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針對(duì)上述問(wèn)題，中國(guó)科學(xué)院納米科學(xué)與技術(shù)中心韓東、敖卓團(tuán)隊(duì)開發(fā)了一種由三種天然聚合物（氧化黃芪多糖、羧甲基殼聚糖和甲基丙烯酸化海藻酸鈉）通過(guò)鎂離子交聯(lián)形成的多功能水凝膠體系（OAPS-CMC/SAMA-Mg²⁺，簡(jiǎn)稱OCS），并進(jìn)一步將含有姜黃素的牛膝超分子自組裝體（NX@Cur）整合到該水凝膠中，形成復(fù)合材料OCS/NX@Cur。該水凝膠通過(guò)席夫堿反應(yīng)形成可注射凝膠，適應(yīng)性填充組織缺損，并通過(guò)紫外線交聯(lián)固化與組織緊密結(jié)合。姜黃素通過(guò)薄膜分散技術(shù)負(fù)載到牛膝超組裝體上，隨著水凝膠的降解，姜黃素緩慢釋放到傷口微環(huán)境中，與水凝膠中的天然生物活性成分協(xié)同發(fā)揮抗炎、抗氧化和促進(jìn)血管生成的療效，展現(xiàn)出良好的治療效果。該文章于2025年6月3日以《Astragalus Polysaccharide Hydrogels with Drug-Carrying Super Self-Assembly from Natural Herbs Promote Wound Healing》為題發(fā)表于《ACS NANO》（DOI：10.1021/acsnano.5c03744）。

研究示意圖

(1) NX@Cur的制備與表征

通過(guò)煎煮、離心和凍融處理牛膝藥材得到NX超分子自組裝體（NX SSA），隨后將其與姜黃素溶解于乙醇中，通過(guò)旋涂法得到黃色薄膜，經(jīng)收集和純化后獲得NX@Cur。電位分析表明，NX和NX@Cur的電位均為負(fù)且差異不顯著（圖1B），說(shuō)明負(fù)載姜黃素后整體電負(fù)性未改變。傅里葉變換紅外光譜（FT-IR）顯示，NX@Cur中姜黃素的酚羥基伸縮振動(dòng)峰（3510 cm^-1）消失（圖1C），紫外-可見光譜（UV-vis）中NX@Cur的吸收峰紅移至442 nm（圖1D），表明姜黃素成功負(fù)載于NX SSA。掃描電子顯微鏡（SEM）觀察到NX SSA呈直徑為1.87 ± 0.57 μm的規(guī)則球形，負(fù)載姜黃素后NX@Cur粒徑增加至2.69 ± 0.54 μm（圖1F、G）。X射線衍射（XRD）分析顯示，NX@Cur中姜黃素的特征衍射峰（17 °）消失（圖1E），表明姜黃素由晶體轉(zhuǎn)變?yōu)闊o(wú)定形狀態(tài)。透射電子顯微鏡（TEM）觀察到單個(gè)NX呈直徑約1.5 μm的球形，姜黃素為較大尺寸的晶體形態(tài)（圖1H），而NX@Cur中NX部分呈明亮單圈，姜黃素分布在其周圍時(shí)顏色較暗，且NX@Cur的電子衍射環(huán)幾乎不可見，進(jìn)一步證實(shí)姜黃素的無(wú)定形化。這些結(jié)果表明NX SSA成功抑制了姜黃素的結(jié)晶，增強(qiáng)了其分散性。

圖1.（A）NX@Cur制備的示意圖；（B）載藥前后的電位值；（C）NX、Cur和NX@Cur的紅外光譜；（D）NX、Cur和NX@Cur的紫外光譜；（E）NX、Cur和NX@Cur的X射線衍射圖；（F）NX、Cur和NX@Cur的掃描電鏡圖像（標(biāo)尺：5 μm）；（G）NX和NX@Cur的粒徑分布統(tǒng)計(jì)；（H）NX、Cur和NX@Cur的透射電鏡圖像及電子衍射圖

