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針對(duì)以上問(wèn)題，國(guó)立清華大學(xué)Eric Hwang、朱麗安和胡尚秀教授團(tuán)隊(duì)提出了一種原位磁電生成針對(duì)miR6236的海綿（miS）和通過(guò)導(dǎo)電顆粒支架（cGRAS）進(jìn)行無(wú)線電刺激的策略，用于TBI中的神經(jīng)再生。cGRAS由帶正電的聚乙胺（PEI）/MXene（MX）和帶負(fù)電的微珠組成，可以促進(jìn)miRNA海綿的形成和三維多孔支架的構(gòu)建。在外置交變磁場(chǎng)（AMF）照射下，“電磁信使”誘導(dǎo)電刺激以恢復(fù)大腦功能，并促進(jìn)時(shí)間電穿孔。這種機(jī)制結(jié)合cGRAS的機(jī)械轉(zhuǎn)導(dǎo)效應(yīng)，增強(qiáng)了體內(nèi)基因輸送，用于形成miRNA海綿，有效減少了miR-6263的過(guò)表達(dá)，miR-6263是與神經(jīng)損傷相關(guān)的凋亡和炎癥通路中的關(guān)鍵介質(zhì)。這種策略減少了炎癥，促進(jìn)了新生神經(jīng)元向受損區(qū)域的浸潤(rùn)，并恢復(fù)了多巴胺神經(jīng)傳遞。此外，它還促進(jìn)了血管生成。這些通過(guò)原位磁電miRNA海綿形成和無(wú)線電刺激實(shí)現(xiàn)的結(jié)果，改善了大腦功能和行為恢復(fù)。因此，cGRAS代表了一種潛在的變革性和多功能工具，用于臨床神經(jīng)再生工程應(yīng)用。該文章于2025年5月29日以《In Situ Magnetoelectric Generation of miRNA Sponges and Wireless Electric Stimulus by Conductive Granular Scaffolds for Nerve Regeneration》為題發(fā)表于《Advanced Material》（DOI: 10.1002/adma.202500650）。

圖1 miS@cGRAS的表征。（a）miS@cGRAS結(jié)構(gòu)的示意圖，其由包裹PEI-MX納米片和pDNA（miR6236靶向海綿）的可注射微珠構(gòu)成；（b）注入TBI傷口后的miS@cGRAS在AMF刺激下，通過(guò)水凝膠的機(jī)械應(yīng)力信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)靶向、按需遞送核酸藥物和電子轉(zhuǎn)移，促進(jìn)TBI治療中的血管生成、神經(jīng)再生和功能恢復(fù)

（1）PEI-MX的合成與表征

該 cGRAS 通過(guò)將載有 miRNA 海綿的電磁 PEI - MX 涂覆于明膠微珠制備而成。MX 采用蝕刻劑插層剝離法制備，從 MAX 相前驅(qū)體選擇性去除 A 層得到多層 MX。隨后，帶正電的 PEI 與帶負(fù)電且表面含活性基團(tuán)的 MX 結(jié)合，通過(guò)靜電吸附和氫鍵作用形成 PEI-MX 復(fù)合物，其構(gòu)成致密聚氫鍵網(wǎng)絡(luò)，增強(qiáng)材料機(jī)械強(qiáng)度并作為非病毒基因遞送系統(tǒng)。SEM 圖像顯示 MX 和 PEI - MX 納米片層厚約 2.5nm，PEI - MX 層間距更大；TEM 圖像中 PEI - MX 表面有聚合物殼；EDS 分析表明 PEI - MX 含 Ti、N 元素，MX 幾乎不含 Al 元素（圖 2a - e）。XRD 分析顯示 PEI 的引入使 PEI - MX 的 2θ 值減小，d 間距增大，且 MX 晶格結(jié)構(gòu)和片層取向發(fā)生輕微變化（圖 2f）。HRXPS 分析發(fā)現(xiàn)，Ti 2p 光譜顯示 MX 和 PEI - MX 的特征峰，PEI - MX 的 C 1s 光譜出現(xiàn) C - N 鍵，N 1s 光譜出現(xiàn)季氮和N - Ti 鍵，證實(shí) PEI 與 MX 成功結(jié)合形成 N - Ti 鍵（圖 2g、h）。在細(xì)胞膜通透性研究中，以 DAPI 為標(biāo)志物，通過(guò) CLSM 分析發(fā)現(xiàn)，PEI - MX 因其正電荷與細(xì)胞膜負(fù)組分的靜電相互作用，較 MX 顯示更強(qiáng) DAPI 信號(hào)，經(jīng) AMF 刺激后，細(xì)胞膜破壞更顯著，可能是原位電穿孔作用所致（圖 2i）。DNA 結(jié)合實(shí)驗(yàn)表明，PEI - MX 的 DNA 結(jié)合能力隨 PEI - MX/DNA 比例升高而增強(qiáng)，且僅 PEI 涂層納米粒因靜電吸引顯示出強(qiáng) DNA 結(jié)合力；其形貌在 miR6236 海綿修飾后無(wú)明顯變化（圖 2j）。

圖2 MXene（MX）和 PEI-MX 的合成和表征。a、B）MX 和 PEI-MX 合成的示意圖。c）MX 和 PEI-MX 的 SEM 圖像。d）MX 和 PEI-MX 的 TEM 圖像。e）MX 和 PEI-MX 的 EDS 映射。f）MX 和 PEI-MX 的 XRD 分析。g，h）MX 和 PEI-MX 的高分辨率 X 射線光電子能譜。i）顯示在 AMF 照射下膜破裂和增加的滲透性的代表性圖像。DAPI 染色細(xì)胞核，而鈣黃綠素-AM 表示活細(xì)胞。j）PEI-MX 的 DNA 結(jié)合能力

