位，從而避免了體外干細胞共培養(yǎng)的需要。因此，一步式3D打印仿生軟骨支架可立即植入并原位誘導骨軟骨再生，這在骨軟骨修復中具有廣泛應用的巨大潛力。

相關工作以“Rapid Customization of Biomimetic Cartilage Scaffold with

Stem Cell Capturing and Homing Capabilities for In Situ Inductive Regeneration of Osteochondral Defects”為題于2024年6月1日發(fā)表在《Advanced Functional Materials》上。

原文鏈接：

https://doi.org/10.1002/adfm.202400608