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針對(duì)上述問(wèn)題，山東大學(xué)林貴梅教授團(tuán)隊(duì)提出了一種新的概念設(shè)計(jì)，開發(fā)了一種具有仿生表面的可吸入納米顆粒，該納米顆粒采用體內(nèi)工程外泌體為基礎(chǔ)的siRNA遞送策略，用于治療伴有腦轉(zhuǎn)移的非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）患者。當(dāng)這些納米顆粒被吸入時(shí)，它們能有效穿透肺部屏障，并通過(guò)模仿天然肺表面活性物質(zhì)在肺部積聚，在腫瘤細(xì)胞內(nèi)，釋放的奧希替尼能夠抑制腫瘤生長(zhǎng)，而DNA則會(huì)觸發(fā)工程外泌體的生成，這些外泌體可以到達(dá)大腦，進(jìn)一步抑制腫瘤。這一策略不僅有效抑制了原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性腫瘤，還增強(qiáng)了抗腫瘤免疫反應(yīng)。通過(guò)高效的吸入給藥策略，該納米藥物為癌癥治療提供了一種安全且多功能的解決方案。該文章于2025年4月8日以《Inhalable liposomal delivery of osimertinib and DNA for treating primary and metastasis lung cancer》為題發(fā)表于《Nature Communications》（DOI：10.1038/s41467-025-58312-5）。

圖1. MPDOLs治療NSCLC原發(fā)性肺腫瘤及腦轉(zhuǎn)移的示意圖

（1）NSCLC中IGF2BP3的表達(dá)

利用癌癥基因組圖譜（TCGA）數(shù)據(jù)集分析了非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）腫瘤組織中m6A修飾因子的表達(dá)情況（圖2a）。在這些修飾因子中，IGF2BP3是與轉(zhuǎn)移性腫瘤相比原發(fā)性腫瘤上調(diào)最為顯著的m6A相關(guān)基因之一（圖2b）。進(jìn)一步利用基因表達(dá)分析交互工具（GEPIA）驗(yàn)證了IGF2BP3在兩種肺腫瘤中的高表達(dá)及其與預(yù)后不良的相關(guān)性（圖2c、d）。與這些生物信息學(xué)分析結(jié)果一致，NSCLC患者肺腫瘤組織中IGF2BP3蛋白水平遠(yuǎn)高于鄰近組織（圖2e、f）。此外，免疫組化證據(jù)和定量實(shí)時(shí)PCR（qRT-PCR）檢測(cè)結(jié)果顯示，在NSCLC小鼠模型的腦轉(zhuǎn)移區(qū)域，IGF2BP3表達(dá)水平升高（圖2g、h）。長(zhǎng)期使用奧希替尼（OST，5 mg/kg）部分減輕了腫瘤負(fù)擔(dān)，但也輕微上調(diào)了IGF2BP3的表達(dá)，這與近期報(bào)道IGF2BP3介導(dǎo)非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）靶向治療藥物耐受性的研究結(jié)果一致（圖2i）。在正常LLC細(xì)胞中，經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期OST刺激后IGF2BP3的mRNA表達(dá)水平增加（圖2i）。這些發(fā)現(xiàn)表明，靶向IGF2BP3可能增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)OST的敏感性，并抑制NSCLC治療中的腦轉(zhuǎn)移。由于目前沒(méi)有可用的IGF2BP3小分子抑制劑，設(shè)計(jì)并篩選了siRNA序列（正義鏈：GCCGUCUCAUUGGUAAAGATT，反義鏈：UCUUUACCAAUGAGACGGCTT），以實(shí)現(xiàn)對(duì)IGF2BP3的有效干擾（圖2j、k）