（2）OCS/NX@Cur水凝膠的合成與表征

交聯(lián)雙網(wǎng)絡(luò)水凝膠OCS（圖2A）通過(guò)混合和紫外光照射兩步制備，具有良好的可注射性、強(qiáng)機(jī)械性能、低膨脹性和適宜的組織黏附性。SEM觀察顯示，負(fù)載藥物前后水凝膠孔徑基本一致，且負(fù)載藥物的水凝膠中可見微米級(jí)NX@Cur（圖2B）。未光交聯(lián)的OCSUV水凝膠具有流動(dòng)性（圖2C），而經(jīng)紫外光交聯(lián)后的OCS水凝膠完全固化，無(wú)流動(dòng)性。OCS水凝膠能牢固黏附器官和皮膚至玻璃表面且不脫落（圖2D），在扭曲或彎曲時(shí)不會(huì)斷裂（圖2E）。其黏附在豬皮上拉伸后的剪切強(qiáng)度為20.94 kPa（圖2F）。流變實(shí)驗(yàn)表明，水凝膠具有剪切變稀特性，黏度隨剪切率增加而降低（圖2G），儲(chǔ)能模量大于損耗模量，且光交聯(lián)固化階段的模量高于可注射水凝膠（圖2H）。壓縮測(cè)試顯示，負(fù)載藥物后水凝膠壓縮強(qiáng)度增加一倍，應(yīng)變從46%增加到50%（圖2I）。膨脹實(shí)驗(yàn)表明，OCS水凝膠膨脹率為73%，OCS/NX@Cur水凝膠膨脹率為58%（圖2J），負(fù)載藥物后膨脹率降低。體外降解實(shí)驗(yàn)中，OCS/NX@Cur水凝膠前5天降解速率更快（圖2K），20天時(shí)OCS和OCS/NX@Cur水凝膠降解率分別為73.96%和71.30%。藥物釋放實(shí)驗(yàn)顯示，第6天時(shí)姜黃素（Cur）、NX@Cur和OCS/NX@Cur的釋放率分別為68.78%、62.29%和52.66%（圖2L），表明NX SSA和OCS負(fù)載可延緩姜黃素釋放。

圖2.（A）OCS/NX@Cur水凝膠制備示意圖；（B）OCS和OCS/NX@Cur水凝膠的掃描電鏡圖像；（C）水凝膠的可注射性演示及兩階段凝膠化光學(xué)圖像；（D）水凝膠黏附于器官或皮膚的照片；（E）黏附于皮膚的水凝膠彎曲、扭曲及拉伸的照片；（F）黏附于豬皮的水凝膠剪切力-距離曲線；（G）OCSUC和OCS水凝膠的黏度-剪切率曲線；（H）OCSUC和OCS水凝膠的模量-角頻率曲線；（I）OCS和OCS/NX@Cur水凝膠的壓縮強(qiáng)度-應(yīng)變曲線；（J）OCS和OCS/NX@Cur水凝膠在不同時(shí)間的溶解率；（K）OCS和OCS/NX@Cur水凝膠在不同時(shí)間的降解率；（L）Cur、NX@Cur和OCS/NX@Cur的藥物釋放曲線

