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針對上述問題，北京大學深圳醫(yī)院口腔醫(yī)學中心楊宏宇、中國科學院深圳先進技術(shù)研究院耿勝勇團隊研究開發(fā)了一種光熱響應型多功能MnO?納米酶，以促進口腔鱗狀細胞癌（OSCC）中的鐵死亡。將FDA批準的鐵死亡誘導劑RSL3包裹在中空介孔MnO?納米顆粒（HM-MnO?）內(nèi)，并用鐵摻雜多巴胺（Fe-PDA）和cRGD腫瘤靶向肽進行修飾。該MnO?-RSL3@FePDA-cRGD納米催化系統(tǒng)在靶向遞送至腫瘤部位后，模擬過氧化物酶（POD）、氧化酶（OXD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GPx）和NADH氧化酶（NOx）的多酶活性，通過產(chǎn)生大量ROS和有效消耗GSH，為鐵死亡創(chuàng)造最佳TME。在808 nm激光照射下，PDA介導的光熱效應導致系統(tǒng)迅速降解并釋放RSL3，隨后引發(fā)的級聯(lián)反應觸發(fā)強大的鐵死亡，并與光熱療法協(xié)同作用抑制腫瘤生長。這種創(chuàng)新策略為增強鐵死亡、提高抗腫瘤治療效果提供了一種有前景的方法(圖1)。相關(guān)研究在2025年6月15日以“A photothermal-responsive multi-enzyme nanoprobe for ROS amplification and glutathione depletion to enhance ferroptosis”為題發(fā)表于《Biosensors and Bioelectronics》（DOI: 10.1016/j.bios.2025.117384）上。

圖1. MnO₂-RSL3@FePDA-cRGD (MnO₂R@FePDAc)納米催化體系的構(gòu)建及通過多酶模擬活性實現(xiàn)光熱驅(qū)動的鐵死亡

（1）MnO 2 R@ FePDAc納米催化體系的合成與表征

采用模板法合成中空介孔MnO?（HM-MnO?），透射電子顯微鏡（TEM）和掃描電子顯微鏡（SEM）圖像確認其具有明確表面形貌的中空介孔結(jié)構(gòu)（圖2a）。根據(jù)比表面積分析（BET）結(jié)果，HM-MnO?納米顆粒比表面積為33.0 m2/g，平均孔徑為3.5 nm，具備高效納米載體所需的高比表面積和介孔特性（圖2b）。將鐵死亡誘導劑RSL3載入HM-MnO?內(nèi)核后，在表面組裝鐵摻雜多巴胺（Fe-PDA），隨后用cRGD腫瘤靶向肽進行功能化修飾，采用差速離心法去除未結(jié)合的小PDA顆粒和cRGD。如圖2c所示，最終產(chǎn)物MnO?-RSL3@FePDA-cRGD（記作MnO?R@FePDAc）保持約150 nm平均直徑的中空球形結(jié)構(gòu)。能量色散X射線光譜（EDS）映射顯示Mn和Fe元素顯著存在，且含有C、N、O、S、Cl元素（圖2d）。X射線衍射（XRD）圖譜（圖2e）在36.7°和66.3°處有歸屬于晶態(tài)MnO?的明顯峰，20-30°的寬峰對應PDA。X射線光電子能譜（XPS）用于確定MnO?R@FePDAc表面元素組成和化學態(tài)（圖2f），其光譜在652.5 eV和640.8 eV處的結(jié)合能峰分別對應Mn 2p?/?和Mn 2p?/?，經(jīng)峰擬合得到Mn?? 2p?/?和Mn?? 2p?/?信號，證實Mn主要以Mn??氧化態(tài)存在（圖2g）；Fe 2p?/? XPS峰位于723.5 eV和716.7 eV，分別歸屬于Fe3?和Fe2?，F(xiàn)e 2p?/?峰位于712.2 eV和710.0 eV，進一步證實Fe3?和Fe2?共存，確定了Mn和Fe的價態(tài)（圖2h）。此外，傅里葉變換紅外光譜（FT-IR）分析證實PDA和cRGD成功修飾于表面（圖2i），596 cm?1處的FT-IR峰歸因于Fe-O伸縮振動，表明在HM-MnO?表面形成了Fe-PDA聚合物。這些結(jié)果證實了MnO?R@FePDAc納米催化系統(tǒng)的成功制備。

