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針對上述問題，中南大學開天瀚、丁平團隊合作開發(fā)了一種可響應ROS、pH、近紅外(NIR)與電刺激(ES)四種信號的導電水凝膠（HEPP）：以透明質酸（HA）-苯硼酸（PBA）-聚賴氨酸-咖啡酸為骨架，負載Ti/Pt–Pd雙金屬納米酶與葡萄糖氧化酶(PTPPG)。當感染創(chuàng)面pH下降時，PTPPG啟動級聯(lián)酶反應（POD、OXD、GOx）產生活性氧并與溫和光熱/光動力效應協(xié)同殺菌并耗竭局部葡萄糖、緩解缺氧；NIR照射與ES聯(lián)合促進血管新生并引導巨噬細胞由 M1 向 M2 極化；當創(chuàng)面ROS過量時，咖啡酸多酚基團即時清除活性氧，防止二次損傷。該水凝膠集抗菌、供氧、ROS 調控、抗炎及電刺激于一體，可為糖尿病慢性創(chuàng)面的精準管理提供新策略。該文章于2025年5月8日以《An Intelligent and Conductive Hydrogel with Multiresponsive and ROS Scavenging Properties for Infection Prevention and Anti-Inflammatory Treatment Assisted by Electrical Stimulation for Diabetic Wound》為題發(fā)表于《AdvancedS Science》上（DOI：10.1002/advs.202500696）。

研究示意圖

（1）PTPPG納米顆粒的合成與表征

如圖2A所示，首先先以溶劑熱法將Ti摻入PCN-224得PCN-224(Ti)，再原位沉積Pt–Pd，最后經表面吸附GOx形成PTPPG，使其兼具GOx、POD、CAT、OXD活性。圖2B~C PTPPG的SEM及TEM圖顯示PTPPG呈直徑約為100 nm球形的結構。圖2D的EDS形貌表征提示C、N、O、Zr、Ti、Pt、Pd在PTPPG表面均勻分布。圖2E中Zeta電位負移證實GOx吸附且表面電荷穩(wěn)定。圖2F-K中各組分精細峰的變化及XRD中特征峰的出現進一步證明了PTPPG的成功制備。圖2L顯示，PTPPG在0-100℃范圍下具有良好的熱穩(wěn)定性。

圖1. PTPPG納米顆粒的合成與表征。A) PTPPG合成流程示意圖；B) PTPPG的SEM圖；C) PTPPG的TEM圖；D) PTPPG的EDS形貌與元素分布；E) PCN-224、PCN-224(Ti)、PTPP及PTPPG的Zeta電位；F) PTPPG的XPS全譜；G) Zr 3d；H) Ti 2p；I) Pt 4f；J)Pd 3d的高分辨圖譜；K) PCN-224、PCN-224(Ti)和PTPPG的XRD圖譜；L) PTPPG的熱重曲線

（2）PTPPG的多酶活性及光響應性

為了在體外評估PTPPG的多種酶活性，如GOx、CAT、POD、OXD和光響應性等（圖2A）。首先，在酸性條件下，以TMB為底物驗證了PTPPG的POD與OXD活性（圖2B）。接著利用葡萄糖作為底物，在pH 4（酸性）及pH 7.4（中性）條件下評估了其催化葡萄糖氧化的能力，結果顯示PTPPG確有良好的葡萄糖氧化能力（圖2C-D）。然后借助KMnO?檢測反應體系，實驗觀察到PTPPG作用后KMnO?吸光度明顯下降，證明H?O?已被有效生成（圖2E）。該吸光度的衰減在酸性條件下尤為顯著，提示PTPPG具有高效的GOx活性。最后，以Ru(ddp)（三(4,7-二苯基-1,10-菲咯啉)釕(II)二氯化物）為氧敏熒光指示劑驗證了CAT活性，由結果可知，PTPPG與H?O?共存時，Ru(ddp)熒光被顯著猝滅，提示H?O?被分解并釋放氧氣（圖2F-G），而這也有助于緩解傷口缺氧狀態(tài)。為評估 PTPPG 的光動力性能，采用了單線態(tài)氧傳感器綠色（SOSG）熒光探針，結果顯示，在 660 nm 激光照射下，單線態(tài)氧（1O?）的產量表現出對激光功率密度和 PTPPG 濃度的依賴性，即隨二者增加而上升（圖2H）。另外利用EPR（電子順磁共振光譜）分析進一步確認在反應過程中羥基自由基（?OH）、單線態(tài)氧（1O?）和超氧陰離子自由基（?O??）的產生（圖2I-J）。此外，PTPPG 還展現出一定的光熱性能。在808 nm 近紅外激光輻照下，其表現出明顯的光熱效應，溶液溫度的升高與PTPPG濃度和激光功率呈正相關（圖2K-M）。實驗測得其光熱轉換效率可達30.1%（圖2O-P）。值得注意的是，在多次加熱-冷卻循環(huán)中，PTPPG仍能保持了良好的光熱穩(wěn)定性（圖 3N-P）。