（3）OCS/NX@Cur水凝膠的生物相容性

生物相容性測(cè)試表明，NX@Cur、OCS和OCS/NX@Cur水凝膠具有良好的細(xì)胞相容性和體內(nèi)生物安全性。CCK-8實(shí)驗(yàn)和死活細(xì)胞染色結(jié)果顯示，NX@Cur對(duì)Raw264.7細(xì)胞的適宜濃度范圍為0.5–18.75 μg/mL，超過(guò)37.5 μg/mL會(huì)抑制或殺死細(xì)胞；而對(duì)L929成纖維細(xì)胞，0–75 μg/mL的NX@Cur可保證正常細(xì)胞生長(zhǎng)，超過(guò)150 μg/mL則抑制細(xì)胞生長(zhǎng)（圖3A、B）。死活細(xì)胞染色實(shí)驗(yàn)表明，L929細(xì)胞與OCS或OCS/NX@Cur共孵育1天和5天后，僅觀察到極少量紅色熒光（死細(xì)胞），大部分細(xì)胞正常生長(zhǎng)（綠色）（圖3C），證實(shí)了OCS和OCS/NX@Cur水凝膠良好的細(xì)胞相容性。溶血實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，NX@Cur、OCS和OCS/NX@Cur組的上清液透明澄清，溶血率均低于5%，表明該體系具有優(yōu)異的血液相容性（圖3D）。此外，經(jīng)OCS/NX@Cur處理14天后的SD大鼠器官的蘇木精-伊紅（H&E）染色結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，各器官未見明顯器官腫大或炎癥浸潤(rùn)，證實(shí)了該體系良好的體內(nèi)生物安全性（圖3E）。

圖3.（A）不同濃度NX@Cur處理后Raw 264.7細(xì)胞的存活率；（B）不同濃度NX@Cur處理后成纖維細(xì)胞L929的存活率；（C）L929細(xì)胞與OCS和OCS/NX@Cur水凝膠提取物共孵育1天和5天后的死活熒光染色（標(biāo)尺：100 μm）；（D）NX@Cur、OCS和OCS/NX@Cur水凝膠的溶血率及溶血照片；（E）經(jīng)OCS/NX@Cur水凝膠處理或未處理的大鼠心、肝、脾、肺、腎的蘇木精-伊紅染色（標(biāo)尺：200 μm）

（4）體外抗炎和抗氧化作用

通過(guò)免疫熒光染色對(duì)OCS/NX@Cur治療體系進(jìn)行抗炎活性研究（圖4A）。與空白組相比，LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞中CD11c（M1）表達(dá)顯著升高，表明細(xì)胞炎癥誘導(dǎo)成功。NX@Cur組、OCS組和OCS/NX@Cur組的CD11c（M1）平均熒光強(qiáng)度分別較LPS誘導(dǎo)炎癥的對(duì)照組（16.80%）降低了7.00%、7.44%和8.37%（p < 0.001），而CD206（M2）平均熒光強(qiáng)度分別較對(duì)照組（21.46%）提高了8.98%、8.76%和16.2%（p < 0.001）（圖4B）。統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，這三組均能將巨噬細(xì)胞從M1表型轉(zhuǎn)化為M2表型，顯示出良好的抗炎效果。M2（CD206）/M1（CD11c）值計(jì)算結(jié)果顯示，所有治療組的M2/M1值均顯著高于對(duì)照組（p < 0.01，p < 0.001），且OCS/NX@Cur組的值顯著高于NX@Cur組和OCS組（圖4C），表明NX@Cur和OCS水凝膠的促表型轉(zhuǎn)化效果具有協(xié)同作用，二者整合后在OCS/NX@Cur治療體系中顯示出更強(qiáng)的抗炎能力，促進(jìn)免疫微環(huán)境的平衡調(diào)節(jié)。氧化應(yīng)激由過(guò)量活性氧（ROS）引起，導(dǎo)致持續(xù)炎癥，從而延緩傷口愈合。不同材料與H?O?誘導(dǎo)的L929成纖維細(xì)胞共孵育（設(shè)置空白對(duì)照組），通過(guò)DCFH-DA探針染色檢測(cè)ROS水平（圖4D）。結(jié)果顯示，三組實(shí)驗(yàn)的熒光幾乎消失，與空白組相當(dāng)，表明NX@Cur、OCS水凝膠及OCS/NX@Cur復(fù)合水凝膠均具有較強(qiáng)的清除ROS能力。

