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研究背景：

糖尿病已經(jīng)成為全球十大慢性代謝疾病中的第一種，還會(huì)引起許多的并發(fā)癥。糖尿病傷口微環(huán)境破壞了正常的傷口愈合階段，高血糖環(huán)境會(huì)產(chǎn)生高濃度的活性氧（ROS），導(dǎo)致持續(xù)性炎癥，進(jìn)一步促進(jìn)巨噬細(xì)胞極化為M1表型，從而加劇病情。在臨床實(shí)踐中，高血糖和巨噬細(xì)胞極化被認(rèn)為是治療糖尿病傷口的突破口。細(xì)菌感染是導(dǎo)致糖尿病傷口愈合緩慢的另一個(gè)關(guān)鍵因素，而傷口部位pH值與細(xì)菌感染有關(guān)，因此，監(jiān)測(cè)傷口的pH值可以明確傷口狀態(tài)，為治療提供早期預(yù)警。光熱抗菌是一種有望替代抗生素治療的治療方式，光熱劑將光能轉(zhuǎn)化為熱能，破壞細(xì)菌的細(xì)胞膜和蛋白質(zhì)，達(dá)到消除細(xì)菌的目的，其副作用小、可控性強(qiáng)、避免細(xì)菌耐藥性。

針對(duì)上述問(wèn)題，武漢理工大學(xué)戴紅蓮教授團(tuán)隊(duì)設(shè)計(jì)了一種集合診斷和治療功能的水凝膠，用于監(jiān)測(cè)傷口部位pH值的變化，結(jié)合ROS清除和光熱抗菌，調(diào)節(jié)糖尿病傷口微環(huán)境，促進(jìn)糖尿病傷口愈合。首先，采用水熱法制備了氧化鈰復(fù)合二硫化鉬納米顆粒（C@M），并在C@M上沉積一層聚多巴胺（C@M@P）。隨后，通過(guò)硫辛酸改性殼聚糖（LAMC），在紫外線（UV）下凝膠化。最后，將碳量子點(diǎn)（CD）和C@M@P摻入LAMC水凝膠中，在pH值4-9的范圍內(nèi)實(shí)現(xiàn)熒光響應(yīng)，使用智能手機(jī)監(jiān)測(cè)水凝膠的熒光信號(hào)，測(cè)量RGB值，產(chǎn)生擬合曲線，實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)傷口部位的pH值。相關(guān)研究在2024年4月21日以“A Multifunctional Hydrogel with Photothermal Antibacterial and AntiOxidant Activity for Smart Monitoring and Promotion of Diabetic Wound Healing”為題發(fā)表于《Advanced Functional Materials》（DOI：10.1002/adfm.202402531）上。

設(shè)計(jì)示意圖

（1） 復(fù)合水凝膠的智能pH監(jiān)測(cè)能力

正常皮膚的pH值在5-6之間，而糖尿病傷口可以在堿性條件下維持?jǐn)?shù)月，這會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的炎癥和細(xì)菌感染，延長(zhǎng)傷口愈合時(shí)間。在紫外光（365 nm）下，水凝膠的熒光強(qiáng)度隨pH值的變化而變化（圖1A）。當(dāng)pH值逐漸增大時(shí)，熒光強(qiáng)度也逐漸增強(qiáng)，且熒光強(qiáng)度與pH值的線性曲線可以很好的擬合，可以得出熒光強(qiáng)度與pH值的線性方程，這有助于實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)傷口狀態(tài)。為了解決肉眼下熒光強(qiáng)度變化的區(qū)別，使用智能手機(jī)將圖像轉(zhuǎn)換為RGB信號(hào)，構(gòu)建pH值與RGB的關(guān)系方程，通過(guò)擬合發(fā)現(xiàn)pH=0.1328（G+B）-41.66，利用這一方程可輕松獲取傷口pH值。