圖2. MnO₂R@FePDAc的表征。(a) HM-MnO₂的 TEM 圖像。(b) HM-MnO₂的 N₂吸附-解吸等溫線和孔徑分布曲線。(c) MnO₂R@FePDAc的 TEM 圖像和 (d) EDS 映射。(e) MnO₂納米粒子和 MnO₂R@FePDAc的 XRD 圖案比較。(f) 全范圍 XPS 光譜和 (g) Mn 2p 和 (h) Fe 2p 相應的高分辨率 XPS 光譜。 (i) FT-IR 光譜

（2）MnO₂R@FePDAc的光熱性能

MnO?R@FePDAc的紫外-可見-近紅外光譜在近紅外區(qū)有顯著吸收。利用紅外熱成像相機監(jiān)測不同濃度納米顆粒懸浮液在1.0 W/cm2的808 nm激光照射下的溫度變化，如圖3a所示，與磷酸鹽緩沖液（PBS）對照組相比，MnO?R@FePDAc溶液溫度呈濃度依賴性上升，表明其能有效將激光能量轉(zhuǎn)化為熱能。光熱性能呈功率密度依賴性，且經(jīng)五次加熱冷卻循環(huán)后無溫度衰減（圖3b），具有光熱穩(wěn)定性。計算得到的光熱轉(zhuǎn)換效率為39.1%（圖3c），足以增強催化性能和降解能力，而未摻雜的PDA光熱轉(zhuǎn)換效率為24.0%，鐵摻雜顯著提升了光熱性能，促進PDA中的非輻射弛豫，誘導鐵死亡。鑒于其光熱性能，研究了MnO?R@FePDAc的藥物控釋行為和降解情況。280 nm處的吸收峰證實了RSL3成功載入MnO?R@FePDAc（圖3d）。在模擬腫瘤微環(huán)境（TME）條件下（pH = 5.4，含10 mM GSH和100 μM H?O?），MnO?R@FePDAc對RSL3呈緩慢釋放，而近紅外光照射則觸發(fā)藥物快速大量釋放（圖3e）。通過評估有無近紅外光照射下MnO?R@FePDAc的過氧化物酶（POD）活性，來研究近紅外光照射對催化能力的影響，經(jīng)近紅外光處理后，因氧化TMB導致的652 nm處吸光度顯著增強（圖3f），表明光熱效應顯著提升了MnO?R@FePDAc的催化性能。進一步通過觀察形態(tài)變化來探究MnO?R@FePDAc的近紅外光響應性藥物釋放機制，在pH 7.4的生理條件下，MnO?R@FePDAc結(jié)構(gòu)穩(wěn)定（圖3g）；在模擬TME條件下孵育1小時后，納米顆粒結(jié)構(gòu)部分降解（圖3h）；而在模擬TME條件下經(jīng)10分鐘近紅外光照射后，MnO?R@FePDAc完全降解（圖3i）。這些結(jié)果表明，光熱效應的引入加速了藥物釋放，顯著增強了MnO?R@FePDAc的催化活性，有助于營造促進鐵死亡的最佳腫瘤微環(huán)境。

圖3.MnO₂R@FePDAc的光熱特性。（a）1.0 W/cm²近紅外光照射下的溫度變化曲線。（b）五次開關(guān)循環(huán)（100 μg/mL）內(nèi)的光熱穩(wěn)定性。（c）光熱轉(zhuǎn)換效率：紅線表示光熱效應；紫線表示在冷卻期間確定的時間常數(shù)（τs）。（d）紫外可見光吸收光譜。（e）在模擬 TME 條件（pH = 5.4，10 mM GSH和100 μM H₂O₂）下，有或沒有近紅外光照射（1.0 W/cm 2 ，持續(xù)10分鐘）時 RSL3 的釋放行為。（f）oxTMB在652 nm處的吸光度表明具有 POD 樣活性。（g-i）MnO₂R@FePDAc分別在pH 7.4下與10 mM GSH 孵育1小時、模擬TME 條件以及在模擬TME條件下近紅外輻射10分鐘后的 TEM 圖像

