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美國(guó)塔夫茨大學(xué)David L. Kaplan和美國(guó)陸軍外科研究所Kristo Nuutila團(tuán)隊(duì)針對(duì)燒傷治療的難題，開發(fā)了一種便攜式噴霧系統(tǒng)。該系統(tǒng)可瞬間將含有治療劑的保護(hù)性水凝膠涂層應(yīng)用于大小和形狀各異的傷口，其噴霧水凝膠涂層模仿天然絲綢紡絲過(guò)程，形成自支撐、類似蜘蛛網(wǎng)的交織結(jié)構(gòu)，支持組織粘附、細(xì)胞活性和血管再生。通過(guò)豬燒傷模型測(cè)試，證明該絲綢基噴霧涂層與抗生素聯(lián)合使用時(shí)，顯著加速了深二度燒傷的愈合，展現(xiàn)了快速有效的緊急醫(yī)療應(yīng)用潛力。該文章于2025年02月01日以《On-Demand Silk Protein-Based Spray for Acute Burn Wound Management》為題發(fā)表于《Advanced Functional Materials》（DOI：10.1002/adfm.202422888）。

受天然蠶絲紡絲過(guò)程啟發(fā)而設(shè)計(jì)的即時(shí)噴涂水凝膠涂層的示意圖

（1）PEG對(duì)絲綢結(jié)構(gòu)的影響

分子動(dòng)力學(xué)（MD）模擬研究絲蛋白在聚乙二醇（PEG）存在下的構(gòu)象轉(zhuǎn)變機(jī)制，構(gòu)建了僅含絲蛋白（絲蛋白在水環(huán)境）和含絲蛋白與PEG（絲蛋白/PEG）兩種模型。100 ns MD模擬顯示，兩個(gè)模型的絲蛋白結(jié)構(gòu)在模擬20 ns后趨于穩(wěn)定，絲蛋白/PEG模型中PEG逐漸與蛋白結(jié)合，20 ns后達(dá)平衡狀態(tài)（圖1A、B）。絲蛋白/PEG的回轉(zhuǎn)半徑（Rg）、均方根偏差（RMSD）和溶劑可及表面面積（SASA）值低于絲蛋白在水環(huán)境中的值（圖1C、D），絲蛋白/PEG的氫鍵數(shù)量在100 ns模擬期間保持穩(wěn)定且始終高于絲蛋白在水環(huán)境中的氫鍵數(shù)（圖1E），其鏈間能量在模擬期間逐漸降低，65 - 100 ns期間達(dá)到相對(duì)穩(wěn)定狀態(tài)（圖1F），表明其結(jié)構(gòu)更緊湊、穩(wěn)定性更高，且絲蛋白和PEG之間存在優(yōu)先相互作用。引入PEG后，絲蛋白中β - 折疊和轉(zhuǎn)角的比例增加，而線團(tuán)比例降低（圖1G）。實(shí)驗(yàn)中的傅里葉變換紅外光譜（FTIR）證實(shí)了PEG誘導(dǎo)的β - 折疊轉(zhuǎn)變趨勢(shì)，在噴射的絲蛋白/PEG涂層中，出現(xiàn)從1645 cm?1到1627 cm?1的顯著紅移，同時(shí)β - 折疊含量顯著增加，表明結(jié)構(gòu)從以無(wú)定形為主的狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)棣?- 折疊結(jié)構(gòu)（絲蛋白II）（圖1H）。

圖1 絲結(jié)構(gòu)的構(gòu)象轉(zhuǎn)變。（a）絲在水中的結(jié)構(gòu)波動(dòng)；（b）絲/PEG在超過(guò)100 ns的MD模擬期間的結(jié)構(gòu)波動(dòng)；（c）Rg；（d）RMSD；（e）在絲綢和絲綢/PEG體系中100 ns模擬過(guò)程中氫鍵數(shù)目的波動(dòng)；（f）100ns模擬水合環(huán)境下絲與PEG的相互作用能；（g）蠶絲和蠶絲/PEG體系中二級(jí)結(jié)構(gòu)比例的變化；（h）真絲溶液和噴涂真絲/PEG水凝膠涂層的FTIR光譜

（2）真絲噴涂涂料的內(nèi)部纖維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)和機(jī)械性能