圖4.（A）免疫熒光染色圖像（CD11c綠色，CD206紅色）（標(biāo)尺：30 μm）；（B）免疫熒光染色中Raw 264.7細(xì)胞CD11c和CD206表達(dá)的平均熒光強(qiáng)度；（C）免疫熒光染色中M2/M1表達(dá)的相對(duì)值；（D）成纖維細(xì)胞L929中ROS水平的熒光染色圖像（標(biāo)尺：100 μm）

（5）體外細(xì)胞遷移和血管生成效應(yīng)

不同材料對(duì)細(xì)胞遷移能力的影響通過(guò)細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)進(jìn)行評(píng)估（圖5A）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，經(jīng)NX@Cur、OCS凝膠和OCS/NX@Cur處理的細(xì)胞遷移能力顯著高于對(duì)照組。細(xì)胞遷移率的統(tǒng)計(jì)分析表明，隨著時(shí)間增加，各組之間的遷移率差異逐漸顯著（圖5B）。在72小時(shí)時(shí)，NX@Cur和OCS/NX@Cur組的細(xì)胞遷移率分別比對(duì)照組（31.27%）提高了21.35%和24.59%（p < 0.05，p < 0.001），而OCS水凝膠組與對(duì)照組之間無(wú)顯著差異，表明NX@Cur是促進(jìn)細(xì)胞遷移的良好材料。在傷口愈合的增殖階段，新生血管化對(duì)肉芽組織的生長(zhǎng)至關(guān)重要。通過(guò)與人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）共孵育，考察不同材料的促管形成能力（圖5C）。結(jié)果顯示，NX@Cur和OCS/NX@Cur組的管形成效果更為顯著。對(duì)血管節(jié)點(diǎn)數(shù)和總管長(zhǎng)度進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，NX@Cur和OCS/NX@Cur組的節(jié)點(diǎn)數(shù)分別比對(duì)照組增加了1.27倍和0.89倍（圖5D，p < 0.001，p < 0.05），總管長(zhǎng)度分別增加了0.93倍和0.48倍（圖5E，p < 0.001）。

圖5.（A）劃痕實(shí)驗(yàn)評(píng)估與不同材料共孵育后HUVECs的遷移能力（標(biāo)尺：200 μm）；（B）劃痕實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞遷移率定量；（C）與水凝膠提取物共孵育6小時(shí)后HUVECs形成的管狀結(jié)構(gòu)圖像（標(biāo)尺：300 μm）；（D）節(jié)點(diǎn)數(shù)量定量；（E）管狀結(jié)構(gòu)總長(zhǎng)度定量

（6）體內(nèi)皮膚缺損創(chuàng)面愈合效果

建立了體內(nèi)模型以驗(yàn)證OCS/NX@Cur復(fù)合體系的治療效果。分別測(cè)試了對(duì)照組（生理鹽水處理）、NX@Cur組、OCS組和OCS/NX@Cur組。傷口建模和處理的時(shí)間節(jié)點(diǎn)如圖6A所示。在第0、1、3、5、7、10和14天拍攝了大鼠傷口部位的照片（圖6B）。傷口愈合效果進(jìn)行了定量建模（圖6C）。NX@Cur組、OCS組和OCS/NX@Cur組的整體恢復(fù)效果均優(yōu)于對(duì)照組，其中OCS/NX@Cur組效果最佳。統(tǒng)計(jì)分析顯示，第3天時(shí)，OCS/NX@Cur組的傷口收縮率比對(duì)照組高35.92%，達(dá)到51.81%（p < 0.05）（圖6D）。第10天時(shí)，NX@Cur組、OCS組和OCS/NX@Cur組的傷口收縮率分別比對(duì)照組（76.88%）提高了14.90%、11.41%和18.55%（p < 0.01，p < 0.05，p < 0.001），OCS/NX@Cur組的傷口收縮率達(dá)到95.44%。上述結(jié)果表明該治療體系在傷口修復(fù)方向的應(yīng)用具有可行性。