圖2. PTPPG的多酶活性及光響應性表征。A) PTPPG多重酶活及光響應示意圖；B) PTPPG與H?O?及TMB共孵育驗證氧化酶/過氧化物酶活性；C)以TMB/OPD為底物分別測定pH 4及D）pH7.4下PTPPG的葡萄糖氧化酶活性；E) KMnO?驗證葡萄糖氧化反應產H?O?；F) PCN-224、PCN-224(Ti)、PTPP及PTPPG的Zeta電位；F) Ru(ddp)驗證PTPPG催化H?O?產氧；G）Ru(ddp)實時監(jiān)測PTPPG在H?O?或Glu存在下的氧氣生成；H）SOSG探針檢測PTPPG光動力產1O?；I）EPR捕獲?OH、1O?、?O??自由基；J）660 nm激光照射前后的EPR對比；K）808 nm激光照射下不同濃度PTPPG紅外熱成像；L）不同PTPPG濃度下的升溫曲線；M）不同功率下的升溫曲線；N）808 nm激光（0.9 W）下，五次循環(huán)加熱/冷卻穩(wěn)定性；O）100 μg mL?1 PTPPG在808 nm（0.9 W）照射及關閉后的溫度變化；P）?ln(θ)與時間線性擬合求光熱轉換效率

（3）HEPP的合成與表征

如圖3A所示，水凝膠HEPP由動態(tài)席夫堿鍵、硼酸酯鍵及PDA@PPY構建，前體OHA-PBA通過OHA與3-NH?-PBA反應獲得。圖3（B-E）中各物質核磁特征峰及紅外吸收峰的變化證實OHA-PBA及EC成功合成。圖3（F-I）的SEM顯示HE呈三維網絡，而HEPP因PDA@PPY與PTPPG摻雜表面會更加粗糙。圖3（J-K）結果顯示在進行吸水實驗時，HE及HEPP在快速吸液（前30 min）后趨于平衡，其中HEPP吸水略低于HE，但在干燥后保水相近。圖3(L-N)結果分析可知，PTPPG在低pH、高H?O?及高葡萄糖條件下釋放加速，而這主要歸因于于希夫堿鍵在酸性環(huán)境中的質子化以及ROS的增加。圖3O顯示HEPP的壓縮模量是HE的2.4倍，提示PDA@PPY和PTPPG的摻入增強了水凝膠的交聯(lián)點，而這也在一定程度上為水凝膠提供一定的機械彈性和適應性。圖3P顯示HEPP在約85%應變時出現了凝膠點。圖3Q顯示在0.1–10 Hz的頻率條件下下，HEPP和HE的儲能模量（G′）始終高于損耗模量（G″），提示其具有良好的彈性，且HEPP的儲存模量（G′）明顯高于HE的，提示其具有良好的機械性能。圖3R顯示大應變條件下（250%），水凝膠的交聯(lián)網絡結構可被破壞，但在應變恢復到1%時，其G′和G″能迅速恢復到初始狀態(tài)，提示水凝膠具有優(yōu)異的自愈合能力。另外，由圖3(S-T)可知，HEPP在體外對DPPH和ABTS自由基的清除率均達90%，提示其具有良好的抗氧化能力。該研究制備的HEPP整合了光/電/pH/ROS響應，具智能敷料應用前景。