研究評(píng)估了由6%（wt）絲素蛋白溶液和20%（wt）聚乙二醇（PEG）溶液組成的噴射絲素蛋白/PEG水凝膠涂層的流變性質(zhì)。儲(chǔ)能模量（G’）始終大于損耗模量（G’’），表明噴射過(guò)程形成了穩(wěn)定的水凝膠（圖2A、B）。粘度隨剪切率增加而降低，證實(shí)了絲素蛋白/PEG水凝膠涂層的剪切變稀和可噴射特性（圖2C）。噴射的絲素蛋白/PEG水凝膠涂層可粘附于豬皮，無(wú)需額外后處理促進(jìn)組織相互作用（圖2D i）。該自支撐水凝膠涂層由交織纖維束組成，光學(xué)顯微鏡（圖2D ii）和掃描電子顯微鏡（SEM）（圖2D iii, iv）進(jìn)一步觀察了其結(jié)構(gòu)，單個(gè)桿狀纖維直徑在微米范圍內(nèi)，表面光滑，沿纖維軸排列著納米纖維束（圖2D iv）。絲素蛋白/PEG水凝膠涂層與豬皮之間的剪切強(qiáng)度和界面韌性分別約為43.3 kPa和201.4 J/m2（圖2E）。數(shù)值建模中，使用剪切變稀流體作為模擬的混合前體溶液，流體被排出時(shí)施加的壓力逐漸降低（圖2F）。混合流體從單獨(dú)通道合并后，在混合通道內(nèi)遇到更大的壁面剪切力（圖2G）。最后階段，流體通過(guò)混合通道時(shí)流速加快，導(dǎo)致流體預(yù)取向和拉伸，使流體組裝成具有層次和排列結(jié)構(gòu)的纖維束（圖2H）。

（3）含有慶大霉素的真絲噴涂涂料的體外抗菌活性

為評(píng)估絲素蛋白基噴射水凝膠涂層作為藥物遞送系統(tǒng)的潛力，制備了絲素蛋白/PEG（SP）和含慶大霉素的絲素蛋白/PEG涂層（SPG）。SPG涂層對(duì)金黃色葡萄球菌（S. aureus）和大腸桿菌（E. coli）顯示出顯著的抗菌活性，與SP對(duì)照組相比，SPG涂層在與S. aureus和E. coli孵育24小時(shí)后，S. aureus的LB瓊脂平板上未見菌落形成單位（CFUs），E. coli的CFUs顯著減少（圖2I，左中圖）。SPG覆蓋區(qū)域周圍觀察到顯著的抑制區(qū)，證實(shí)慶大霉素有效釋放和擴(kuò)散（圖2I右側(cè)圖）。SPG對(duì)S. aureus和E. coli的抗菌效果分別達(dá)到99.3%和97.3%（圖2J）。在37°C的PBS溶液中，SPG涂層在前24小時(shí)內(nèi)釋放了約46%的慶大霉素，表明其釋放迅速高效（圖2K）。

圖2 絲基噴涂涂層水凝膠的機(jī)械性能、形態(tài)、結(jié)構(gòu)形成和抗菌效果。（a）振幅掃描范圍為0.1%至1000%應(yīng)變；（b）頻率掃描范圍為0.1至10 rad s?1；（c）粘度隨剪切速率的變化；（d）（i）粘附在豬皮上的即時(shí)絲/PEG噴霧水凝膠涂層的數(shù)碼照片，（ii）放大光學(xué)顯微鏡圖像，（iii）絲/PEG噴涂水凝膠涂層的SEM圖像，（iv）放大后的SEM圖像；（e）噴霧態(tài)蠶絲/PEG水凝膠涂層在濕豬皮上的粘附性能；（f）壓力梯度；（g）剪切速率梯度；（h）速度梯度；（i）抑菌圈；（j）對(duì)應(yīng)的抑菌率；（k）96 h內(nèi)SPG涂層中慶大霉素的累積釋放量

（4）體外細(xì)胞增殖、遷移和血管生成 

含血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）的絲素蛋白噴霧涂層（SPV）及含慶大霉素和VEGF的噴霧涂層（SPGV）能顯著促進(jìn)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）遷移。培養(yǎng)基、噴射SP、SPV及SPGV涂層處理的細(xì)胞層24小時(shí)內(nèi)幾乎完全愈合（圖3Ai）。體外傷口閉合率顯示，SPV和SPGV涂層處理的HUVECs在4小時(shí)內(nèi)傷口閉合率超50%（圖3B），表明涂層中VEGF保持生物活性且有效促進(jìn)細(xì)胞遷移。熒光成像評(píng)估HUVEC-GFP細(xì)胞活性，48小時(shí)后不同噴霧涂層處理的細(xì)胞無(wú)細(xì)胞毒性且生物相容性良好（圖3Aii）。AlamarBlue測(cè)定法評(píng)估21天培養(yǎng)期內(nèi)細(xì)胞活力，第7天前各組熒光強(qiáng)度增加，細(xì)胞活躍增殖，整個(gè)21天期間持續(xù)監(jiān)測(cè)代謝活性，暴露于涂層的HUVECs活力與對(duì)照組相當(dāng)（圖3C），證實(shí)絲素蛋白噴霧涂層長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)保持高生物相容性。免疫熒光染色CD31顯示，與SP和SPG噴霧涂層共培養(yǎng)的細(xì)胞在形態(tài)和CD31表達(dá)水平上與標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基中的對(duì)照組相似（圖3D）。