圖2. a. 基于TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)分析的正常和NSCLC組織中m6A修飾因子基因的表達(dá)分布。b. 使用TCGA數(shù)據(jù)對(duì)有無(wú)轉(zhuǎn)移的NSCLC中m6A調(diào)節(jié)因子的分子特征進(jìn)行分析。c. 在GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)中人類NSCLC的IGF2BP3基因表達(dá)分析。d. GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)中IGF2BP3表達(dá)與NSCLC患者生存率的相關(guān)性分析。e. 人類NSCLC組織和鄰近組織中IGF2BP3蛋白的免疫組化染色及f. 定量分析。g. NSCLC小鼠模型組織的IGF2BP3蛋白免疫組化染色。h. 小鼠NSCLC和正常組織中IGF2BP3 mRNA水平的qRT-PCR分析。i. LLC細(xì)胞經(jīng)OST和IGF2BP3 siRNA處理后IGF2BP3 mRNA水平的qRT-PCR分析及j. k. IGF2BP3蛋白水平的Western blot分析

（2）MPDOLs的制備和表征

通過(guò)邁克爾加成反應(yīng)合成PβAE以與質(zhì)粒DNA復(fù)合形成內(nèi)核（PD）。在不同的重量比（1:1、2.5:1、5:1、10:1、20:1和40:1）下構(gòu)建了PD納米顆粒，以評(píng)估PβAE與質(zhì)粒DNA的復(fù)合能力。瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果表明，當(dāng)重量比至少為10:1時(shí)，質(zhì)粒DNA可以被完全復(fù)合（圖3b）。在此重量比下，PD納米顆粒的平均尺寸為50.47 ± 5.36 nm，呈正電荷的zeta電位為26.97 ± 3.85 mV，且呈球形（圖3c）。同時(shí)，通過(guò)薄膜分散法制備了包裹OST的脂質(zhì)外殼。得到的OST脂質(zhì)體（OLs）的平均尺寸為141.47 ± 3.07 nm，zeta電位為6.65 ± 0.37 mV。隨后，將PD顆粒加入等體積的OLs中形成PDOLs，其平均尺寸為182.63 ± 6.04 nm（圖3c）。此外，利用慢病毒轉(zhuǎn)染建立穩(wěn)定表達(dá)SP-B蛋白的MSC細(xì)胞系，并在轉(zhuǎn)染后48小時(shí)通過(guò)GFP熒光檢測(cè)到明顯信號(hào)（圖3d）。經(jīng)過(guò)7天的嘌呤霉素處理篩選穩(wěn)定克隆后，通過(guò)Western blot實(shí)驗(yàn)確認(rèn)了SP-B的高表達(dá)（圖3e）。在用細(xì)胞膜包被后，得到的MPDOLs尺寸略有增加，為195.20 ± 4.56 nm，zeta電位從6.74 mV變?yōu)?4.28 mV。通過(guò)熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證了MSC膜與脂質(zhì)體的融合。當(dāng)MSC膜和脂質(zhì)體靠近融合時(shí)，脂質(zhì)體中的DiO吸收波長(zhǎng)通過(guò)能量共振激發(fā)膜中的Dil熒光團(tuán)，這導(dǎo)致熒光特征光譜發(fā)生變化，包括DiO發(fā)射熒光減弱和Dil發(fā)射熒光出現(xiàn)（圖3f）。蛋白質(zhì)組學(xué)分析進(jìn)一步驗(yàn)證了MPDOLs中膜蛋白的保留（圖3g）。評(píng)估了在兩種不同pH下模擬正常生理?xiàng)l件和腫瘤細(xì)胞的酸性環(huán)境時(shí)OST的釋放特性，包載在脂質(zhì)體中的OST在pH=7.4時(shí)顯示出較慢的釋放特性，釋放過(guò)程持續(xù)數(shù)天，在pH=5.0時(shí)，MPDOLs中的OST在12小時(shí)內(nèi)釋放了79.85%，表明MPDOLs能夠在腫瘤細(xì)胞的內(nèi)體溶酶體中快速釋放藥物（圖3h）。

