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針對上述問題，天津大學(xué)醫(yī)學(xué)工程與轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究院李曉紅教授團(tuán)隊(duì)構(gòu)建了創(chuàng)新的 OBCIs，將移植類器官的優(yōu)點(diǎn)與神經(jīng)調(diào)節(jié)相結(jié)合，以修復(fù)腦損傷。首先，我們評(píng)估了 OBCI 系統(tǒng)的長期安全性和可行性，并探索了調(diào)節(jié)類器官移植物的方案。早期調(diào)節(jié)后，移植物的進(jìn)行分化和成熟得到增強(qiáng)。此外，在后期調(diào)節(jié)后，移植物和宿主大腦之間建立了結(jié)構(gòu)功能連接，顯示出突觸連接增加，并最終促進(jìn)宿主受損功能的修復(fù)。未來，OBCI 可以與閉環(huán)系統(tǒng)集成，以創(chuàng)建雙向 BCI 框架，該框架在宿主大腦內(nèi)重建特定的神經(jīng)功能回路。該文章于2024年11月6日以《Constructing organoid-brain-computer interfaces for neurofunctional repair after brain injury》為題發(fā)表于《nature communications》（DOI：10.1038/s41467-024-53858-2）。

（1）體外創(chuàng)建類器官電極復(fù)合物以模擬體內(nèi)類器官腦機(jī)接口

為了探索調(diào)節(jié)OBCI的參數(shù)，研究者在體外構(gòu)建了類器官-電極復(fù)合物（圖1A、B），并在90天培養(yǎng)后將其固定在3D打印支架上。實(shí)驗(yàn)選擇了三個(gè)電極位點(diǎn)，測試了1 Hz至100 Hz的頻率和10 μA至70 μA的振幅梯度。結(jié)果顯示，50 Hz和50 μA的刺激使類器官發(fā)射頻率更高（圖1C），間刺間期（ISI）更短（圖1D、E）。電刺激（ES）對類器官分化的影響表明，ES組TBR1表達(dá)降低，CTIP2比例增加，突觸數(shù)量更多（圖1H、I），VGLUT1表達(dá)更高（圖1J、K），星形膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量減少（圖1L、M）。電生理特性分析顯示，ES組尖峰放電速率更高，網(wǎng)絡(luò)同步性更強(qiáng)，低頻能量更大，表明ES促進(jìn)了類器官的功能成熟（圖1N-R）。

圖1 基于類器官-電極復(fù)合物探索刺激參數(shù)。（A）類器官-電極復(fù)合物（腦類器官和雙柄柔性電極）示意圖，紅色方塊為受刺激部位，右側(cè)紅色虛線方塊顯示電極參數(shù)；（B）調(diào)節(jié)、注視和記錄時(shí)間表；（C）放電速率與振幅或頻率的關(guān)系；（D）刺激前后類器官的尖峰間歇（ISI）直方圖；（E）σ與μ的關(guān)系（刺激前后所有通道）；（F）D120 時(shí) Ctrl 和 ES 組類器官層狀結(jié)構(gòu)標(biāo)志物（SATB2、CTIP2、TBR1）；（G）D120 時(shí) TBR1、CTIP2 和 SATB2 細(xì)胞的定量；（H）D120 時(shí) SYN 和 PSD95 的免疫染色；（I）SYN 和 PSD95 共標(biāo)記點(diǎn)的定量；（J）D120 時(shí) VGLUT1 和 MAP2；（K）VGLUT1 點(diǎn)的定量；（L）D120 時(shí)星形膠質(zhì)細(xì)胞（GFAP）和 NeuN 的免疫染色；（M）GFAP 表達(dá)的定量；（N）D120 時(shí)兩組的高通記錄（3 秒）和尖峰波形；（O）D120 時(shí) ES 和 Ctrl 組的柵格圖；（P, Q）D120 時(shí) ES 和 Ctrl 組的放電速率和同步指數(shù)；（R）D120 時(shí) ES 和 Ctrl 組的三維頻譜圖