圖3 絲基涂層噴涂水凝膠對(duì)細(xì)胞增殖、遷移和血管生成的體外評(píng)估。A)各組HUVECs遷移圖像；B)定量遷移比；Aii)HUVEC-GFP細(xì)胞經(jīng)培養(yǎng)基、SP、SPG、SPV和SPGV培養(yǎng)48 h后的熒光圖像；C)不同處理HUVECs 21天內(nèi)的細(xì)胞增殖試驗(yàn)；D)第7天HUVECs CD31染色免疫熒光圖像，觀察各處理HUVECs血管生成分化能力

（5）燒傷創(chuàng)面深度評(píng)價(jià)及細(xì)胞因子表達(dá)

燒傷由凝固區(qū)、瘀滯區(qū)和充血區(qū)構(gòu)成，其會(huì)隨時(shí)間進(jìn)展，內(nèi)層凝固區(qū)為不可逆壞死組織，外層瘀滯區(qū)和充血區(qū)可通過(guò)有效治療挽救，若燒傷進(jìn)展，凝固區(qū)可能擴(kuò)大，使淺度燒傷轉(zhuǎn)為深度燒傷。組織病理學(xué)分析顯示，治療后第3天及第7天，無(wú)治療組燒傷深度分別為1105.06μm、1207.03μm，SP組分別為845.88μm、1010.96μm，SSD組分別為813.66μm、997.07μm，SPG組分別為503.38μm、583.77μm，SPG組燒傷深度在這兩天均顯著低于其他組（圖4B、C），表明SPG噴霧療法能有效抑制燒傷進(jìn)展。檢測(cè)燒傷后第3、7、14天白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）和白細(xì)胞介素-8（IL-8）表達(dá)水平（4圖D、E），以深入探究燒傷組織炎癥狀態(tài)。

圖4 豬燒傷深度評(píng)估及炎癥細(xì)胞因子分析。A)豬燒傷創(chuàng)面形成示意圖及治療時(shí)間表；B)創(chuàng)面組織的MTS；C)治療后第3、7天燒傷深度定量分析；D)不同處理后第3、7、14天各組組織中IL-1β的變化；E)不同處理后第3、7、14天各組組織中IL-8的變化

（6）創(chuàng)面愈合和質(zhì)量評(píng)估

治療后0、3、7、14和21天使用2D/3D成像相機(jī)進(jìn)行宏觀評(píng)估。21天后，所有傷口均有初始損傷的可見跡象，無(wú)治療組紅腫最明顯（圖5A），而SPG治療的傷口在第14天顯著恢復(fù)，第21天傷口表面更平滑，接近正常完整皮膚（圖5B）。燒傷傷口經(jīng)H&E染色和MTS分析顯示，SPG治療的傷口隨時(shí)間形成活性肉芽組織并再生上皮（圖5C），表明燒傷通過(guò)組織再生遵循正常愈合過(guò)程。組織學(xué)分析評(píng)估再上皮化和傷口體積減少情況，SP、SSD和SPG治療的傷口在燒傷后第21天幾乎完全再上皮化，SPG治療顯著加速前14天內(nèi)的再上皮化進(jìn)程（圖5D），且SPG、SP和SSD組傷口體積顯著小于無(wú)治療組（圖5E）。燒傷后第21天，SPG治療的傷口表皮厚度（395.1微米）和皮膚脊（1.23毫米）最高，接近正常完整組織數(shù)值（表皮厚度：401.5微米；皮膚脊：1.29毫米）（圖5F、G）。第21天評(píng)估傷口收縮和隆起情況，SPG治療的傷口收縮、隆起和紅斑顯著減少，毛囊密度高于未治療的傷口（圖5H、I）。

圖5 燒傷模型的創(chuàng)面愈合和質(zhì)量評(píng)估。A,B)21天內(nèi)不同治療方法下燒傷創(chuàng)面的宏觀評(píng)價(jià)攝影；C)第14、21天傷口組織的MTS圖像及定量分析；D)第7、14、21天各治療組的再上皮化定量分析；E)第7、14、21天各治療組的創(chuàng)面體積定量分析；F)第21天各處理的表皮厚度定量分析；G)第21天各處理的皮膚脊定量分析；H)第21天各處理的收縮率定量分析；I)第21天各處理的創(chuàng)面組織抬高定量分析