（3）酶活性檢測

MnO?R@FePDAc的多酶模擬特性對增強活性氧（ROS）生成和谷胱甘肽（GSH）消耗至關(guān)重要。其過氧化物酶（POD）活性通過3,3′,5,5′-四甲基聯(lián)苯胺（TMB）作為底物進行評估，TMB被氧化后在652 nm處有特征吸收峰。其對TMB的米氏常數(shù)（Km）為0.011 mM，最大反應速率（Vmax）為2.136×10?? M s?1，遠優(yōu)于Fe-PDA（圖4a）。其氧化酶（OXD）活性在TMB底物下進行評估，Km為0.059 mM，Vmax為3.453×10?? M s?1，催化效率顯著高于Fe-PDA（圖4b）。在模擬腫瘤微環(huán)境（TME）條件下，MnO?R@FePDAc對GSH的Km和Vmax值分別為0.24 mM和1.657×10?? M s?1，遠高于Fe-PDA（圖4c）。其NADH氧化酶（NOx）活性通過與2 mM NADH在pH 4.5、37℃下反應30分鐘進行評估，其Km和Vmax值分別為0.15 mM和1.455×10?? M s?1，顯著優(yōu)于Fe-PDA（圖4d）。這些結(jié)果突出了MnO?R@FePDAc的多酶模擬作用，包括 POD、OXD、GPx 和 NOx 活性（圖4e），凸顯了其在誘導腫瘤細胞鐵死亡爆發(fā)方面的巨大潛力。電子自旋共振（ESR）光譜檢測到MnO?R@FePDAc在pH 5.4時能產(chǎn)生羥基（?OH）和超氧（O???）自由基，且在加入H?O?后，?OH和O???信號顯著增強（圖4f和圖4g）。在近紅外（NIR）光照射下，MnO?R@FePDAc催化H?O?產(chǎn)生ROS的反應速率加快，ROS生成量增加（圖4h）。

圖4.與MnO2R@FePDAc相關(guān)的酶動力學。(a)類POD、(b)類OXD、(c)類GPx和(d)類NOx活性的Michaelis-Menten曲線。(e)多酶模擬活性示意圖。(f)檢測?OH和(g)O2??的ESR光譜。(h)與100 μM H2O2和2 mM TMB反應5分鐘后在652 nm處的吸光度

（4）體外鐵死亡機制

MnO?R@FePDAc對口腔鱗狀細胞癌（OSCC）細胞的鐵死亡介導細胞死亡效率及機制如下：IR-780修飾的MnO?R@FePDAc在HN6細胞中孵育6小時后，細胞核周圍出現(xiàn)密集紅色熒光（圖5a），表明其可被腫瘤細胞高效內(nèi)化。100 μg/mL HM-MnO?處理細胞24小時，存活率仍高于90%（圖5b），具有良好的生物相容性。與對照組相比，NIR照射下細胞存活率接近100%，光毒性?。▓D5c）。40 μg/mL的MnO?R@FePDAc處理使細胞存活率下降31.8%，NIR照射下95.2%的細胞被殺死（圖5c），歸因于光熱激活的鐵死亡爆炸?；?死細胞染色顯示MnO?R@FePDAc + NIR組完全呈現(xiàn)紅色熒光（圖5d），與細胞存活率結(jié)果一致。MnO?R@FePDAc在腫瘤微環(huán)境（TME）條件下模擬多酶活性，光熱響應性釋放RSL3，為誘導鐵死亡爆炸奠定基礎(chǔ)。經(jīng)MnO?R@FePDAc和NIR照射處理的細胞，在模擬TME條件下產(chǎn)生顯著的活性氧（ROS）（圖5e），且脂質(zhì)過氧化（LPO）水平最顯著（圖5f）。MnO?R@FePDAc處理顯著增加丙二醛（MDA）水平，與NIR聯(lián)合處理時MDA水平進一步升高（圖5g）。MnO?R@FePDAc + NIR處理的HN6細胞中相對谷胱甘肽（GSH）水平下降75%（圖5h），表明其有效消耗GSH。MnO?R@FePDAc + NIR組NADH水平顯著下降（圖5j），可抑制GSH產(chǎn)生。經(jīng)MnO?R@FePDAc處理的HN6細胞的透射電子顯微鏡（TEM）圖像顯示鐵死亡誘導的線粒體功能障礙特征（圖5i）。Western blot分析顯示，谷胱甘肽過氧化物酶4（GPX4）表達顯著下調(diào)，鐵死亡抑制蛋白1（FSP1）、鐵蛋白重鏈1（FTH1）、鐵氧還蛋白1（FDX1）等鐵死亡相關(guān)蛋白表達被抑制（圖5k）。

