團隊最新研究進展：負載淫羊藿苷和骨髓間充質干細胞的高強度雙網(wǎng)絡絲素蛋白水凝膠用于骨修復
專欄：學術前沿
發(fā)布日期：2024-04-30
作者：
骨缺損通常由外傷、疾病（如骨腫瘤或骨質疏松）、以及先天性缺陷引起，嚴重骨缺損的治療對傳統(tǒng)方法如自體骨移植和同種異體骨移植提出了挑戰(zhàn)。這些傳統(tǒng)方法存在種種限制，如供骨來源有限、手術創(chuàng)傷大、可能的免疫排斥反應及疾病傳播風險?；谔烊坏鞍姿z具有高水含量和良好的生物相容性，可以為細胞提供了一個支持生長和新組織形成的理想環(huán)境。盡管大部分蛋白質及其衍生物構建的用于骨缺損修復的水凝膠能夠滿足促進細胞生長的要求，然而這些水凝膠通常具有較差的機械性能，難以滿足硬組織修復的要求。此外，骨組織再生還涉及成骨細胞和破骨細胞的動態(tài)平衡。為確保構建的水凝膠組織工程支架能夠滿足組織再生的需求，有效遞送干細胞和其他生物活性分子以促進骨再生，也是當前研究的重點。
針對上述問題，暨南大學郭瑞課題組聯(lián)合杭州醫(yī)學院吳剛、林海燕主任團隊，首先對環(huán)糊精和金剛烷進行改性，通過環(huán)糊精和金剛烷的主客體組裝作用制備了三臂交聯(lián)劑HGSM，再利用HGSM與甲基丙烯酰化絲素蛋白SFMA進行化學交聯(lián)，形成雙網(wǎng)絡水凝膠HGSFMA，再利用水凝膠負載骨髓間充質干細胞（BMSCs）和淫羊藿苷（ICA）（圖1）。該研究利用環(huán)糊精和金剛烷的主客體組裝作用，顯著增強了甲基丙烯?；z素蛋白（SFMA）的機械強度，并且利用該水凝膠遞送骨髓間充質干細胞（BMSCs）和淫羊藿苷（ICA），抑制了破骨細胞的形成，促進損傷股骨的再生。該工作以“High-strength double-network silk fibroin based hydrogel loaded with Icariin and BMSCs to inhibit osteoclasts and promote osteogenic differentiation to enhance bone repair”為題發(fā)表在《Biomaterials Advances》（DOI：10.1016/j.bioadv.2024.213856）上。暨南大學郭瑞研究員、杭州醫(yī)學院吳剛教授和林海燕教授為該文的通訊作者。
圖1 水凝膠制備過程示意圖
（1）HGSFMA水凝膠具有顯著增強的模量和機械強度 制備的HGSFMA水凝膠相比于SFMA水凝膠，極大地提高了水凝膠的模量和壓縮強度，模量的提升與HGSM的添加量成正比（圖2）。
圖2 SFMA和HGSFMA 水凝膠的化學結構和物理性質的表征。(A) HGSM的2D ROESY NMR譜；(B) SF和SFMA的1 H NMR譜；(C) 水凝膠的SEM圖像；(D)-(E)水凝膠流變檢測；(F) 水凝膠的壓縮應力-應變曲線；(G) 水凝膠的溶脹率和（H）降解率；(I) ICA的體外累積釋放速率曲線。
（2）水凝膠的生物相容性和體外成骨作用評價 進一步用BMSCs對ICA的毒性和水凝膠的細胞毒性進行評價，該研究制備的水凝膠無細胞毒性。并且HGSFMA/ICA水凝膠能夠促進BMSCs的堿性磷酸酶ALP的表達（圖3）。茜素紅染色顯示鈣結節(jié)數(shù)量和成骨相關蛋白（RUNX2和OCN）的表達量也顯著增加（圖4）。