為了研究MPDOLs的體內(nèi)分布，分別對(duì)小鼠給予游離DiR、DiR標(biāo)記的PDOLs或DiR標(biāo)記的MPDOLs，并使用活體成像系統(tǒng)在24小時(shí)內(nèi)監(jiān)測(cè)其熒光分布情況。與游離DiR組相比，MPDOLs處理組小鼠肺部的熒光強(qiáng)度約為游離DiR組的兩倍（圖3i、j）。MPDOLs處理組中，肺部的熒光強(qiáng)度在吸入后12小時(shí)達(dá)到峰值，隨后逐漸下降（圖3i）。通過(guò)對(duì)肺組織切片進(jìn)行熒光顯微鏡檢查，進(jìn)一步證實(shí)了MPDOLs的增強(qiáng)穿透和保留能力，與PDOLs相比，其在細(xì)支氣管和肺泡中的積累更高（圖3k）。鑒于肺部腫瘤微環(huán)境的復(fù)雜性，該微環(huán)境由多種細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)和分泌物組成，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)研究了攝取MPDOLs的主要細(xì)胞群。結(jié)果表明，MPDOLs主要定位于CD45?惡性細(xì)胞，占總細(xì)胞群的約70%，其次是占20%的巨噬細(xì)胞（圖3l）。這些發(fā)現(xiàn)表明，MPDOLs能夠有效穿透肺組織，并主要被惡性細(xì)胞內(nèi)化，顯示出其增強(qiáng)肺部藥物遞送的潛力。

圖3.a. MPDOLs制備過(guò)程的示意圖。b. 不同重量比下PβAE與質(zhì)粒DNA復(fù)合物的瓊脂糖凝膠電泳圖。c. PDs、OLs、PDOLs和MPDOLs的粒徑分布和形態(tài)圖像。d. LV-Sftpb轉(zhuǎn)染MSCs后48小時(shí)的熒光顯微鏡圖像e. Western blot分析確認(rèn)SP-B在SP-B+MSC細(xì)胞中的高表達(dá)。f. 由Dil標(biāo)記的膜和DiO標(biāo)記的脂質(zhì)體在MPDOLs中產(chǎn)生的FRET對(duì)的發(fā)射光譜。g. MPDOLs中膜蛋白的SDS-PAGE分析。h. 在兩種不同pH環(huán)境中MPDOLs中OST的釋放動(dòng)力學(xué)。i. 經(jīng)霧化吸入后，LLC腫瘤小鼠的代表性活體成像圖，j. 主要器官中熒光輻射效率的定量分析。k. 經(jīng)霧化吸入后，小鼠肺組織切片的免疫熒光圖像。l. 流式細(xì)胞術(shù)分析顯示肺組織中總細(xì)胞中攝取MPDOLs的細(xì)胞百分比

（3）MPDOLs在體外的生物學(xué)效應(yīng)

通過(guò)用香豆素6（C6）標(biāo)記脂質(zhì)層來(lái)研究LLC細(xì)胞對(duì)MPDOLs的攝取。流式細(xì)胞術(shù)分析和共聚焦顯微鏡結(jié)果均顯示，MPDOL處理組隨時(shí)間推移呈現(xiàn)出依賴時(shí)間的熒光信號(hào)。與C6組相比，F(xiàn)ITC的平均熒光強(qiáng)度更高，表明細(xì)胞攝取能力增強(qiáng)（圖4b、c）。隨后使用不同的內(nèi)吞抑制劑來(lái)確定LLC細(xì)胞中MPDOLs的內(nèi)化途徑。結(jié)果表明，氯丙嗪（CPZ）和大豆素（GEN）能夠抑制細(xì)胞內(nèi)平均熒光強(qiáng)度，而甲基-β-環(huán)糊精（m-β-CD）和阿米洛利氫氯酸鹽（AM）則無(wú)此效果，這表明MPDOLs主要通過(guò)網(wǎng)格蛋白和洞穴體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞（圖4d）。在網(wǎng)格蛋白和洞穴體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用中，溶酶體逃逸是影響納米藥物亞細(xì)胞生物利用度的關(guān)鍵步驟。使用LysoTracker標(biāo)記內(nèi)體-溶酶體，并通過(guò)共聚焦顯微鏡觀察GFP標(biāo)記的MPDOLs。孵育4-8小時(shí)后，GFP信號(hào)大多被困在溶酶體中，隨著時(shí)間推移，共定位減少，GFP信號(hào)逐漸擴(kuò)散到細(xì)胞質(zhì)中，表明成功實(shí)現(xiàn)了溶酶體逃逸（圖4e）?？梢詮膸讉€(gè)方面來(lái)解釋這一現(xiàn)象。釋放實(shí)驗(yàn)表明，內(nèi)體-溶酶體的酸性環(huán)境觸發(fā)了MPDOLs的破裂，并促進(jìn)了OST和PDs的釋放。為進(jìn)一步證實(shí)這一點(diǎn)，用MPDOLs孵育的LLC細(xì)胞經(jīng)吖啶橙染色后，與對(duì)照組相比，顯示出明顯的溶酶體膜通透性增加（圖4f）。

