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針對上述問題，國立清華大學(xué)宋信文團(tuán)隊利用小鼠原位模型，開發(fā)了一種基于天然免疫引導(dǎo)的治療策略，用于靶向胰腺導(dǎo)管腺癌（PDAC）。研究設(shè)計了一種口服治療診斷納米平臺，基于β-葡聚糖（βGlus）功能化的納米顆粒（NPs），其中包含一種βGlus-R848前藥，即免疫調(diào)節(jié)劑雷西喹莫（R848）通過活性氧（ROS）響應(yīng)的硫縮醛連接子與βGlus結(jié)合。該納米平臺通過重新編程腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（MΦ）從免疫抑制的M2表型轉(zhuǎn)變?yōu)榭鼓[瘤的M1表型，有效對抗免疫抑制的TME。βGlus通過與腸道微褶細(xì)胞（M細(xì)胞）及多種免疫細(xì)胞上的Dectin-1受體結(jié)合發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用，而R848則通過激活Toll樣受體7/8（TLR7/8）將腫瘤相關(guān)MΦ從M2表型重編程為M1表型，增強(qiáng)抗原呈遞和細(xì)胞毒性T細(xì)胞的招募與激活。此外，該平臺還結(jié)合了Ag2Te量子點(diǎn)（QDs）作為近紅外二區(qū)（NIR-II）成像探針，用于實(shí)時監(jiān)測小鼠模型中的腫瘤進(jìn)展和肝轉(zhuǎn)移。通過口服給藥后，納米顆粒通過與腸道Peyer斑中的Dectin-1受體結(jié)合進(jìn)入淋巴系統(tǒng)，隨后被表達(dá)Dectin-1的內(nèi)源性MΦ吞噬，并在腫瘤微環(huán)境中因ROS水平升高而釋放R848，重塑TME，同時通過Ag2Te QDs實(shí)現(xiàn)NIR-II成像。該文章于2025年7月21日以《Innate Immunity-Guided Macrophage-Homing Nanoplatform for Oral Tumor Immunotherapy and Real-Time Deep-Tissue Imaging in Pre-Clinical Models》為題發(fā)表于《Advanced Materials》（DOI：10.1002/adma.202507607）。

圖1 研究示意圖

（1）βGlus-R848前藥的合成與表征

通過將酵母來源的βGlus的羥基（–OH）與丁二酸酐反應(yīng)引入羧基（–COOH），制備了羧基化βGlus，并利用ROS響應(yīng)的硫縮醛連接子構(gòu)建了前藥。1H NMR譜圖顯示硫縮醛連接子的特征峰（1.52、2.47、2.73和12.21 ppm），分別對應(yīng)–C(CH?)?、–CH?、–S–CH?和–COOH基團(tuán)，質(zhì)譜檢測到m/z 251.041，與計算質(zhì)量252.050 Da一致，HPLC分析顯示純度大于98%。隨后，通過EDC和NHS在二氯甲烷溶液中將R848的氨基與硫縮醛連接子偶聯(lián)，生成R848-硫縮醛綴合物，1H NMR譜圖顯示新的信號（2.47–2.51和2.71–2.74 ppm），分別對應(yīng)–CH?和–S–CH?基團(tuán)，質(zhì)譜檢測到m/z 547.205，與計算質(zhì)量548.213 Da一致，HPLC分析顯示純度大于93%。最后，通過Steglich酯化反應(yīng)將R848-硫縮醛綴合物與羧基化βGlus連接，反應(yīng)后通過水溶液純化，F(xiàn)TIR譜圖（圖2a）顯示自由R848（3410和3689 cm?1）和βGlus（995和1724 cm?1）的特征峰，確認(rèn)成功偶聯(lián)。通過調(diào)整R848-硫縮醛/βGlus的重量比優(yōu)化偶聯(lián)效率（表1），當(dāng)比例為1.0:1.0時，R848的載藥量（LC）約為24%，載藥效率（LE）為59.9 ± 1.1%，更高的比例未顯著增加LC，反而降低了LE，因此1.0:1.0為最佳比例，后續(xù)研究均使用此比例的前藥。