圖5.體外抗腫瘤活性和機制。（a）用IR-780標記的MnO2R@FePDAc 處理6小時后的CLSM圖像。（b）與游離HM-MnO2孵育24 小時后的相對細胞活力。（c）不同處理后的相對細胞活力。（d）指示活（綠色）/死（紅色）細胞的熒光圖像。（e）細胞 ROS（綠色）/核（藍色）的熒光圖像。（f）使用 Liperfluo 探針的細胞 LPO 含量的熒光圖像。（g）通過商業(yè)試劑盒檢測HN6細胞的 MDA、（h）GSH和（j）NADH 含量。（i）經(jīng)過不同預處理的HN6細胞的 Bio-TEM 圖像。（k）不同處理24小時后GPX4、FSP1、FTH1和FDX1表達的Western印跡分析（ⅰ.對照組，ⅱ. NIR組，ⅲ. MnO2R@FePDAc組，ⅳ. MnO2R@FePDAc + NIR組）。NIR組：808 nm激光以0.5 W/cm2的功率照射5分鐘

（5）體內(nèi)熒光成像及抗腫瘤功效

在HN6腫瘤小鼠中，MnO?R@FePDAc的熒光成像顯示其在腫瘤部位的熒光信號于注射后48小時達到峰值，隨后下降（圖6a），這歸因于EPR效應和cRGD介導的靶向能力。在0.5 W/cm2的NIR照射下，腫瘤部位溫度在5分鐘內(nèi)升至48.2℃（圖6b和c），表明其具有優(yōu)越的光熱效果，可增強ROS生成和鐵死亡。在體內(nèi)抗腫瘤效果方面，MnO?R@FePDAc誘導的鐵死亡有效抑制腫瘤生長，MnO?R@FePDAc + NIR組實現(xiàn)腫瘤生長完全抑制甚至消融（圖6d和e），且腫瘤重量顯著低于其他組（圖6f）。組織病理學分析（圖6g）和免疫熒光檢測（圖6h）進一步證實了其優(yōu)越的抗腫瘤效果和協(xié)同鐵死亡效應，同時各組間體重無顯著差異，表明良好的生物相容性。

圖6.體內(nèi)抗腫瘤活性。（a）注射IR-780標記的MnO2R@FePDAc 后不同時間點的全身光學活體成像，以及注射后 48 小時的體外熒光成像。（b）注射后48小時在0.5 W/cm2的近紅外輻射下對腫瘤部位進行紅外熱成像。（c）圖5b中腫瘤部位的溫度變化。（d）不同組的腫瘤生長曲線。（e）治療結(jié)束時的腫瘤照片。（f）腫瘤重量。（g）腫瘤組織的H&E染色、TUNEL檢測和Ki67免疫熒光染色。（h）FTH1、GPX4和FDX1 的免疫熒光染色