在LLC細(xì)胞中，MPDOLs對(duì)IGF2BP3表達(dá)的下調(diào)作用以及誘導(dǎo)細(xì)胞毒性能力的評(píng)估結(jié)果顯示，MPDOLs和PDs均能顯著下調(diào)IGF2BP3的表達(dá)水平。通過(guò)qPCR和Western blot分析，我們發(fā)現(xiàn)MPDOLs和PDs均能有效降低IGF2BP3的mRNA和蛋白表達(dá)水平（圖4g、h）。細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)表明，MPDOLs的半數(shù)抑制濃度（IC50）為1.23 μM，低于單獨(dú)使用OST（2.03 μM）和PDs（2.36 μM）的IC50值（圖4i）。此外，通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)Annexin V-FITC和碘化丙啶（PI）染色的細(xì)胞凋亡情況，MPDOL處理組在48小時(shí)后顯示出最高的凋亡率，占總細(xì)胞群體的17.6%（圖4j）。這些結(jié)果表明，MPDOLs能夠有效地將OST和DNA遞送至腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，進(jìn)而下調(diào)IGF2BP3的表達(dá)，并抑制LLC細(xì)胞的生長(zhǎng)。

圖4.a. MPDOLs在LLC細(xì)胞中的細(xì)胞攝取及其在外泌體產(chǎn)生中的作用。b. 流式細(xì)胞術(shù)分析和c. 定量分析LLC細(xì)胞攝取C6標(biāo)記的MPDOLs的平均熒光強(qiáng)度。d. 不同內(nèi)吞抑制劑對(duì)LLC細(xì)胞攝取MPDOLs的影響。e. 不同時(shí)間LLC細(xì)胞中MPDOLs的溶酶體逃逸圖像。f. 用MPDOLs處理的LLC細(xì)胞的吖啶橙染色。g. qRT-PCR分析LLC細(xì)胞中IGF2BP3 mRNA水平和h. Western blot分析LLC細(xì)胞中IGF2BP3蛋白表達(dá)，經(jīng)不同制劑處理。i. 不同s處理48小時(shí)后LLC細(xì)胞的細(xì)胞活力。j. 不同處理48小時(shí)后LLC細(xì)胞的總凋亡率，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)測(cè)量

（4）來(lái)自細(xì)胞培養(yǎng)上清液的RVG-EXOs（si）的表征和生物學(xué)效應(yīng)