（2）Ag2Te量子點(diǎn)的合成與表征

Ag2Te量子點(diǎn)（QDs）因優(yōu)異的光學(xué)性質(zhì)常被用作NIR-II熒光探針。本研究采用熱注入法合成Ag2Te QDs，通過高溫反應(yīng)使銀（Ag）和碲（Te）前驅(qū)體形成納米顆粒。透射電子顯微鏡（TEM，圖2b）顯示，合成的QDs呈單分散球形，平均直徑為2.3 ± 0.4 nm。其超小尺寸（<5–6 nm）有利于體內(nèi)經(jīng)腎臟濾過和/或膽道清除，可通過尿液和糞便排泄。高分辨率TEM（HRTEM，圖2c）確認(rèn)了其單晶特性，顯示出清晰的晶格條紋，間距為0.23 nm，對應(yīng)Ag2Te的（?132）晶面。能量色散X射線光譜驗(yàn)證了Ag和Te的存在，確認(rèn)了合成成功。X射線衍射（XRD，圖2d）顯示與單斜相Ag2Te匹配的峰，因納米晶尺寸而展寬。光學(xué)特性表征（圖2e）顯示其吸收峰延伸至NIR區(qū)域，熒光發(fā)射峰位于約1500 nm。

圖2 βGlus-R848/Ag2Te NPs的體外表征。（a）R848、βGlus、βGlus-R848前藥、Ag2Te QDs及βGlus-R848/Ag2Te NPs的FTIR譜圖；（b）Ag2Te QDs的TEM圖像；（c）Ag2Te QDs的HRTEM圖像；（d）Ag2Te QDs的XRD圖譜與模擬Ag2Te數(shù)據(jù)對比；（e）Ag2Te QDs在正己烷中的吸收和熒光光譜；（f）βGlus-R848/Ag2Te NPs的TEM圖像；（g）βGlus-R848/Ag2Te NPs在SGF或SIF中孵育前后的粒徑和zeta電位（DLS測量）；（h）βGlus-R848/Ag2Te NPs在SGF或SIF中孵育前后的NIR-II熒光圖像及相應(yīng)強(qiáng)度值；（i）βGlus-R848/Ag2Te NPs在0、50和100 μM H?O?中孵育后R848的釋放曲線，以及孵育結(jié)束時Ag2Te QDs的總累積釋放量。n.s.：無顯著差異（P > 0.05）；*：P < 0.05；**：P < 0.01

（3）βGlus-R848/Ag2Te NPs的制備與表征

優(yōu)化后的βGlus-R848前藥與Ag2Te量子點(diǎn)混合后超聲并透析，形成βGlus-R848/Ag2Te NPs，最終選擇1.0:0.5的比例用于后續(xù)研究。TEM（圖2f）顯示NPs呈近球形，EDS確認(rèn)元素均勻分布。DLS測得粒徑為175.2 ± 3.8 nm，zeta電位為?19.2 ± 1.2 mV。FTIR（圖2a）確認(rèn)成功包載，R848和Ag2Te量子點(diǎn)的載藥量分別為10.5 ± 2.9%和17.3 ± 1.9%。在SGF和SIF中37℃孵育后，NPs的粒徑和zeta電位無顯著變化（圖2g），熒光強(qiáng)度穩(wěn)定（圖2h），表明其在胃腸條件下穩(wěn)定。HPLC分析顯示，NPs在高H?O?條件下R848釋放顯著增加（圖2i），NaOCl誘導(dǎo)的釋放量高于H?O?。ICP-MS分析表明Ag2Te量子點(diǎn)釋放依賴于ROS水平（圖2i），NPs具有雙重ROS響應(yīng)性釋放行為。

（4）βGlus-R848/Ag2Te NPs在巨噬細(xì)胞中的細(xì)胞毒性

本研究利用巨噬細(xì)胞（MΦ）作為βGlus-R848/Ag2Te NPs的移動載體，依靠其天然免疫功能靶向腫瘤。使用RAW264.7細(xì)胞評估βGlus-R848/Ag2Te NPs及其組分（R848、Ag2Te量子點(diǎn)）的細(xì)胞毒性。如圖3a所示，用濃度高達(dá)200 μg/mL的NPs或等量的游離R848或Ag2Te量子點(diǎn)處理的細(xì)胞，存活率均大于90%，表明毒性極低。因此，后續(xù)細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)均采用200 μg/mL的NPs及其組分濃度。