（2）類器官-腦-計(jì)算機(jī)接口被有效地構(gòu)建和維護(hù)了幾個(gè)月

為了模擬皮質(zhì)損傷并開發(fā)用于大腦修復(fù)的類器官介導(dǎo)的BCI，研究者將培養(yǎng)40天的GFP類器官移植到宿主S1中（0 dpt），并在25 dpt時(shí)植入雙柄柔性電極，一根插入類器官，另一根插入宿主M1，形成OBCI系統(tǒng)（圖2A-C）。在60 dpt和120 dpt時(shí)，對移植物和宿主腦的電極周圍進(jìn)行免疫染色（圖2C、D）。結(jié)果顯示，電極周圍未見小膠質(zhì)細(xì)胞（IBA1）或星形膠質(zhì)細(xì)胞（GFAP）聚集（圖2C-a, C-b, D-a, D-b），且小膠質(zhì)細(xì)胞大多未活化（P2RY12和iNOS表達(dá)，圖2C-c, C-d）。宿主大腦中血管結(jié)構(gòu)完整，神經(jīng)元突觸蛋白表達(dá)豐富（圖2D-c, D-d）。移植物中觀察到進(jìn)行性分化（DCX）和成熟（MAP2），并伴隨血管浸潤（圖2E-G），且突觸連接良好（SYN和PSD95共定位，圖2H）。電極未對類器官或宿主大腦造成損傷。信號(hào)活動(dòng)隨時(shí)間增加，表現(xiàn)為高頻尖峰和低頻能量增強(qiáng)，反映類器官成熟和電極有效性（圖2I, J）。移植動(dòng)物存活率約85%，超過180天，各組間無顯著差異（圖2K）。柔性電極的信噪比（SNR）在180天后雖有所下降，但仍保持在10分貝以上，表明信號(hào)長期穩(wěn)定（圖2L）。

（3）早期刺激通過類器官-腦-計(jì)算機(jī)接口促進(jìn)神經(jīng)發(fā)育

為了調(diào)節(jié)移植類器官的發(fā)育，研究選擇了兩個(gè)關(guān)鍵時(shí)間點(diǎn)（移植后30天和60天）。早期刺激參數(shù)在體外類器官-電極復(fù)合物中確認(rèn)，且體內(nèi)刺激持續(xù)10天（圖3A）。結(jié)果顯示，60天時(shí)刺激可顯著增加移植體積（圖3B、C）。BO-ET-ES組在60天時(shí)Ki67陽性細(xì)胞比例高于其他組，但隨時(shí)間下降，表明無持續(xù)增殖（圖3D、E）。BO-ET-ES組中，移植組織內(nèi)血管浸潤更多（CD31染色，圖3F、G），神經(jīng)祖細(xì)胞（PAX6）數(shù)量減少，成熟神經(jīng)元（NeuN）數(shù)量增加（圖3H-K），表明漸進(jìn)性分化。此外，BO-ET-ES組中皮質(zhì)神經(jīng)元亞類（SATB2和CTIP2）數(shù)量增加（圖3L-O）。

圖3 早期刺激通過 OBCI 促進(jìn)類器官移植物的分化。（A）類器官植入（0 dpt）、電極插入、1M 刺激和記錄信號(hào)的時(shí)間表，右圖為電刺激參數(shù)；（B）60 dpt 時(shí) BO、BO-ET 和 BO-ET-ES 組小鼠大腦冠狀切片顯示類器官生長；（C）不同組類器官體積的定量；（D）60 dpt 時(shí) BO、BO-ET 和 BO-ET-ES 組的 Ki67（綠色）和人細(xì)胞核（HN，紅色）免疫熒光染色；（E）Ki67 細(xì)胞的定量；（F）60 dpt 時(shí)不同組 HN 和 CD31 的免疫熒光檢測；（G）CD31 血管結(jié)構(gòu)的定量；（H, J）120 dpt 時(shí)神經(jīng)祖細(xì)胞（PAX6，H）和成熟神經(jīng)元（NeuN，J）的免疫熒光染色；（I, K）PAX6 和 NeuN 細(xì)胞的定量；（L, N）120 dpt 時(shí) CTIP2（L）和 SATB2（N）的免疫熒光染色；（M, O）CTIP2 和 SATB2 細(xì)胞的定量；（P）180 dpt 時(shí) hSYN（紅色）和 PSD95（綠色）的免疫熒光染色；（Q）180 dpt 時(shí) hSYN 和 PSD95 共定位點(diǎn)的定量