通過(guò)MPDOLs轉(zhuǎn)染是否能夠指導(dǎo)siRNA裝載到外泌體中。在用MPDOLs轉(zhuǎn)染LLC細(xì)胞后，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液以提取外泌體，這些外泌體被命名為RVG-EXOs（si）。納米顆粒跟蹤分析（NTA）顯示，外泌體的平均直徑為132.5 ± 4.6 nm，形態(tài)學(xué)特征顯示其呈扁平圓盤狀結(jié)構(gòu)，具有特征性的脂質(zhì)雙層（圖5a、b）。通過(guò)Western blot檢測(cè)到熱休克蛋白70（HSP70）和ALIX這兩種特異性外泌體標(biāo)記物（圖5c）。在用含有Flag標(biāo)簽質(zhì)粒的MPDOLs轉(zhuǎn)染LLC細(xì)胞后，觀察到從細(xì)胞培養(yǎng)上清液中提取的外泌體中Flag的富集，這證實(shí)了指導(dǎo)蛋白的表達(dá)。此外，ALIX條帶在各樣本中的相似密度表明外泌體的產(chǎn)生水平一致（圖5d）。通過(guò)PCR分析證實(shí)，與未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞相比，經(jīng)MPDOLs轉(zhuǎn)染的細(xì)胞產(chǎn)生的外泌體中IGF2BP3 siRNA含量增加（圖5e）。當(dāng)LLC細(xì)胞與分離的RVG-EXOs（si）（總蛋白濃度為5 μg/mL）共孵育時(shí)，IGF2BP3的mRNA和蛋白水平均被敲低（圖5f）。進(jìn)一步研究了RVG-EXOs(si)在體外的治療效果。RVG-EXOs（si）表現(xiàn)出劑量依賴性的細(xì)胞毒性，而正常LLC細(xì)胞上清液中分離的對(duì)照外泌體（EXOs）對(duì)癌細(xì)胞生長(zhǎng)幾乎沒(méi)有影響，這表明RVG-EXOs（si）能夠有效裝載IGF2BP3 siRNA并保留其生物學(xué)功能（圖5g）。為了評(píng)估RVG-EXOs（si）穿越血腦屏障（BBB）的能力，構(gòu)建了體外BBB模型，使用bEnd.3細(xì)胞形成緊密連接（圖5h）。將Dil標(biāo)記的RVG-EXOs（si）加入到Transwell系統(tǒng)的上室（圖5h）中。通過(guò)顯微鏡圖像和LLC細(xì)胞下室中的熒光強(qiáng)度確認(rèn)RVG增強(qiáng)了外泌體穿越BBB的能力（圖5i、j）。隨后，還研究了體內(nèi)或體外產(chǎn)生的RVG-EXOs(si)的組織靶向能力。在給藥后12小時(shí)對(duì)主要器官進(jìn)行成像，與普通EXOs相比，由基因工程化腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生的RVG-EXOs（si）在腦組織中顯示出顯著更高的熒光信號(hào)，而在肝臟中的積累較少（圖5k、l）。

圖5.a.RVG-EXOs（si）的粒徑分布，b. 形態(tài)學(xué)特征。c. Western blot分析RVG-EXOs（si）中外泌體標(biāo)記物ALIX和HSP70，以及d. 用含有RVG-CD63-Flag融合質(zhì)粒的MPDOLs轉(zhuǎn)染后外泌體中Flag的表達(dá)。e. RVG-EXOs（si）中相對(duì)IGF2BP3 siRNA含量。f. qRT-PCR分析LLC細(xì)胞中IGF2BP3 mRNA水平。g. RVG-EXOs（si）或EXOs處理48小時(shí)后LLC細(xì)胞的細(xì)胞活力。h. 用于評(píng)估RVG-EXOs（si）穿越血腦屏障（BBB）能力的Transwell系統(tǒng)的示意圖。i. 經(jīng)RVG-EXOs（si）處理后下室中LLC細(xì)胞的代表性熒光圖像和j. 熒光強(qiáng)度定量分析。k. 尾靜脈注射游離DiD、DiD標(biāo)記的EXOs和DiD標(biāo)記的RVG-EXOs（si）后12小時(shí)，主要器官的離體成像和l. 主要器官中DiD的熒光強(qiáng)度定量分析