（5）巨噬細(xì)胞對βGlus-R848/Ag2Te NPs的攝取

RAW264.7巨噬細(xì)胞與Alexa Fluor 633標(biāo)記的βGlus-R848/Ag2Te NPs共孵育，CLSM分析顯示，NPs被快速攝取，4小時后達(dá)到平臺期（圖3b、c）。用Dectin-1受體抑制劑laminarin預(yù)處理細(xì)胞顯著降低NPs攝取，表明Dectin-1受體在介導(dǎo)NPs攝取中起關(guān)鍵作用。巨噬細(xì)胞攝取NPs后，細(xì)胞內(nèi)ROS水平在6小時內(nèi)相對穩(wěn)定，9小時達(dá)到峰值（圖3d）。體內(nèi)分布結(jié)果顯示，口服給藥后，NPs在TME中于6小時達(dá)到平臺期（圖4c、圖5d、e）。TME中升高的ROS水平可能切割NPs中的ROS響應(yīng)性連接子，觸發(fā)R848在巨噬細(xì)胞內(nèi)的釋放（圖2i）。釋放后的R848可激活免疫途徑，如TLR7/8，這些受體主要位于巨噬細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中。R848可將M2型腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞重編程為M1表型，增強(qiáng)其抗腫瘤能力。

圖3 βGlus-R848/Ag2Te NPs的細(xì)胞表征及NIR-II成像能力。（a）R848、Ag2Te量子點(diǎn)和βGlus-R848/Ag2Te NPs在RAW264.7細(xì)胞中的細(xì)胞毒性分析；（b）CLSM圖像及（c）對應(yīng)的平均熒光強(qiáng)度顯示RAW264.7細(xì)胞對βGlus-R848/Ag2Te NPs的內(nèi)吞攝取隨時間變化，分別在有無Dectin-1受體抑制劑laminarin預(yù)處理的情況下。βGlus-R848/Ag2Te NPs用Alexa Fluor 633標(biāo)記（紅色），溶酶體用LysoTracker（綠色）標(biāo)記，細(xì)胞核用Hoechst 33342（藍(lán)色）染色。（d）RAW264.7細(xì)胞經(jīng)βGlus-R848/Ag2Te NPs處理后隨時間變化的ROS水平；（e）流式細(xì)胞術(shù)分析M2型巨噬細(xì)胞經(jīng)βGlus、R848、Ag2Te量子點(diǎn)或βGlus-R848/Ag2Te NPs處理后CD86和CD206標(biāo)志物的表達(dá)水平；（f）免疫熒光染色的α-SMA在qPSCs、aPSCs及經(jīng)βGlus、R848、Ag2Te量子點(diǎn)或βGlus-R848/Ag2Te NPs處理的aPSCs中的定量分析；（g）用不同厚度的雞組織覆蓋含βGlus-R848/Ag2Te NPs的試管進(jìn)行深度依賴成像，比較IVIS和NIR-II成像及（h）對應(yīng)的信背比（SBR）。n.s.：無顯著差異（P > 0.05）；*：P < 0.05；**：P < 0.01；***：P < 0.001

圖4 βGlus-R848/Ag2Te NPs的口服吸收途徑及體內(nèi)分布。（a）CLSM圖像展示βGlus-R848/Ag2Te NPs的吸收途徑，包括其與Peyer斑中M細(xì)胞的結(jié)合及隨后被內(nèi)源性巨噬細(xì)胞攝??；（b）口服給藥后血漿中R848濃度隨時間變化；（c）R848在胰腺腫瘤組織中隨時間積累；（d）給藥后6小時R848在主要器官中的分布。n.s.：無顯著差異（P > 0.05）；*：P < 0.05；**：P < 0.01