圖1 水凝膠的智能pH監(jiān)測(cè)功能

（2）復(fù)合水凝膠的物理性質(zhì)和ROS清除能力

通過(guò)搭接剪切強(qiáng)度實(shí)驗(yàn)測(cè)量復(fù)合水凝膠的黏附強(qiáng)度，隨著C@M@P NPs的添加，黏附強(qiáng)度增大，且抗壓強(qiáng)度得到顯著提高。此外，加入C@M@P NPs后，水凝膠表現(xiàn)出更快的溶脹動(dòng)力學(xué)，溶脹性得到提高。利用ROS清除實(shí)驗(yàn)評(píng)估復(fù)合水凝膠對(duì)H2O2、·OH、和O2-的清除效果，結(jié)果顯示，LAMC水凝膠具有一定的清除能力，主要是由于硫辛酸的抗氧化特性。摻入C@M@P NPs后，水凝膠的ROS清除能力得到進(jìn)一步提高，主要原因是與CeO2表面的氧空位有關(guān)。綜上，復(fù)合水凝膠具有良好的ROS清除活性，具有減輕氧化應(yīng)激損傷的潛力。

圖2 復(fù)合水凝膠的物理性質(zhì)和ROS清除能力

（3）光熱性能與近紅外輔助抗菌性能

為了評(píng)估復(fù)合水凝膠的光熱效應(yīng)，使用808 nm近紅外激光照射水凝膠，記錄溫度與時(shí)間變化曲線。LAMC水凝膠經(jīng)過(guò)10 min照射后，溫度升高不明顯，加入C@M@P NPs和CD后，LAMC/CD-C@M@P水凝膠的溫度升高至62.3℃。通過(guò)平板計(jì)數(shù)法評(píng)估復(fù)合水凝膠的抗菌性能，LAMC水凝膠對(duì)E. coli和S. aureus的抑制率僅有17.71%±6.48%和25.83%±0.73%，主要是由于帶正電荷的殼聚糖吸引帶負(fù)電的細(xì)菌，破壞細(xì)菌膜的滲透性。加入C@M@P NPs和CD，并通過(guò)NIR照射后，對(duì)E. coli和S. aureus的抑制率接近100%。隨后通過(guò)SEM觀察細(xì)菌形態(tài)，對(duì)照組細(xì)菌保持光滑且呈完整的球形或棒狀，LAMC/CD-C@M@P水凝膠通過(guò)NIR照射后，細(xì)菌細(xì)胞膜受損嚴(yán)重，內(nèi)容物流出。因此，C@M@P NPs的光熱效應(yīng)在抗菌中起到關(guān)鍵作用。

圖3 復(fù)合水凝膠的光熱和抗菌性能

（4）生物相容性和細(xì)胞遷移

良好的生物相容性是臨床生物材料的基本要求。在第1天和第3天沒(méi)有觀察到明顯的細(xì)胞毒性，到第5天LAMC/CD-C@M@P水凝膠與對(duì)照組開(kāi)始出現(xiàn)差異，這是由于水凝膠中NPs的釋放所致，但是對(duì)L929細(xì)胞的存活率均超過(guò)95%，細(xì)胞活死染色也證明了這一點(diǎn)。通過(guò)細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)評(píng)估水凝膠對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）遷移的影響，LAMC水凝膠基本與對(duì)照組接近，而LAMC/CD-C@M@P水凝膠明顯促進(jìn)了HUVEC的遷移，定量統(tǒng)計(jì)也顯示，LAMC/CD-C@M@P水凝膠處理24 h后細(xì)胞劃痕覆蓋率達(dá)到65.24%±1.13%。這些結(jié)果表明LAMC/CD-C@M@P水凝膠可以促進(jìn)細(xì)胞遷移。

