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針對(duì)上述問題，廣西醫(yī)科大學(xué)陳文霞、王亞玲和蔣興祿團(tuán)隊(duì)研發(fā)了一種載雙抗生素的抗菌金納米簇（Au NCs）水凝膠（DA@Au NCs），用于再生性牙髓治療。該水凝膠通過靜電相互作用和二硫鍵生成負(fù)載藥物，在感染根管間質(zhì)液作用下可膨脹填滿根管，與細(xì)菌充分接觸，并能被間質(zhì)液和內(nèi)部蛋白酶觸發(fā)降解釋放DA，其交聯(lián)時(shí)間可調(diào)節(jié)降解時(shí)間。Au NC水凝膠具有放射線顯影能力，可追蹤藥物位置和釋放動(dòng)態(tài)，提高抗菌效率，實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)期抗菌效果并降低細(xì)胞毒性，還能殺滅浮游細(xì)菌和生物膜，滲透至牙本質(zhì)小管。同時(shí)，Au NCs的引入有助于支持干細(xì)胞的增殖、遷移、黏附和礦化，促進(jìn)牙髓組織再生。該文章于 2024 年 10 月 9 日以《Visual Antimicrobial Gold Nanocluster Hydrogel with Inflammation-Responsive and Time-Regulated Swelling/Degradation for Regenerative Endodontic Procedures》為題發(fā)表于《ACS Nano》（DOI：10.1021/acsnano.4c14202）。

圖1. DA@Au NC水凝膠的構(gòu)建和多功能示意圖

（1）合成與表征 DA@Au NC 水凝膠

通過生物礦化方法，以牛血清白蛋白（BSA）為模板和還原劑，與氯金酸（HAuCl?）在堿性條件下反應(yīng)合成金納米簇（Au NCs），溶液顏色從淺黃色變?yōu)樯钭厣?，紫外光下熒光呈深紅色。圖 2A 顯示 Au NCs 為 2 ± 0.668 nm 的球形顆粒，圖 2B 顯示其紫外吸收光譜在 275 nm 處有吸收峰。超小 Au NCs 可滲透至牙本質(zhì)小管，深度約 45 μm（圖 2C）。將水加入 Au NCs 和 DA 的混合物中，通過靜電相互作用和二硫鍵生成制備 DA@Au NC 水凝膠，Au NCs 與水比例小于 1:6 時(shí)呈凝膠狀，DA 不影響水觸發(fā)的 Au NC 水凝膠形成（圖 2D）。XPS 結(jié)果顯示 Au NC 水凝膠中二硫鍵比例高于 Au NC 溶液（圖 2E、圖 2F），且在二硫蘇糖醇（DTT）溶液中可轉(zhuǎn)變?yōu)橐后w（圖 2G）。SDS-PAGE 和考馬斯亮藍(lán)染色結(jié)果表明 DA 能與 Au NCs 表層的 BSA 結(jié)合（圖 2I）。SEM 圖像顯示 DA@Au NC 水凝膠孔徑為 7.92 μm（圖 2J），Au NCs 孔徑為 15.23 μm，DA 與 Au NCs 間相互作用影響水凝膠結(jié)構(gòu)。Au NCs 和 DA@Au NCs 的 X 射線強(qiáng)度與 Au NC 濃度呈正相關(guān)（圖 2H），可作為根管內(nèi)藥物定位及釋放動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)的有效示蹤材料。

圖2 DA@Au NC水凝膠的合成與表征。（A）Au NCs的TEM圖像；（B）Au NCs的紫外吸收光譜；（C）Au NCs在牙本質(zhì)小管中的穿透深度（CLSM）；（D）Au NCs和DA@Au NCs水凝膠的外觀圖像；（E）XPS顯示水凝膠中二硫鍵的增加；（F）溶液中二硫鍵的XPS譜圖；（G）水凝膠在DTT溶液中溶解為溶液（紅色箭頭指向水凝膠）；（H）不同Au NCs濃度下的DA@Au NCs的CT圖像及X射線放射強(qiáng)度隨Au NCs濃度變化的函數(shù)；（I）SDS-PAGE顯示BSA與DA結(jié)合的條帶位置；（J）水凝膠的SEM圖像顯示多孔形態(tài)；（K）DA@Au NC水凝膠合成機(jī)制及凝膠化機(jī)理示意圖