圖5 βGlus-R848/Ag2Te NPs的腫瘤靶向和NIR-II成像能力。（a）在早期和晚期原位PDAC小鼠模型中評估βGlus-R848/Ag2Te NPs腫瘤靶向的實(shí)驗(yàn)時間線；（b）口服給藥后6小時從多個解剖角度進(jìn)行NIR-II成像，突出顯示在原發(fā)PDAC和肝轉(zhuǎn)移中的積累；（c）離體成像確認(rèn)βGlus-R848/Ag2Te NPs在胰腺腫瘤和肝轉(zhuǎn)移中的積累；（d）給藥后3、6、9和24小時的時間序列NIR-II成像及（e）對應(yīng)的熒光強(qiáng)度，顯示在6小時達(dá)到熒光峰值。S：胃；I：腸；P：胰腺；L：肝臟。n.s.：無顯著差異（P > 0.05）；*：P < 0.05；**：P < 0.01

（6）體外免疫調(diào)節(jié)活性

IL-4誘導(dǎo)RAW264.7巨噬細(xì)胞極化為M2表型。經(jīng)βGlus-R848/Ag2Te NPs及其組分處理后，流式細(xì)胞術(shù)（圖3e）顯示，單獨(dú)使用Ag2Te量子點(diǎn)無顯著影響；而游離βGlus、游離R848或βGlus-R848/Ag2Te NPs處理顯著增加CD86?（M1）細(xì)胞比例，降低CD206?（M2）細(xì)胞百分比，提高M(jìn)1/M2比值。R848-硫縮醛綴合物的M1/M2比值低于游離R848，不可降解對照組低于ROS響應(yīng)性NPs，表明硫縮醛連接子降解對釋放活性R848及激活TLR7/8至關(guān)重要。βGlus-R848/Ag2Te NPs的免疫調(diào)節(jié)效果優(yōu)于游離βGlus或R848，顯示出協(xié)同作用，且提高了R848的溶解性、穩(wěn)定性和生物利用度，突出了其治療潛力。

（7）體外抗纖維化活性

胰腺星狀細(xì)胞（PSCs）在激活后通過過度沉積細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）調(diào)節(jié)PDAC纖維化腫瘤微環(huán)境，TGF-β1可驅(qū)動其分化為增強(qiáng)纖維化的肌成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞。為評估體外抗纖維化效果，用TGF-β1激活小鼠PSCs 24小時（aPSCs），再分別用游離βGlus、R848、Ag2Te量子點(diǎn)或βGlus-R848/Ag2Te NPs處理24小時，以靜止PSCs（qPSCs）和未處理的aPSCs作為對照。共聚焦激光掃描顯微鏡（CLSM）顯示，TGF-β1顯著上調(diào)了aPSCs中α-SMA的表達(dá)，表明PDAC基質(zhì)中肌成纖維細(xì)胞的分化和ECM沉積增加（圖3f）。單獨(dú)使用Ag2Te量子點(diǎn)對α-SMA無影響，而βGlus、R848和βGlus-R848/Ag2Te NPs均降低了α-SMA的表達(dá)，其中NPs的降低效果最為顯著，顯示出協(xié)同抗纖維化活性。這些結(jié)果表明，βGlus-R848/Ag2Te NPs可通過降低基質(zhì)密度有效減輕PDAC纖維化，緩解纖維化屏障后，這些NPs可能增強(qiáng)藥物滲透和免疫細(xì)胞浸潤到腫瘤微環(huán)境中，為PDAC治療提供了一種有前景的策略。

（8）βGlus-R848/Ag2Te NPs的體外NIR-II成像能力

體外實(shí)驗(yàn)比較了βGlus-R848/Ag2Te NPs的NIR-II成像性能與IVIS成像。實(shí)驗(yàn)中，毛細(xì)管（內(nèi)徑0.4 mm）裝有f-βGlus-R848/Ag2Te NPs（用于IVIS）或未標(biāo)記的βGlus-R848/Ag2Te NPs（用于NIR-II），置于不同厚度的雞胸組織下。IVIS成像采用640 nm激發(fā)和700 nm發(fā)射，NIR-II成像采用798 nm激發(fā)和1300 nm長通濾波器，圖像分析使用ImageJ軟件。