圖3. HEPP的合成與表征。A) HEPP合成流程示意圖；B) OHA-PBA及C) EC的1H NMR譜；D) OHA-PBA及E) EC的FT-IR光譜； F- I) 不同放大倍數下HE和HEPP的SEM圖像；J) HEPP和HE的吸水曲線；K) HEPP和HE的保水曲線；L) PTPPG在不同pH值、M) H2O2及N) Glu濃度下的釋放速率；O) HE與HEPP的粘接強度；P) HE和HEPP在0.1 Hz頻率下的應變響應流變行為分析。Q) 1%應變條件下HE和HEPP的頻率響應流變特性；R)在低（1%）和高（250%）應變下對GHM水凝膠的應變試驗；S) HEPP對DPPH 及T) ABTS的清除作用

（4）HEPP的體外抗菌活性

糖尿病患者的傷口更容易受到微生物感染，但巨噬細胞和中性粒細胞能夠通過產生高水平的活性氧（ROS）來清除入侵的微生物。感染部位局部酸度的降低（由細菌的存在所引發(fā)）會導致在不同pH水平上斷裂席夫堿鍵。釋放出的PTPPG有助于分解谷氨酸，隨后產生過氧化氫，并導致硼酸鍵的斷裂。這一過程促進了 PTPPG 在傷口部位的積累，從而促進了與糖尿病相關的傷口中ROS的自我級聯(lián)抗菌作用。圖4A展示了HEPP會通過光觸發(fā)而產生協(xié)同抗菌效果的作用機制，研究時選取革蘭氏陽性菌（金黃色葡萄球菌SA、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌MRSA）及革蘭氏陰性菌（銅綠假單胞菌PA、多重耐藥銅綠假單胞菌MDR-PA）作為代表性菌株進行評估。如圖4B所示，經660 nm激光照射處理的樣品組，其600 nm處吸光度較對照組顯著降低，對上述四種細菌的抗菌率均高于75%。如圖4C所示，在0.9 W下進行5 min的80 8nm激光照射后，細菌在600nm處的吸光度降低了約 93%。為了模擬由活性氧引發(fā)的傷口區(qū)域的抗菌反應，使用了 20 mM的Glu,隨著HEPP 在PTPPG中的負載量增加，600 nm處OD值呈濃度依賴性下降。因此，圖4D通過比較600 nm處的細菌存活率，驗證了納米酶在傷口部位自我級聯(lián)抗菌活性的可能性。此外，圖4E使用細菌活/死熒光染色來檢測HEPP的綜合光動力、光熱和化學動力學抗菌特性。而通過圖4F細菌菌落計數和定量熒光分析圖表明，這三種療法的組合顯示出了最為顯著的抗菌效果。如圖4G所示，掃描電子顯微鏡圖像顯示，接受光動力療法/光熱療法/光催化療法處理的耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）和多重耐藥肺炎鏈球菌（PDR-PA）的細菌出現了正常的細胞膜結構破壞以及破裂的跡象。綜合來看，這些發(fā)現表明HEPP具有顯著的抗菌特性，并在預防傷口處的細菌感染方面具有重要的應用潛力。

圖4. HEPP的體外抗菌活性。A)抗菌活性的多種機制的示意圖。B)用660 nm激光；C)808 nm激光及D）Glu處理或未處理5 min的革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌的OD 600 nm值；E）活/死染色細菌的熒光圖像及F）在用不同條件處理后，在PBS（pH 7.4）中的SA、MRSA、PA和PDR-PA的相應定量統(tǒng)計分析結果；G）使用HEPP進行不同處理的細菌的SEM圖像

（5）通過ES輔助的HEPP進行微環(huán)境和炎癥調節(jié)