圖4 復(fù)合水凝膠的體外細(xì)胞相容性和細(xì)胞遷移

（5） 抗氧化和抗炎能力

使用H2O2處理過(guò)的L929細(xì)胞作為氧化應(yīng)激模型，使用DCFH-DA探針研究復(fù)合水凝膠在細(xì)胞水平上的抗氧化能力。結(jié)果顯示，對(duì)照組的熒光強(qiáng)度為72.37%±7.00%，LAMC水凝膠和LAMC/CD-C@M@P水凝膠的熒光強(qiáng)度降低至54.56%±3.88%和30.41%±4.25%，表明LAMC/CD-C@M@P水凝膠可以有效的防止L929細(xì)胞的氧化應(yīng)激。隨后，通過(guò)LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞M1/M2表型相關(guān)基因的表達(dá)評(píng)價(jià)復(fù)合水凝膠的抗炎活性。結(jié)果顯示，LPS刺激后，M1相關(guān)基因（IL-1β、iNOS和IL-10）急劇增加，LAMC/CD-C@M@P水凝膠顯著抑制了IL-1β、iNOS和IL-10的表達(dá)，促進(jìn)了與M2相關(guān)基因（Arg-1、TGF-β和IL-10）的表達(dá)，表現(xiàn)出良好的抗炎活性。

圖5 復(fù)合水凝膠的抗氧化和抗炎作用

（6）體內(nèi)pH監(jiān)測(cè)與傷口愈合

通過(guò)腹腔注射鏈脲佐菌素（STZ）構(gòu)建大鼠糖尿病模型，并在此基礎(chǔ)上構(gòu)建糖尿病感染傷口模型。為了實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)和治療系統(tǒng)，使用LAMC/CD-C@M@P水凝膠監(jiān)測(cè)0-3天的pH值變化，通過(guò)記錄熒光強(qiáng)度的變化，并根據(jù)公式計(jì)算實(shí)時(shí)pH值。通過(guò)NIR照射后，第3天的傷口pH值基本恢復(fù)，這意味著有效消除了S. aureus并緩解了細(xì)菌感染。在實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)過(guò)程中，使用pH計(jì)真實(shí)記錄傷口的pH值變化，結(jié)果顯示與監(jiān)測(cè)值具有很強(qiáng)的相關(guān)性（圖6D）。在第14天LAMC/CD-C@M@P水凝膠的傷口愈合率達(dá)到94.73%±3.22%，明顯優(yōu)于對(duì)照組。

圖6 復(fù)合水凝膠在糖尿病傷口中的體內(nèi)研究

（7） 組織學(xué)與免疫熒光分析

通過(guò)免疫熒光染色和組織學(xué)分析評(píng)估LAMC/CD-C@M@P水凝膠的組織再生能力。LAMC/CD-C@M@P水凝膠組顯示出較少的炎癥細(xì)胞以及較高程度的傷口閉合，還顯示出更多的膠原沉積量，結(jié)果表明LAMC/CD-C@M@P水凝膠可有效促進(jìn)傷口愈合和膠原蛋白沉積。通過(guò)IL-6和CD31的免疫熒光染色評(píng)估傷口修復(fù)情況。LAMC/CD-C@M@P水凝膠組IL-6表達(dá)最低，表明驗(yàn)證反應(yīng)減少，CD31表達(dá)量最高，表明血管生成最多。此外，CD86和CD206的免疫熒光染色結(jié)果表明，LAMC/CD-C@M@P水凝膠可以促進(jìn)巨噬細(xì)胞分化為M2表型，表現(xiàn)出抗炎作用。

圖7 傷口的組織學(xué)分析

圖8 傷口的免疫熒光染色

小結(jié)：

該團(tuán)隊(duì)設(shè)計(jì)了一種具有pH監(jiān)測(cè)、光熱抗菌、抗氧化和抗炎特性的新型診斷和治療水凝膠。將CD摻入LAMC水凝膠賦予水凝膠光致發(fā)光性能，其熒光強(qiáng)度根據(jù)pH值的變化而變化。將C@M@P摻入LAMC水凝膠使水凝膠表現(xiàn)出良好的壓縮強(qiáng)度、光熱轉(zhuǎn)換能力和近紅外輔助抗菌能力。此外，LAMC/CD-C@M@P水凝膠還能有效清除ROS，緩解炎癥反應(yīng)，促進(jìn)巨噬細(xì)胞M2表型轉(zhuǎn)化，促進(jìn)糖尿病傷口愈合。因此，本研究為糖尿病傷口提供了一種新的監(jiān)測(cè)與治療多合一的策略。

原文鏈接：https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/adfm.202402531