如圖3g所示，2 mm深度時，IVIS和NIR-II均能成功成像；4 mm時，IVIS失真，NIR-II清晰；6 mm時，IVIS無法區(qū)分信號，NIR-II仍清晰；8 mm時，IVIS無法檢測信號，NIR-II仍能識別樣本管。NIR-II成像在組織穿透和抗背景干擾方面優(yōu)于IVIS，能在6 mm深度清晰成像，而IVIS在超過2 mm時可靠性降低。NIR-II成像在所有測試深度上均優(yōu)于IVIS，信背比（SBR）更高，圖像更清晰（圖3h）。βGlus-R848/Ag2Te NPs表現(xiàn)出強(qiáng)大的NIR-II成像性能，可實(shí)現(xiàn)PDAC腫瘤生長、肝轉(zhuǎn)移及治療反應(yīng)的深部組織可視化，提高了成像質(zhì)量和數(shù)據(jù)可靠性。

（9）口服βGlus-R848/Ag2Te NPs的吸收途徑

在FVB小鼠模型中，通過將AK4.4細(xì)胞注入胰腺建立原位PDAC腫瘤，評估了口服βGlus-R848/Ag2Te NPs的體內(nèi)腫瘤靶向能力。實(shí)驗(yàn)小鼠口服f-βGlus-R848/Ag2Te NPs分散液后，如圖4a所示，大量NPs（綠色）選擇性靶向Peyer斑中的M細(xì)胞（紅色），可能通過NPs上的βGlus與M細(xì)胞上的Dectin-1受體相互作用。NPs與M細(xì)胞結(jié)合后穿過IEB，被下方巨噬細(xì)胞（紅色）吞噬，隨后βGlus-R848/Ag2Te@MΦ通過淋巴管進(jìn)入腸淋巴系統(tǒng)并到達(dá)全身循環(huán)。為評估其吸收是否依賴腸淋巴運(yùn)輸，實(shí)驗(yàn)小鼠在口服f-βGlus-R848/Ag2Te NPs前預(yù)先用環(huán)己酰亞胺（一種選擇性抑制淋巴運(yùn)輸?shù)幕衔铮┨幚?。預(yù)處理顯著降低了Peyer斑中M細(xì)胞及其下方巨噬細(xì)胞的NPs熒光，表明其吸收依賴淋巴運(yùn)輸。這些結(jié)果表明βGlus-R848/Ag2Te NPs能夠靶向M細(xì)胞，成功穿過IEB，并在腸淋巴系統(tǒng)中被內(nèi)源性巨噬細(xì)胞吞噬。

（10）通過βGlus-R848/Ag2Te@MΦ靶向遞送和腫瘤滯留R848

利用HPLC分析了口服給藥后βGlus-R848/Ag2Te NPs在PDAC荷瘤小鼠體內(nèi)的R848血漿濃度-時間曲線。如圖4b所示，口服后血漿中未檢測到R848，表明由巨噬細(xì)胞攜帶的NPs在全身循環(huán)中有效保護(hù)了藥物。由于血液中的ROS水平顯著低于腫瘤局部區(qū)域，因此βGlus-R848/Ag2Te NPs@MΦ中的ROS響應(yīng)性硫縮醛連接子在運(yùn)輸過程中保持穩(wěn)定，防止藥物過早釋放。這種穩(wěn)定性確保了精準(zhǔn)的腫瘤靶向，使得腫瘤部位的高ROS濃度能夠觸發(fā)NPs中藥物的可控釋放。口服給藥后，監(jiān)測了R848在PDAC腫瘤中的滯留情況。在2、4、6、8、24和48小時測量濃度，結(jié)果顯示R848在6小時達(dá)到峰值（圖4c）。此時評估了R848在主要器官中的分布（圖4d），發(fā)現(xiàn)其在PDAC腫瘤中積累最高。這些結(jié)果表明βGlus-R848/Ag2Te@MΦ能夠高效地將R848選擇性遞送并滯留在腫瘤部位，突出了由內(nèi)源性巨噬細(xì)胞攜帶的βGlus-R848/Ag2Te NPs的腫瘤靶向潛力，這可能是由先天免疫信號引導(dǎo)的。