（2）與根管感染控制相關(guān)的水凝膠性能

構(gòu)建的載雙抗生素的金納米簇水凝膠（DA@Au NC hydrogel）可有效控制根管感染。水凝膠能膨脹填充根管，包括根管峽部，延長(zhǎng)抗菌劑有效半衰期，且可通過可視化手段監(jiān)測(cè)藥物濃度變化。其大孔結(jié)構(gòu)基于 Flory?Rencher 理論，為高膨脹率提供基礎(chǔ)，對(duì)藥物有效遞送至根管壁至關(guān)重要。細(xì)菌感染引起的組織液增加可作為膨脹劑，使水凝膠膨脹吸收炎癥滲出液，填充整個(gè)根管腔（圖 3A）。這種膨脹特性有助于控制出血，創(chuàng)造支持性微環(huán)境吸收細(xì)胞和因子，確保藥物與根管壁上微生物充分接觸，提高殺菌效率。DA@Au NC 水凝膠的交聯(lián)時(shí)間與降解時(shí)間呈正相關(guān)，交聯(lián) 30 分鐘的水凝膠 10 天內(nèi)完全降解，交聯(lián) 24 小時(shí)的水凝膠 50 天后可降解（圖 3B），據(jù)此建立的交聯(lián)時(shí)間與降解時(shí)間的數(shù)學(xué)模型方程為 y = 51.13?45*e(?x/9.5)，擬合指數(shù)為 0.99987，可用于精確計(jì)算水凝膠的交聯(lián)時(shí)間以適應(yīng)不同治療需求。水和酶均能觸發(fā)水凝膠降解，且酶催化下降解速率顯著提高，歸因于水凝膠外殼中蛋白質(zhì)與酶的特異性酶?底物磷酸化反應(yīng)（圖 3D）。DA@Au NC 水凝膠的間質(zhì)液 / 酶雙響應(yīng)特性可根據(jù)炎癥程度精確控制藥物釋放，實(shí)現(xiàn)高效、精準(zhǔn)的根管內(nèi)感染控制。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)了 DA@Au NC 水凝膠在體內(nèi)的 X 射線追蹤性能，為根管內(nèi)藥物的定位和釋放動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)提供有效手段（圖 3E），且 DA@Au NC 水凝膠不會(huì)導(dǎo)致冠部染色，克服了傳統(tǒng)三聯(lián)抗生素中鹽酸米諾環(huán)素引起的冠部變色問題（圖 3I）。

圖3 DA@Au NC水凝膠的控釋特性。（A）DA@Au NC水凝膠的溶脹性能；（B）CLSM和立體顯微鏡顯示水凝膠溶解后填充根管；（C）不同交聯(lián)時(shí)間水凝膠的溶脹曲線顯示交聯(lián)時(shí)間越長(zhǎng)，完全降解所需時(shí)間越長(zhǎng)；（D）SEM顯示交聯(lián)24小時(shí)的水凝膠比交聯(lián)30分鐘的水凝膠更致密、孔隙更少；（E）XPS顯示交聯(lián)時(shí)間增加二硫鍵含量增加；（F）酶能加速水凝膠降解；（G）不同交聯(lián)時(shí)間水凝膠在體內(nèi)的降解過程；（H）CT圖像顯示根管內(nèi)水凝膠的放射強(qiáng)度和體積變化；（I）功能關(guān)系顯示放射強(qiáng)度、體積與剩余藥物量之間的關(guān)系；（J）7天后水凝膠未引起牙本質(zhì)染色