圖6.（A）全層皮膚缺損模型的建立與處理示意圖；（B）不同時(shí)間點(diǎn)傷口的代表性圖片。使用標(biāo)準(zhǔn)金屬定位環(huán)（內(nèi)徑15 mm）進(jìn)行傷口成像，其邊緣提供尺寸參考（標(biāo)尺：5 mm）；（C）傷口面積隨時(shí)間的變化圖；（D）不同治療方案在不同時(shí)間點(diǎn)的傷口收縮率

（7）H&E染色和Masson染色

通過(guò)H&E染色和Masson染色對(duì)傷口組織切片進(jìn)行分析，評(píng)估該治療體系對(duì)傷口愈合的效果。第7天的H&E染色結(jié)果顯示，各組均出現(xiàn)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，但OCS和OCS/NX@Cur水凝膠組的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)少于對(duì)照組（圖7A）。NX@Cur和OCS/NX@Cur組的組織顯示出更多新生血管（藍(lán)色箭頭），而OCS組和對(duì)照組未見顯著新生血管。對(duì)照組的愈合過(guò)程緩慢，第14天的H&E染色圖像顯示仍有殘留結(jié)痂（黃色箭頭）和大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；相比之下，經(jīng)OCS/NX@Cur處理的組織顯示出完整且清晰的表皮層，表明上皮化已完成，且在NX@Cur和OCS/NX@Cur組中可觀察到新生毛囊或腺體（綠色箭頭），而對(duì)照組中未見。

第7天的Masson染色結(jié)果顯示，OCS/NX@Cur組的傷口邊緣顯示出顯著的傷口收縮效果（黑色箭頭），優(yōu)于其他三組（圖7B）。第14天時(shí)，所有組的膠原纖維均顯著增加，但OCS/NX@Cur組的膠原沉積更為致密且排列有序，進(jìn)一步證實(shí)了該治療方案的有效愈合能力。在傷口愈合過(guò)程中，成纖維細(xì)胞逐漸合成膠原蛋白并轉(zhuǎn)化為不同的結(jié)晶原纖維形式。傷口愈合早期以Ⅲ型膠原蛋白為主，隨著細(xì)胞增殖和組織重塑，Ⅰ型膠原蛋白逐漸沉積。膠原蛋白沉積在傷口收縮和瘢痕形成中起決定性作用，已成為傷口愈合質(zhì)量的重要指標(biāo)。

圖7. (A)第7天和第14天傷口組織的H&E染色。（比尺：200 μm） (B)第7天、第14天創(chuàng)面組織Masson染色。（標(biāo)尺：200 μm）

（8）體內(nèi)皮膚缺損創(chuàng)面愈合效果

通過(guò)偏振光顯微鏡觀察Sirius紅染色后的傷口組織，分析不同時(shí)間點(diǎn)膠原蛋白類型的分布。第7天，各組均顯示出較少且排列不規(guī)則的混合膠原蛋白纖維（圖8A）。定量分析顯示，OCS/NX@Cur組的Ⅲ型膠原蛋白（綠色）沉積面積比對(duì)照組（20.32%）減少了12.56%（p < 0.05）（圖8B），而NX@Cur和OCS/NX@Cur處理后Ⅰ型膠原蛋白（橙色）沉積量分別增加了7.07%和9.00%（p < 0.05）（圖8C）。從第7天到第14天，Ⅲ型膠原蛋白沉積減少，Ⅰ型膠原蛋白沉積增加（圖8A），與傷口愈合過(guò)程一致。數(shù)據(jù)顯示，Ⅰ型/Ⅲ型膠原蛋白比率與炎癥因子M2/M1比率呈顯著正相關(guān)（r2 = 0.83）。OCS/NX@Cur組的Ⅰ型/Ⅲ型膠原蛋白比率（1.74）顯著高于對(duì)照組（0.22，p < 0.01），且巨噬細(xì)胞M2/M1表達(dá)水平更高（29.37 vs 2.04，p < 0.01）。