（11）βGlus-R848/Ag2Te@MΦ的腫瘤靶向能力的NIR-II成像評估

在早期和晚期PDAC小鼠模型中，通過NIR-II成像評估了βGlus-R848/Ag2Te@MΦ的腫瘤靶向能力（圖5a）。早期PDAC通過注射1×10? AK4.4細(xì)胞誘導(dǎo)，7天后形成原位腫瘤且無轉(zhuǎn)移；晚期PDAC通過注射2×10? AK4.4細(xì)胞建立，10天后出現(xiàn)肝轉(zhuǎn)移?？诜o藥后6小時進(jìn)行多角度NIR-II成像。如圖5b所示，背面視圖可部分顯示原發(fā)PDAC（6.3 mm），但無法檢測到肝轉(zhuǎn)移（9.3 mm）。右側(cè)視圖可檢測到晚期PDAC中深度約5.6 mm的肝轉(zhuǎn)移，但視角有限；左側(cè)視圖可清晰顯示早期和晚期PDAC中深度較淺（4.5 mm）的原發(fā)腫瘤。腹面視圖在晚期疾病中對深度約4.3 mm的肝轉(zhuǎn)移檢測對比度強(qiáng)。這些結(jié)果表明βGlus-R848/Ag2Te@MΦ能夠選擇性地可視化原發(fā)和轉(zhuǎn)移部位。健康小鼠的胰腺或肝臟未出現(xiàn)熒光，證實(shí)了其離靶積累可忽略不計。離體成像（圖5c）證實(shí)健康對照組的胰腺或肝臟無熒光，表明離靶積累極少。在PDAC荷瘤小鼠中，早期腫瘤在胰腺有顯著攝取，晚期疾病在胰腺腫瘤和肝轉(zhuǎn)移中熒光顯著增加。

為確認(rèn)腫瘤靶向依賴于βGlus而非F-127涂層，早期PDAC小鼠接受了F-127涂層的Ag2Te量子點(diǎn)處理，并在給藥后6小時進(jìn)行成像。無論是體內(nèi)還是離體成像，胰腺病變中均未檢測到熒光；相反，量子點(diǎn)主要定位于胃和腸道，肝臟僅有微弱信號。這一對照實(shí)驗(yàn)證實(shí)了F-127單獨(dú)不能介導(dǎo)腫瘤靶向，突出了βGlus在驅(qū)動腸道M細(xì)胞選擇性攝取和隨后腫瘤積累中的關(guān)鍵作用。

為了解βGlus-R848/Ag2Te NPs的時間分布，在給藥前及給藥后3、6、9和24小時進(jìn)行NIR-II成像。成像結(jié)果顯示，Ag2Te量子點(diǎn)的熒光強(qiáng)度在原發(fā)PDAC腫瘤和轉(zhuǎn)移性肝部位于給藥后6小時達(dá)到峰值（圖5d、e），與PDAC腫瘤中檢測到的NPs攜帶的R848最高濃度相吻合（圖4c）。這些結(jié)果表明，口服給藥后6小時是利用NIR-II成像評估早期和晚期PDAC治療效果的最佳時間窗口。

（12）口服βGlus-R848/Ag2Te NPs的劑量依賴性效應(yīng)

早期原位PDAC小鼠模型中，小鼠接受單劑量（第7天）、雙劑量（第7天和第9天）和三劑量（第7天、第9天和第11天）的口服βGlus-R848/Ag2Te NPs治療（圖6a）。到第21天，腫瘤重量減少顯示出劑量依賴性，三劑量組抑制效果最顯著（圖6b），所有劑量組小鼠體重保持穩(wěn)定（圖6c）?；诖?，選擇三劑量方案進(jìn)一步研究其在早期和晚期PDAC模型中的抗腫瘤效果，對照組包括未處理小鼠及接受游離βGlus或游離R848治療的小鼠。