（4）早期刺激通過類器官-腦-計(jì)算機(jī)接口促進(jìn)了移植物的功能成熟

在組織學(xué)記錄類器官成熟后，使用OBCI評(píng)估了移植物的功能成熟（圖4A，B）。在10天刺激期內(nèi)，BO-ET-ES組的放電率顯著高于BO-ET組（圖4C）。局部場電位（LFP）分析顯示，BO-ET-ES組中高頻段能量顯著增加，而低頻段能量和信息熵保持穩(wěn)定（圖4D）。長期電生理活性監(jiān)測（40至180 dpt）表明，BO-ET-ES組的發(fā)射速率、突發(fā)數(shù)和突發(fā)持續(xù)時(shí)間持續(xù)增加，與BO-ET組差異顯著，而尖峰振幅穩(wěn)定（圖4G-J）。LFP分析中，BO-ET-ES組的Gamma波段能量高于BO-ET組（圖4K-M）。跨頻相位幅度耦合（PAC）分析顯示，BO-ET-ES組的PAC更強(qiáng)，表明功能成熟度增強(qiáng)（圖4O）。為了探究電刺激對功能恢復(fù)的影響，研究記錄了自由活動(dòng)小鼠在von Frey纖維刺激足底時(shí)的LFP活動(dòng)。結(jié)果顯示，BO-ET-ES組在von Frey測試中Gamma和高Gamma頻段的能量隨時(shí)間顯著增加，180天后與未移植組相當(dāng)，表明宿主功能恢復(fù)（圖4P-Q）。

圖4 早期刺激通過 OBCI 促進(jìn)類器官的功能成熟。（A）早期刺激時(shí)間表；（B）行為測試圖像；（C, D）體內(nèi)受刺激類器官的電生理學(xué)（LFP）：（C）放電速率，（D）Gamma 波段能量；（E）120 dpt 時(shí) 3 秒高通跡線；（F）120 dpt 時(shí) 60 秒光柵圖；（G-J）40、60、90、120 和 180 dpt 刺激后體內(nèi)類器官的電生理學(xué)：（G）放電速率，（H）尖峰振幅，（I）每分鐘爆發(fā)數(shù)，（J）爆發(fā)持續(xù)時(shí)間；（K-L）120 dpt 時(shí)功率譜密度（K）和頻譜圖（L）；（M）40、60、90、120 和 180 dpt 時(shí)體內(nèi) γ 總功率百分比；（N）60 和 120 dpt 時(shí) Theta-Gamma PAC 強(qiáng)度分布；（O）40、60、90、120 和 180 dpt 刺激后 Theta-Gamma PAC 定量；（P）180 dpt 時(shí) von Frey 測試中 Na?ve、BO-ET-ES 和 BO-ET 組的頻譜圖；（Q）60、120 和 180 dpt 時(shí) Na?ve、BO-ET-ES 和 BO-ET 組的 Gamma、高 Gamma 和 Theta-Gamma 偶聯(lián)總功率百分比變化（與 BO-ET 組停藥后相比）

（5）后期刺激通過類器官-腦-計(jì)算機(jī)接口改善了結(jié)構(gòu)整合

為了評(píng)估基于OBCI的刺激是否能增強(qiáng)移植類器官與宿主大腦的結(jié)構(gòu)整合，研究在60 dpt時(shí)對類器官的廣泛投射進(jìn)行了分析，并選擇了70 Hz刺激參數(shù)用于晚期調(diào)節(jié)（圖5A，B）。在120 dpt時(shí)，觀察到BO、BO-ET和BO-ET-ES組中類器官的穩(wěn)健存活（圖5C）。