第14天時(shí)，OCS/NX@Cur組顯示出類似健康皮膚的致密且規(guī)則的成熟Ⅰ型膠原纖維，NX@Cur組也表現(xiàn)出類似現(xiàn)象。與對(duì)照組（11.54%）相比，NX@Cur組和OCS/NX@Cur組的Ⅲ型膠原蛋白沉積量分別減少了4.24%和8.14%（p < 0.05，p < 0.01）（圖8B），而Ⅰ型膠原蛋白沉積量分別增加了13.47%和25.69%（p < 0.05，p < 0.01）（圖8C）。這些結(jié)果表明，OCS/NX@Cur體系對(duì)傷口處膠原蛋白的沉積和組織化具有顯著促進(jìn)作用，NX@Cur在加速膠原蛋白類型轉(zhuǎn)換過(guò)程中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。

圖8.（A）第7天和第14天傷口組織的西瑞紅染色圖像（明場(chǎng)和偏振光顯微鏡）（標(biāo)尺：500 μm）；（B）第7天和第14天傷口組織中Ⅲ型膠原的定量；（C）第7天和第14天傷口組織中Ⅰ型膠原的定量

（9）OCS /NX@Cur的體內(nèi)免疫調(diào)節(jié)和血管生成

NX@Cur、OCS和OCS/NX@Cur組的IL-6和TNF-α表達(dá)水平顯著低于對(duì)照組，其中IL-6相對(duì)表達(dá)水平分別降低了59.50%、86.79%和77.75%（p < 0.01），TNF-α表達(dá)水平分別降低了29.84%、56.65%和59.29%（p < 0.05）。免疫熒光染色結(jié)果顯示，第7天，OCS/NX@Cur組傷口組織中iNOS（紅色）表達(dá)顯著降低，CD206（綠色）表達(dá)顯著增加，iNOS平均熒光強(qiáng)度比對(duì)照組降低了80.49%（p < 0.05）（圖9B），CD206平均熒光強(qiáng)度分別增加了0.85倍、2.01倍和1.63倍（p < 0.001）。M2（CD206）/M1（iNOS）相對(duì)值分析顯示，OCS/NX@Cur組的M2/M1值比對(duì)照組高13.42倍（p < 0.01）（圖9C），表明OCS/NX@Cur體系通過(guò)促進(jìn)巨噬細(xì)胞向M2表型極化，營(yíng)造了抗炎修復(fù)微環(huán)境。免疫組化染色檢測(cè)第7天傷口處CD31的表達(dá)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，NX@Cur和OCS/NX@Cur處理后的組織中新生血管數(shù)量和大小顯著增加（橙色箭頭）（圖9E），CD31表達(dá)水平分別增加了56.86%和89.07%（p < 0.01，p < 0.001）（圖9D），而OCS組與對(duì)照組接近，顯著低于NX@Cur組和OCS/NX@Cur組，表明OCS/NX@Cur體系有利于加速新生血管化。OCS/NX@Cur組CD31標(biāo)記的血管密度增加與M2型巨噬細(xì)胞標(biāo)志物CD206的上調(diào)趨勢(shì)一致，提示M2型巨噬細(xì)胞可能通過(guò)分泌VEGF等生長(zhǎng)因子促進(jìn)新生血管化。

圖9.（A）第7天傷口組織中iNOS和CD206的免疫熒光染色圖像（標(biāo)尺：100 μm）；（B）免疫熒光染色中iNOS和CD206表達(dá)的平均熒光強(qiáng)度；（C）免疫熒光染色中M2/M1表達(dá)的相對(duì)值；（D）免疫組化染色中CD31表達(dá)的相對(duì)覆蓋面積半定量分析；（E）第7天傷口組織的CD31免疫組化染色圖像（標(biāo)尺：100 μm）