早期PDAC模型中，小鼠在腫瘤接種后第7天、第9天和第11天接受三次口服βGlus-R848/Ag2Te NPs（圖6a）。游離βGlus或游離R848處理僅表現(xiàn)出有限的腫瘤生長抑制（圖6d、e），而βGlus-R848/Ag2Te NPs顯著優(yōu)于所有對照處理，各組小鼠體重?zé)o明顯變化（圖6f）。這些結(jié)果突出了βGlus功能化NPs的優(yōu)越抗腫瘤效果，其被巨噬細(xì)胞優(yōu)先攝?。▓D4a），作為高效的細(xì)胞載體，βGlus-R848/Ag2Te@MΦ在先天免疫信號引導(dǎo)下選擇性地在腫瘤部位積累，顯示出調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境的潛力。

流式細(xì)胞術(shù)分析顯示，游離βGlus或游離R848處理使TME中的巨噬細(xì)胞極化發(fā)生部分轉(zhuǎn)變（圖6g），而βGlus-R848/Ag2Te NPs表現(xiàn)出協(xié)同效應(yīng)，使M1樣巨噬細(xì)胞比例最高，M2樣巨噬細(xì)胞比例最低，M1/M2比值最大。這些結(jié)果表明βGlus-R848/Ag2Te@MΦ在將腫瘤相關(guān)M2樣巨噬細(xì)胞重編程為抗腫瘤M1樣表型方面具有強(qiáng)大的免疫調(diào)節(jié)能力，從而將TME從免疫抑制狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)槊庖呒せ顮顟B(tài)，抑制腫瘤生長和轉(zhuǎn)移。

通過α-SMA免疫組化染色和Masson三色染色分別評估CAFs活性和膠原蛋白沉積。如圖6h所示，βGlus-R848/Ag2Te NPs處理顯著降低了α-SMA表達(dá)，表明抑制了CAFs的激活和增殖，同時膠原蛋白沉積顯著減少，反映了基質(zhì)重塑。βGlus-R848/Ag2Te NPs治療促進(jìn)了CD3? T細(xì)胞的浸潤和顆粒酶B的分泌，增加了腫瘤細(xì)胞凋亡，經(jīng)TUNEL實(shí)驗(yàn)確認(rèn)。此外，F(xiàn)OXP3和Gr-1免疫染色顯示，治療后TME中調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Tregs）和髓系來源的抑制細(xì)胞（MDSCs）顯著減少。這些結(jié)果突出了βGlus-R848/Ag2Te@MΦ納米平臺的治療潛力，其不僅激活了具有抗腫瘤活性的免疫細(xì)胞（如巨噬細(xì)胞和T細(xì)胞），還減少了關(guān)鍵的免疫抑制細(xì)胞群體。通過同時靶向纖維化基質(zhì)和免疫抑制的TME，該平臺有效緩解了免疫抑制，增強(qiáng)了抗腫瘤免疫，從而提高了整體治療效果。

圖6 早期PDAC模型中βGlus-R848/Ag2Te NPs的抗腫瘤效果及腫瘤微環(huán)境調(diào)節(jié)。（a）建立早期和晚期PDAC模型及相應(yīng)治療時間線；（b）不同劑量治療后小鼠腫瘤重量；（c）治療后小鼠體重變化；（d）不同治療組腫瘤重量；（e）不同治療組腫瘤照片；（f）不同治療方案后小鼠體重變化；（g）治療后腫瘤組織中CD86和CD206標(biāo)志物的表達(dá)水平；（h）腫瘤組織的組織學(xué)分析，包括α-SMA、Masson三色、CD3、顆粒酶B、TUNEL、FOXP3和Gr-1染色。n.s.：無顯著差異（P > 0.05）；*：P < 0.05；**：P < 0.01；***：P < 0.001