為了評估PTPPG、HEP和HEPP的生物相容性，對水凝膠進行了劃痕測試，以評估其在體外促進成纖維細胞遷移的能力（圖5A）。圖5B顯示，在培養(yǎng)24 h后，相比于對照組（20.6%），PTPPG 組（26.7%）、HEP 組（28.0%）和 HEPP 組（46.0%）顯示出了優(yōu)異的劃痕愈合能力。在660 nm激光照射的條件下添加PTPPG會導致活性氧濃度顯著增加。然而，經過4 h的處理后，與對照組相比，細胞內的ROS水平顯著降低。此外，由圖5C流式細胞術分析結果可知，納米顆粒與光動力療法的級聯(lián)反應會導致RAW264.7 細胞中的ROS水平顯著升高。而水凝膠的孵育可顯著降低細胞中的ROS水平，這也有效避免了與ROS水平升高相關的潛在不良后果。如圖5D所示，研究采用電刺激（0–1000 mV，步進250 mV）處理 RAW264.,巨噬細胞以探究 HEPP 在調控炎癥微環(huán)境中的作用，由圖5（E-H）的結果分析可知，當細胞同時接受HEPP和電刺激處理時，其從M1型表型向M2型表型的轉變最為顯著，這也表現在CD86的表達降低，而CD206的表達增加。為了驗證 HEPP緩解傷口缺氧的能力，使用了細胞內缺氧指示劑Ru(dpp)來可視化人類臍靜脈內皮細胞（HUVEC）和NIH-3T3細胞的細胞氧合情況。如圖5（I-J）所示，HUVEC和NIH-3T3細胞在沒有材料處理的情況下均顯示出明顯的紅色熒光，表明在缺氧處理后細胞的氧合水平相對較低。而相比于實驗組，經過處理后細胞的熒光強度顯著降低，這表明細胞氧合水平提高，這也進一步體現了HEPP緩解傷口缺氧的能力。為了進一步深入了解ES對細胞因子誘導的巨噬細胞極化的作用機制，我們采用定量逆轉錄聚合酶鏈反應（q-PCR）來研究信使RNA（mRNA）表達的變化。結果表明，TNF-α和IL-6的表達呈協(xié)同降低，而 IL-10和轉化生長因子-β（TGF-β）的表達則呈協(xié)同升高，如圖5（K-N）所示。此外，用ES 和HEPP處理后，缺氧誘導因子（HIF-1α）的表達出現下調，這表明缺氧微環(huán)境得到了緩解（圖5O）。

圖5. 通過ES輔助的HEPP進行微環(huán)境和炎癥調節(jié)。A) HUVEC的劃痕顯微圖和B)不同處理后HUVEC遷移率的相應定量直方圖；C)不同處理條件下RAW264.7細胞DCFH-DA熒光的流式細胞術結果；D) ES處理巨噬細胞調節(jié)炎癥表型示意圖；E）不同處理條件下RAW264.7細胞CD86及F）CD206表達的免疫熒光染色；G）RAW264.7細胞中CD86及H）CD206相對熒光強度的測定；I）Ru（dpp）對NIH-3T3和HUVEC細胞經不同材料處理后溶解O₂的熒光圖像及J）相對熒光強度進行評價；K-O) qRT-PCR分析不同處理后RAW264.7細胞中TNF-α、IL-6、TGF-β、IL-10和HIF-1α對應的mRNA表達

（6）使用HEPP對ES輔助炎癥調節(jié)的RNA測序分析

為了探究HEPP和ES在調節(jié)炎癥過程中的作用，研究進行了RNA測序分析。實驗對接受HEPP治療、ES治療以及兩者聯(lián)合治療的各組RAW264.7細胞進行了分析，實驗比較了M1極化（M1組）、ES組以及HEPP+ES的RAW264.7細胞的轉錄組差異。圖6A結果表明，M1、ES和HEPP+ES組共同顯示出 4238個差異表達基因。此外，ES組存在560個特異性差異表達基因，而HEPP+ES 組則包含749個特異性差異表達基因。圖6B顯示了M1和ES組之間表達顯著變化的差異基因的分布情況。在ES處理后，共有115個顯著基因表出現了表達變化，其中52個基因顯示出顯著增加，63個基因則顯示出顯著減少。而在使用HEPP與ES聯(lián)合治療后，共發(fā)現159個關鍵差異基因，其中57個基因的表達水平顯著升高，而102個基因的表達水平則大幅降低（圖6C）。圖6D突出了M1組和HEPP+ES組之間特定基因活動的差異。紅色表示基因活性增加，藍色表示基因活性降低。為了確定治療后與免疫反應相關的信號通路，分別對ES組和HEPP+ES組的差異表達基因進行了KEGG分析。如圖6（E-F）所示，結果表明TNF和NF-κB信號通路存在顯著差異，這些通路與 ES 組和 HEPP+ES 組中的炎癥反應有關。如圖6G所示，相比于M1組，ES組中TNF和IL-6 基因的表達更為明顯，提示這兩個基因在控制炎癥反應方面的關鍵作用。圖6H顯示，與M1組相比，HEPP+ES組中TNF基因表達顯著占優(yōu)，且兩組均顯示NF-κB1基因表達上調。如圖6（J-K）所示，相較于M1組，ES組和HEPP+ES組的TNF信號通路均顯著下調；其中以HEPP+ ES組的下調幅度更大，表明該組中TNF通路受到更強的抑制。此外，圖6（L-M）結果表明，NF-κB信號通路在ES組和HEPP+ES組中也呈現下調趨勢。