圖3 SFMA和HGSFMA水凝膠對BMSCs的細胞毒性以及BMSCs體外誘導分化的ALP染色。（A）不同濃度ICA培養(yǎng)的BMSCs在光學顯微鏡下的形態(tài)學變化；（B）不同濃度ICA培養(yǎng)的BMSCs的細胞活力；（C）通過CCK-8測定與水凝膠共培養(yǎng)的 BMSC 的細胞活力；（D）水凝膠培養(yǎng)的BMSC的活/死染色和（E）細胞骨架染色圖像；（F）水凝膠培養(yǎng)14天后BMSCs的ALP染色；（G）BMSCs的ALP活性的定量檢測。
圖4 培養(yǎng)14天后BMSCs體外成骨評價。（A）茜素紅染色；（B）RUNX2和OCN免疫熒光染色圖像；（C）茜素紅染色定量；（D）RUNX2和（E）OCN表達的定量分析。
（3）大鼠股骨損傷模型治療效果評價
通過大鼠股骨損傷模型，驗證水凝膠促進骨再生的作用。在股骨缺損治療后1-2周，與HGSFMA組和對照組相比，HGSFMA/ICA和HGSFMA/ICA/BMSC組表現(xiàn)出顯著增強的骨再生，新形成的骨幾乎填充了腔隙缺損。術后4周，HGSFMA/ICA和HGSFMA/ICA/BMSC組顯示出更大的新形成骨質量。Micro-CT數(shù)據(jù)的定量分析進一步支持了HGSFMA/ICA/BMSC組優(yōu)異的骨再生潛力。該組的骨體積分數(shù)（BV/TV）/骨礦物質密度（BMD）顯著高于其他對照組，骨小梁厚度（Tb/Th）增加和骨小梁分離（Tb. Sp）減少，證明了HGSFMA/ICA/BMSC水凝膠在促進大鼠股骨缺損模型中骨再生和改善骨質量方面的有效性（圖5）。
圖5 CT成像評價大鼠股骨損傷的治療效果。（A）再生骨組織的顯微CT圖像（白色虛線圓圈代表缺損位置）；（B）骨密度(BMD)定量指標；（C）骨體積分數(shù)定量指標(BV/TV)；（D）小梁數(shù)量定量指標(Tb.Th)；（E）骨小梁分離的定量指標 (Tb. Sp)。
維持成骨細胞和破骨細胞之間的動態(tài)平衡對于有效的骨修復至關重要。破骨細胞的持續(xù)存在和升高會顯著阻礙骨再生的速度。炎癥是驅動破骨細胞分化的關鍵因素。ICA已被證明可以有效抑制炎癥細胞因子的釋放并調節(jié)NF-κB信號通路的激活，進而減輕局部炎癥并抑制破骨細胞分化。此外，淫羊藿苷通過STAT3途徑促進下游成骨基因骨鈣素（OCN）的轉錄，其中STAT3直接與OCN啟動子相互作用。TRAP染色顯示HGSFMA/ICA和HGSFMA/ICA/BMSC組內(nèi)破骨細胞數(shù)量顯著降低（圖6）。
圖6 治療4周后破骨細胞的染色。 白色箭頭指示破骨細胞
研究結論：
該研究報道了雙網(wǎng)絡交聯(lián)高強度水凝膠HGSFMA對比SFMA具有明顯提升的機械強度，并且具有優(yōu)異的生物相容性，可以作為載體遞送藥物和干細胞，是一種良好的骨組織工程支架材料。體外研究結果表明，HGSFMA/ICA水凝膠具有增強BMSC增殖和分化的能力。大鼠股骨損傷修復模型治療效果評價中，通過micro-CT、病理染色、TRAP染色、關鍵成骨標志物的免疫熒光染色等證實了HGSFMA/ICA/BMSC在抑制破骨細胞和促進成骨細胞分化中的有效性?？傮w來說，該研究結果對于啟發(fā)改善天然蛋白機械性能，構建基于天然蛋白的骨組織工程支架具有積極意義。
原文鏈接：
https://www-sciencedirect-com.lille.sjlib.cn/science/article/pii/S2772950824000992
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