（5）MPDOLs在體內(nèi)的治療效果

為了評(píng)估MPDOLs的體內(nèi)抗腫瘤療效，我們建立了C57BL/6J小鼠的原位和腦轉(zhuǎn)移肺癌腫瘤模型，使用表達(dá)熒光素酶的LLC細(xì)胞（LLC-Luc）。MPDOLs、PDOLs、PDs、OLs和磷酸鹽緩沖液（PBS）通過(guò)霧化吸入給藥，每4天給藥一次，共5次，而奧希替尼（OST）則通過(guò)灌胃給藥（圖6a）。每3天記錄一次小鼠體重，并通過(guò)生物發(fā)光成像每周監(jiān)測(cè)一次腫瘤進(jìn)展（圖6b）。PBS組的生物發(fā)光信號(hào)迅速增加，第21天后體重顯著下降，表明腫瘤進(jìn)展（圖6b、c）。游離OST顯示出極小的治療效果，而OLs和PDs對(duì)腫瘤抑制效果有限。相比之下，MPDOL吸入顯著抑制了腫瘤生長(zhǎng)并延長(zhǎng)了生存期。接受MPDOL治療的小鼠生存期最長(zhǎng)，70天時(shí)仍有80%存活，突顯了其卓越的治療效果（圖6d）。在第28天，通過(guò)微計(jì)算機(jī)斷層掃描（micro-CT）觀察到肺部腫瘤負(fù)荷減少，隨后每組處死8只小鼠進(jìn)行進(jìn)一步分析。他們的血液樣本、肺組織、腦組織和其他重要器官被取出，用于流式細(xì)胞術(shù)、細(xì)胞因子測(cè)定和組織學(xué)評(píng)估（HE）。Micro-CT顯示MPDOL組肺部腫瘤負(fù)荷減少，肺密度降低，濕重較PBS和OST組減輕（圖6e、f）。離體生物發(fā)光成像進(jìn)一步顯示MPDOL治療組肺部和腦部腫瘤負(fù)荷減少。雖然OLs主要減輕了肺部腫瘤負(fù)荷，但PDs對(duì)腦轉(zhuǎn)移瘤的療效更為顯著（圖6g、h以及補(bǔ)充圖17）。這表明通過(guò)DNA質(zhì)粒在體內(nèi)產(chǎn)生的外泌體有望用于治療遠(yuǎn)處腫瘤。在腦轉(zhuǎn)移模型中，PBS處理的小鼠表現(xiàn)出較大的腫瘤負(fù)荷，而MPDOL治療幾乎將腦轉(zhuǎn)移瘤抑制到難以檢測(cè)的水平（圖6i）。

圖6.a. 吸入治療的實(shí)驗(yàn)時(shí)間表。b. 小鼠肺部和腦部腫瘤的活體生物發(fā)光成像。c. 小鼠體重變化和d. 每個(gè)治療組的生存曲線。e. 通過(guò)CT成像分析的平均肺密度和f. 第28天治療后隔離的肺重量。g. 第28天治療后肺部和h. 腦部腫瘤細(xì)胞的離體生物發(fā)光成像。i. 不同處理小鼠腦組織切片的代表性HE染色圖像

（6）MPDOLs介導(dǎo)的體內(nèi)抗腫瘤免疫反應(yīng)

MPDOLs治療對(duì)原位肺腫瘤微環(huán)境的免疫調(diào)節(jié)效應(yīng)進(jìn)行了系統(tǒng)評(píng)估。MPDOLs治療顯著增加了CD8+ T細(xì)胞的比例（圖7a）。與CD8+ T細(xì)胞介導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞殺傷相關(guān)的干擾素-γ（IFN-γ）水平升高，而調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Tregs）在抗腫瘤免疫抑制中發(fā)揮著重要作用。值得注意的是，MPDOL治療使Tregs的百分比降低了三倍，并將IFN-γ+CD8+ T細(xì)胞的比例從PBS組的2.16%提高到9.16%（圖7b、c）。MPDOL組中自然殺傷（NK）細(xì)胞的比例增加，進(jìn)一步促進(jìn)了抗腫瘤免疫反應(yīng)（圖7d）。腫瘤免疫微環(huán)境還表現(xiàn)為M2型巨噬細(xì)胞比例減少，促炎性M1型巨噬細(xì)胞比例增加，這可能歸因于IGF2BP3的敲除，與之前的發(fā)現(xiàn)一致（圖7e、f）。通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）進(jìn)行的細(xì)胞因子分析顯示，與PBS組相比，MPDOL治療組的血清中IFN-γ和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）水平顯著升高，而白細(xì)胞介素-6（IL-6）、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1（TGFβ1）和白細(xì)胞介素-10（IL-10）水平降低（圖7g）。上述結(jié)果表明，MPDOL治療激發(fā)了抗腫瘤免疫反應(yīng)，并最終促進(jìn)了針對(duì)腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性免疫效應(yīng)。

圖7.a. 流式細(xì)胞術(shù)和定量分析顯示不同治療后肺部腫瘤微環(huán)境中CD8+ T細(xì)胞的比例。b. 細(xì)胞毒性T細(xì)胞、c. Treg細(xì)胞和d. NK細(xì)胞的比例。e. 定量分析肺部腫瘤微環(huán)境中M2型巨噬細(xì)胞和f. M1型巨噬細(xì)胞的比例。g. 血清中TNF-α、IFN-γ、IL-6、IL-10和TGF-β1的相對(duì)細(xì)胞因子水平