（13）晚期PDAC模型中βGlus-R848/Ag2Te NPs的治療效果

在晚期PDAC模型中，小鼠在腫瘤接種后第10天、第12天和第14天接受三次口服βGlus-R848/Ag2Te NPs（圖6a）。與對照組相比，該治療顯著抑制了原發(fā)腫瘤的生長（圖7a、b），并顯著減少了肝轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)的數(shù)量（圖7c），小鼠體重?zé)o顯著變化（圖7d）。通過流式細(xì)胞術(shù)分析評估βGlus-R848/Ag2Te NPs是否能夠通過巨噬細(xì)胞靶向遞送重編程原發(fā)腫瘤微環(huán)境中的巨噬細(xì)胞極化。結(jié)果顯示，治療組的巨噬細(xì)胞表現(xiàn)出明顯的免疫激活表型，M1樣巨噬細(xì)胞增加，M2樣巨噬細(xì)胞減少，M1/M2比值在所有組中最高（圖7e）。這些結(jié)果突出了βGlus-R848/Ag2Te NPs通過巨噬細(xì)胞靶向免疫調(diào)節(jié)抑制腫瘤進(jìn)展和預(yù)防轉(zhuǎn)移的治療潛力。

圖7 晚期PDAC模型中βGlus-R848/Ag2Te NPs的抗腫瘤效果及腫瘤微環(huán)境調(diào)節(jié)。（a）原發(fā)腫瘤重量；（b）不同治療組腫瘤照片；（c）治療后觀察到的肝轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)量；（d）治療后實(shí)驗(yàn)小鼠體重變化；（e）治療后原發(fā)腫瘤組織中CD86和CD206標(biāo)志物的表達(dá)水平。n.s.：無顯著差異（P > 0.05）；*：P < 0.05；**：P < 0.01；***：P < 0.001

（14）2.15 NIR-II成像用于實(shí)時監(jiān)測治療進(jìn)展

小鼠在βGlus-R848/Ag2Te NPs治療的不同階段接受NIR-II成像。成像時間點(diǎn)包括首次給藥后6小時（圖5d、e）、第三次給藥后6小時以及第三次給藥后10天（圖6a）。實(shí)驗(yàn)小鼠左側(cè)成像顯示，經(jīng)βGlus-R848/Ag2Te NPs治療后，原發(fā)腫瘤的熒光強(qiáng)度發(fā)生變化。健康對照小鼠未檢測到熒光，確認(rèn)正常胰腺組織中無NPs積累（圖8a）。早期和晚期PDAC小鼠的熒光強(qiáng)度逐漸下降，與治療后腫瘤消退一致（圖6d和圖7a），這可能歸因于先天免疫引導(dǎo)的巨噬細(xì)胞靶向介導(dǎo)的NPs積累減少。圖8b展示了腹側(cè)成像以評估治療后肝轉(zhuǎn)移的進(jìn)展。健康和早期PDAC小鼠未檢測到熒光，表明肝臟中無βGlus-R848/Ag2Te@MΦ積累且無轉(zhuǎn)移。晚期PDAC小鼠肝臟內(nèi)的熒光強(qiáng)度逐漸下降，手術(shù)暴露肝臟的大體解剖照片（圖S17）確認(rèn)了熒光的解剖來源，表明治療干預(yù)抑制了腫瘤轉(zhuǎn)移。這些成像結(jié)果表明，βGlus-R848/Ag2Te NPs不僅具有治療效果，還作為有效的成像劑，能夠?qū)崟r可視化深部組織PDAC進(jìn)展和肝轉(zhuǎn)移。這種口服給藥的腫瘤靶向系統(tǒng)結(jié)合了治療活性與成像能力，成為PDAC治療的有前景的治療診斷納米平臺。

圖8 NIR-II成像實(shí)時監(jiān)測治療進(jìn)展。（a）左側(cè)成像顯示βGlus-R848/Ag2Te NPs在原發(fā)腫瘤中的積累及治療后腫瘤消退，熒光強(qiáng)度發(fā)生變化；（b）腹側(cè)成像揭示肝轉(zhuǎn)移中NPs的存在減少，表明治療抑制了腫瘤擴(kuò)散，熒光強(qiáng)度相應(yīng)變化。S：胃；I：腸；P：胰腺；L：肝臟。n.s.：無顯著差異（P > 0.05）；*：P < 0.05；**：P < 0.01