圖6. 使用HEPP對ES輔助炎癥調節(jié)的RNA測序分析。A）韋恩圖展示了M1、ES和 HEPP+ES組之間的差異基因計數；B-C）火山圖分別展示了ES組與M1組以及HEPP+ES組與M1組之間的差異表達基因；D）M1組與ES+HEPP差異表達基因熱圖；E-F）EGG富集ES vs M1及HEPP+ES vs M1前20通路；G-H）TNF與NF-κB1通路差異基因PPI網絡I）GO富集分析顯示的前30條相關通路；J-M）GSEA 分析TNF和NF-κB通路

（7）HEPP對傷口的治療效果

最后將HEPP應用于糖尿病小鼠傷口模型以評估它們在體內的抗菌、控炎及增強傷口愈合過程的療效。圖7A所示為糖尿病小鼠背部圓形創(chuàng)面模型的建立及給藥流程圖，圖7B中小鼠空腹血糖≥16.7 mmol·L?1被確定位模型成功構建，且小鼠伴隨體重輕度下降（圖7C）。在此基礎上，圖7D體外實驗表明HEPP可迅速形成凝塊，證實其具有快速止血性能。隨后，借助808 nm激光對創(chuàng)面進行連續(xù)12 d的溫度監(jiān)測，結果顯示HEPP組溫升顯著高于PBS對照，直接證明了PTPPG自敷料的可持續(xù)釋放（圖7E–F）。而后分析圖7G-H的結果可知，7 d時HEPP單獨處理組創(chuàng)面剩余面積仍達26.8%，與PBS組（34.7%）差異有限；相比之下，HEPP聯(lián)合660 nm+808 nm激光與電刺激組創(chuàng)面僅余4.6%，至12 d幾近完全愈合。在安全性評價方面，圖7I實驗結果表明1 mg mL?1 PTPPG及HEPP的溶血率均低于5%，符合國際標準，提示其優(yōu)異的生物相容性。

圖7. HEPP對傷口的治療效果。A）用于糖尿病傷口建立的小鼠模型創(chuàng)建示意圖；B）建模及治療過程中的血糖水平及C）體重水平；D）HEPP的止血特性；E）HEPP治療過程中PTPPG釋放的響應性光熱成像；F）使用和未使用HEPP治療的傷口溫度變化；G）接受不同治療的小鼠糖尿病傷口進展的圖像；H）不同組別相對傷口面積的變化；I）不同材料的溶血實驗

另外，實驗通過組織化學染色和免疫熒光技術深入研究了其傷口愈合的機制。如圖8A所示，HEPP＋660＋808＋ES組在術后第12天已重建完整表皮與真皮，并伴隨顯著的新生血管與毛囊生成；圖8B的Masson染色進一步證實，該組膠原纖維致密且排列高度有序。在此基礎上，圖8C–E通過免疫熒光揭示，HEPP＋660＋808＋ES組的CD86表達最低而CD206表達最高，提示巨噬細胞由M1型向M2型有效極化；另外，由圖8F–I定量結果可知，促炎因子TNF-α與IL-6顯著下調，而抗炎因子IL-10與TGF-β顯著上調，這些進一步證明了傷口部位炎癥的顯著緩解。圖8J-K進一步利用VEGF與CD31雙標記證實了HEPP＋660＋808＋ES組新生血管密度顯著高于其余各組，而這種變化對于向代謝活躍的傷口供應必要的營養(yǎng)物質和氧氣至關重要。

圖8.染色法對傷口愈合機理研究。A）組織的H&E染色；B）組織的Masson染色；C）糖尿病傷口部位的組織切片中CD86、CD206、IL-6、IL-10、TNF-α、TGF-β、CD31和VEGF的免疫熒光分析；D-K）定量分析不同處理后的CD86、CD206、IL-6、IL-10、TNF-α、TGF-β、CD31和VEGF的平均熒光強度