（3）DA@Au NC 水凝膠的抗菌活性

DA@Au NC水凝膠對(duì)根管感染相關(guān)細(xì)菌（包括屎腸球菌和牙齦卟啉單胞菌）的抗菌活性進(jìn)行了評(píng)估，其對(duì)這兩種細(xì)菌的最小抑制濃度均為4μg/mL，與DA的MIC相同，表明Au NCs的加入不影響DA的抗菌活性。含環(huán)丙沙星的水凝膠能幾乎完全殺死屎腸球菌，而Au NCs和甲硝唑能顯著消除大量牙齦卟啉單胞菌。抑制圈實(shí)驗(yàn)顯示DA@Au NCs的抗菌效果可持續(xù)7天（圖4A），第3天抑制圈減小是因?yàn)榄h(huán)丙沙星釋放速率降低。SEM和TEM觀察發(fā)現(xiàn)，經(jīng)Au NCs處理的牙齦卟啉單胞菌細(xì)胞壁完整性遭到破壞，出現(xiàn)細(xì)菌收縮、碎片化和細(xì)胞壁降解等現(xiàn)象（圖4B、C），而屎腸球菌未發(fā)現(xiàn)結(jié)構(gòu)損傷。此外，DA@Au NC水凝膠在屎腸球菌生物膜中殺死了85%的細(xì)菌，在牙齦卟啉單胞菌生物膜中殺死了87%至92%的細(xì)菌（圖4D），顯示出與DA相當(dāng)?shù)目咕钚裕⑶褼A能從Au NC水凝膠中充分釋放以殺死細(xì)菌。最后，DA@Au NC水凝膠在感染牙本質(zhì)小管模型中對(duì)屎腸球菌和牙齦卟啉單胞菌的殺菌率均達(dá)79%（圖4E），表明其能有效穿透牙本質(zhì)小管殺死細(xì)菌，并展現(xiàn)出優(yōu)異的生物膜抗菌活性。

圖4 DA@Au NC水凝膠對(duì)E. faecalis和P. gingivalis的抗菌活性。（A）不同藥物處理后不同時(shí)間點(diǎn)的抑制圈圖像；（B）經(jīng)Au NCs處理的P. gingivalis的形態(tài)變化和結(jié)構(gòu)損傷的SEM觀察；（C）經(jīng)Au NCs處理的P. gingivalis的TEM觀察（紅色框放大為白色框）；（D）3D生物膜模型和受感染牙本質(zhì)樣本重建，并通過CLSM分析SYTO9/PI活/死熒光染色圖像；（E）DA@Au NC水凝膠對(duì)E. faecalis和P. gingivalis的抗菌活性評(píng)估

（4）DA@Au NC 水凝膠的生物相容性及對(duì) DPSC 功能的影響

Au NC水凝膠顯著促進(jìn)牙髓干細(xì)胞（DPSCs）礦化活性。DPSCs在Au NCs誘導(dǎo)下，成骨相關(guān)基因（如VEGF和ALPL）表達(dá)較高。RNA測(cè)序分析顯示，Au NCs礦化能力主要通過調(diào)控細(xì)胞趨化、生長(zhǎng)因子活性、血管生成和鈣離子轉(zhuǎn)運(yùn)等生物過程實(shí)現(xiàn)。免疫熒光染色顯示Au NC組中堿性磷酸酶（ALP）表達(dá)最高（圖6E）。ALP染色表明，1250μg/mL濃度下Au NCs礦化能力最顯著（圖6F）。RT-PCR結(jié)果顯示，Au NCs中礦化相關(guān)基因（Runx-2、ALP、COL-I）的mRNA表達(dá)量高于對(duì)照組（圖6G）。細(xì)胞wound scratch實(shí)驗(yàn)顯示，Au NCs和DA@Au NCs的遷移率分別為22%和17%，顯著高于DA組的2%（圖5C）。Au NC水凝膠處理的牙本質(zhì)切片上，DPSCs顯示出良好細(xì)胞伸展特性和微絲連接，而DA處理組細(xì)胞數(shù)量顯著減少（圖5B）。這些結(jié)果表明，Au NC水凝膠通過調(diào)控ALP表達(dá)和相關(guān)基因表達(dá)，顯著提高DPSCs礦化能力，為細(xì)胞遷移和黏附提供有利微環(huán)境，促進(jìn)牙髓組織再生。