（7）MPDOLs介導(dǎo)的抗腫瘤機(jī)制

為了進(jìn)一步闡明MPDOLs對(duì)LLC細(xì)胞的治療機(jī)制，進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組分析。RNA測(cè)序鑒定了1203個(gè)差異表達(dá)基因（DEGs）（|log2(倍數(shù)變化)| > 1，p < 0.05），其中597個(gè)下調(diào)，606個(gè)上調(diào)（圖8a），基因本體（GO）富集分析顯示，下調(diào)基因與細(xì)胞增殖、細(xì)胞侵襲、DNA損傷修復(fù)以及癌癥相關(guān)生物過(guò)程和通路相關(guān)。隨后，KEGG通路富集分析突出了觀察到的生物學(xué)效應(yīng)所涉及的通路，與對(duì)照組相比，MPDOL處理組顯著富集了細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用（30個(gè)DEGs）和絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號(hào)通路（38個(gè)DEGs）（圖8b）。為了研究潛在的相互作用和中心樞紐基因，將蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape軟件，取自五個(gè)cytoHubba算法（MNC、EPC、Degree、Closeness和BottleNeck）的前十個(gè)基因的交集。如圖8c所示，Vegfa、Jund、Kdr、Ptgs2、Fos和Myc被鑒定為樞紐基因，與對(duì)照組相比，MPDOLs處理組中這些基因表達(dá)下調(diào)。其中，Myc、Fos和Ptgs2的|log2(倍數(shù)變化)|值超過(guò)2，而Vegfa、Jund和Kdr的|log2(倍數(shù)變化)|值大于1（圖8a）。Myc在這些基因中具有最高的絕對(duì)豐度。為了進(jìn)一步探索Myc的作用，分析了LLC細(xì)胞中其蛋白水平。結(jié)果顯示，MPDOLs下調(diào)了Myc的蛋白表達(dá)（圖8d）。據(jù)報(bào)道，大多數(shù)腫瘤細(xì)胞依賴于糖酵解，通常稱為Warburg效應(yīng)，作為糖酵解的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，Myc通過(guò)促進(jìn)葡萄糖氧化為丙酮酸影響代謝過(guò)程，產(chǎn)生兩個(gè)ATP分子，并促進(jìn)氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）向還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）的轉(zhuǎn)化。在MPDOL處理后對(duì)LLC細(xì)胞中的幾種糖酵解相關(guān)代謝物進(jìn)行了定量分析。結(jié)果顯示，葡萄糖攝取和乳酸產(chǎn)生（糖酵解的終產(chǎn)物）顯著減少（圖8e、f）。此外，觀察到MPDOL組中NAD+水平增加（圖8g）。從機(jī)制上講，我們發(fā)現(xiàn)糖酵解的兩個(gè)限速酶—葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1（GLUT1）和己糖激酶2（HK2）的表達(dá)下調(diào)，這可能是Warburg效應(yīng)受到影響的原因（圖8h、i）。此外，腫瘤微環(huán)境中的乳酸含量通常會(huì)影響抗腫瘤免疫調(diào)節(jié)，這也與體內(nèi)抗腫瘤免疫反應(yīng)的結(jié)果相輔相成（圖8j）。

圖8.a. 火山圖顯示與對(duì)照組相比，MPDOL治療組LLC細(xì)胞中差異表達(dá)基因的情況。b. 通過(guò)KEGG功能富集分析確定MPDOL組中前20個(gè)顯著調(diào)控的通路。c. 通過(guò)PPI分析使用5種算法確定的前10個(gè)中心樞紐基因。d. Western blot分析LLC細(xì)胞中Myc蛋白表達(dá)。e. 不同處理后LLC細(xì)胞的葡萄糖消耗量，f. 乳酸濃度和g. NAD+水平。h. 經(jīng)不同處理后LLC細(xì)胞中HK2的免疫熒光染色和i. GLUT1。j. 提出的MPDOL治療協(xié)同機(jī)制的示意圖