研究發(fā)現(xiàn)，移植神經(jīng)元在60、120和150 dpt時(shí)廣泛投射到宿主大腦，類器官邊界模糊，且存在束狀投射（圖5D-c）。突起主要位于移植物附近（圖5D-b），部分延伸至對側(cè)皮層（圖5D-a），胼胝體（CC）中也發(fā)現(xiàn)更多投射（圖5D-d, f，補(bǔ)充圖9A-a, B-b, C-a）。120和150 dpt時(shí)，海馬區(qū)域和皮層下結(jié)構(gòu)（如VPL）中也觀察到投射，而60 dpt時(shí)未見（圖5D-g, i-j）。

比較分析顯示，晚期刺激增加了類器官到同側(cè)宿主大腦的投射數(shù)量，且投射距離延長，表明存在谷氨酸能和GABA能突觸（圖5F, H）。結(jié)果表明，刺激有助于在類器官和宿主之間建立興奮性和抑制性突觸連接（圖5G, I）。此外，BO-ET-ES組神經(jīng)元突觸棘密度增加（圖5J, K），突觸免疫染色顯示hSYN和PSD95共定位，表明移植物內(nèi)突觸連接增強(qiáng)。晚期刺激顯著促進(jìn)了類器官和宿主之間功能性突觸的形成（圖5L, M）。

（6）后期刺激通過類器官-腦-計(jì)算機(jī)接口改善神經(jīng)功能

研究評(píng)估了類器官與宿主大腦之間的電生理功能連接。在10天刺激期內(nèi)，類器官的尖峰活動(dòng)（包括放電速率、爆發(fā)頻率和爆發(fā)持續(xù)時(shí)間）顯著增加，表明功能發(fā)育增強(qiáng)（圖6B-D），而尖峰振幅保持穩(wěn)定（圖6E）。局部場電位（LFP）測量顯示，類器官中存在從Delta到高Gamma的多頻段振蕩，且BO-ET-ES組在中高頻段（Beta到高Gamma）的振蕩增強(qiáng)更明顯（圖6F-G）。

LFP的連通性和耦合性分析表明，刺激后3個(gè)月，類器官內(nèi)部（自相關(guān)）和類器官與宿主之間（互相關(guān)）的相關(guān)性顯著增加，且在BO-ET-ES組中更為顯著（圖6H-J）。此外，刺激后10天，BO-ET-ES組中低頻與Gamma活性之間的跨頻相位幅度耦合（PAC）增強(qiáng)，并在3個(gè)月后持續(xù)增加，表明電刺激對神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的長期影響（圖6K）。

在行為測試中，使用von Frey纖維對足底施加機(jī)械刺激，結(jié)果顯示移植物在所有頻段的活動(dòng)增強(qiáng)，特別是在Gamma波段，表明其已整合到S1皮層的功能回路中（圖6L-N）。BO-ET-ES組在刺激過程中高頻帶和Theta-Gamma耦合的能量顯著高于BO-ET組，接近未移植組水平，表明電刺激促進(jìn)了行為功能的恢復(fù)。

圖5 后期刺激通過 OBCI 促進(jìn)類器官與宿主的功能整合。（A）2M 刺激時(shí)間表；（B-E）一天中不同時(shí)間點(diǎn)對體內(nèi)受刺激類器官的電生理學(xué)指標(biāo)定量：（B）放電速率，（C）突發(fā)數(shù)，（D）突發(fā)持續(xù)時(shí)間，（E）尖峰振幅；（F）一天中不同時(shí)間點(diǎn)受刺激類器官在 Gamma 波段的能量；（G）150 dpt 時(shí)功率譜密度；（H-I）從第 60 天開始，每隔約一個(gè)月對體內(nèi)類器官的相關(guān)性進(jìn)行量化：（H）類器官內(nèi)部的自相關(guān)，（I）類器官與宿主之間的互相關(guān)；（J）BO-ET-ES 組在 60、90、120 和 150 dpt 的相關(guān)系數(shù)分布；（K）BO-ET-ES 組在 60、90、120 和 150 dpt 的 PAC 分布；（L-N）各組在 120 和 150 dpt 時(shí)體內(nèi) Gamma 和高 Gamma 總功率百分比以及 Theta-Gamma 偶聯(lián)與基線相比的變化