圖5 DA@Au NC水凝膠對(duì)DPSCs的生物相容性和功能影響。（A）經(jīng)每種藥物處理的DPSCs的活/死染色；（B）DPSCs在經(jīng)不同處理的牙本質(zhì)上的黏附和伸展的CLSM圖像（藍(lán)色為細(xì)胞核，紅色為細(xì)胞骨架）；（C）不同組處理后DPSCs遷移的代表性圖像及遷移率；（D）用ALP和ARS染色評(píng)估DPSCs礦化能力

圖6 DPSCs在Au NCs培養(yǎng)下的RNA測(cè)序分析。（A）火山圖顯示Au NCs與P-Control組間差異表達(dá)基因；（B）GO條款和KEGG通路從差異表達(dá)基因中富集；（C）差異表達(dá)基因的KEGG通路富集分析；（D）代表性差異基因的熱圖；（E）各組ALP表達(dá)的免疫熒光染色；（F）不同濃度Au NCs的ALP染色；（G）通過RT-PCR檢測(cè)與礦化相關(guān)的基因表達(dá)

（5）體內(nèi)實(shí)驗(yàn)：DA@Au NC 水凝膠的生物相容性與抗菌效果評(píng)估

在犬類根尖周病變模型中，DA@Au NC水凝膠展現(xiàn)出優(yōu)異的X射線追蹤性能，可通過放射強(qiáng)度變化監(jiān)測(cè)藥物釋放（圖7B）。經(jīng)過4周治療，DA@Au NC水凝膠顯著減少了根管內(nèi)的細(xì)菌數(shù)量（圖7C），并通過CBCT三維重建顯示其促進(jìn)了根尖周炎癥病變的愈合，療效優(yōu)于其他組（圖7D和表S2）。此外，DA@Au NC水凝膠降低了炎癥相關(guān)基因（TNF-α、IL-6、IL-1β）的表達(dá)（圖8A），并通過組織學(xué)檢查顯示其促進(jìn)了根尖周圍組織的修復(fù)和新骨形成（圖8B）。免疫熒光染色進(jìn)一步證實(shí)了其降低IL-6表達(dá)并提高ALP表達(dá)的能力（圖8C）。這些結(jié)果表明，DA@Au NC水凝膠具有出色的愈合和修復(fù)能力。

圖7 DA@Au NC水凝膠的體內(nèi)生物相容性和抗菌效果評(píng)估。（A）根尖周病變模型的建立和根管消毒程序；（B）給藥前后X射線圖像顯示DA@Au NCs水凝膠的放射強(qiáng)度和體積變化；（C）放置根管藥物前后根管內(nèi)細(xì)菌菌落計(jì)數(shù)；（D）CBCT掃描的3D重建顯示根尖周病變?cè)诜胖酶芩幬锴昂蟮淖兓?/span>

圖8 DA@Au NC水凝膠對(duì)根尖周病變愈合的影響。（A）通過RT-PCR檢測(cè)炎癥相關(guān)基因（TNF-α、IL-6、IL-1β）的表達(dá)，DA@Au NC組表達(dá)量顯著降低；（B）H&E染色和馬松三色染色顯示DA@Au NC處理后根尖周組織破壞面積減小，該組在根尖區(qū)周圍有大量致密纖維組織和少量新骨形成；（C）免疫熒光染色顯示DA@Au NC組IL-6表達(dá)較低，ALP表達(dá)較高