（2）cGRAS 的制備和表征

使用微流控芯片制備 cGRAS 核心部分，即單分散微珠（MB）。將 GelMA 溶液（水相）與甲基丙烯酰氯酐（MA）反應(yīng)，制得 GelMA，其取代度（DS）約為 85%。在 T 形微流控連接處，GelMA 溶液形成層流，被油相剪切形成水包油乳液。液滴經(jīng)毛細(xì)管并在紫外線（365 nm，1500 系列，OmniCure）照射下交聯(lián)成微凝膠（圖 3a）。得到的 MB 在明視野顯微鏡下呈現(xiàn)均勻的尺寸、圓形形狀和光滑表面（圖 3b）。PEI-MX 涂覆后，微凝膠表面變黑且粗糙（圖 3c、f），CLSM 圖像顯示滴液外表面有明顯的導(dǎo)電涂層殼（圖 3c、f），表明成功吸附了納米顆粒。與未涂覆的 MB 相比，PEI - MX 涂覆的 MB 或 miS@PEI - MX 涂覆的 MB 表面粗糙（圖 3g - i），表明 miS/PEI - MX 在 MB 表面致密均勻結(jié)合，可能利于 AMF 照射后的電刺激以促進(jìn)神經(jīng)再生。miS@cGRAS 的平均直徑約為 150 μm（圖 3j），適合注射且對(duì)組織再生理想。通過(guò)在含膠原酶的條件下進(jìn)行降解實(shí)驗(yàn)評(píng)估其穩(wěn)定性，結(jié)果顯示其可生物降解（圖 3k）。測(cè)量了大塊微凝膠表面的孔隙率（圖 3l），表明 cGRAS 內(nèi)有相互連接的通道。此外，miS@cGRAS 在水溶液中表現(xiàn)出輕微的溶脹和分散能力（圖 3m）。對(duì) miS@cGRAS 施加 AMF 刺激以產(chǎn)生電流，通過(guò)微凝膠相互連接網(wǎng)絡(luò)內(nèi)的電子轉(zhuǎn)移改善基因傳遞和神經(jīng)分化（圖 3n、o）。將 cGRAS 放置在 FTO 基底上并暴露于 AMF 下，結(jié)果證明可按需產(chǎn)生電流（圖 3o），確認(rèn)導(dǎo)電材料在誘導(dǎo)電流方面的有效性。cGRAS 的流變和自修復(fù)性能歸因于非共價(jià)顆粒間鍵的可逆性。隨著時(shí)間的推移，cGRAS 可聚集成大塊凝膠，形成更硬的水凝膠并增加內(nèi)部交聯(lián)密度（圖 3p）。cGRAS 在外部機(jī)械應(yīng)力下保持結(jié)構(gòu)完整性的能力至關(guān)重要，可確保水凝膠的功能性和耐用性。如圖 3q 所示，大塊 cGRAS 凝膠在承受機(jī)械切割力并經(jīng)紫外線交聯(lián)后可恢復(fù)原始形狀，還可重塑成其他形狀。

關(guān)于生物材料與腦組織之間的生物屏障和支架整合，材料的儲(chǔ)能模量（G'）至關(guān)重要，因其顯著影響組織-材料相容性。MB、cGRAS 和 miS@cGRAS 的自修復(fù)性能源于非共價(jià)顆粒間鍵的可逆性，有助于在整合過(guò)程中保持材料完整性，從而在保持支架功能的同時(shí)允許適當(dāng)?shù)募?xì)胞浸潤(rùn)和組織修復(fù)。在施加 100% 應(yīng)變后，MB、cGRAS 和 miS@cGRAS 的儲(chǔ)能模量（G'）和損耗模量（G''）均恢復(fù)到原始值。值得注意的是，由于密集氫鍵網(wǎng)絡(luò)的增強(qiáng)作用，cGRAS 和 miS@cGRAS 的儲(chǔ)能模量（G'）更高，并且表現(xiàn)出凝膠特性（G' > G''）（圖 3r）。這些發(fā)現(xiàn)表明，miS@cGRAS 在機(jī)械力作用下具有強(qiáng)大的自修復(fù)能力和重塑特性，并且這種可適應(yīng)的水凝膠可作為注射生物支架，用于促進(jìn)受傷大腦內(nèi)的細(xì)胞增殖（圖 3s）。

圖3 可注射 miS@cGRAS 的表征。（a） 微珠制備用微流控芯片設(shè)計(jì)；（b） 微珠的明視野圖像；（c - f） 微珠外 PEI - MX 涂層殼的熒光圖像；（g - i） MB、cGRAS 和 miS@cGRAS 的 SEM 圖像；（j） 水包油乳液微珠的直徑；（k） 微珠在 37 °C PBS 中孵育兩周后的降解實(shí)驗(yàn)；（l） 通過(guò)溶劑置換法評(píng)估的孔隙率測(cè)試；（m） 水溶液中的分散能力表明有效釋放核酸藥物的潛力；（n） 外部磁電刺激下微珠的示意圖及檢測(cè)工具；（o） 在間歇應(yīng)用 AMF（3.2 kW 和 1 MHz）下，導(dǎo)電納米復(fù)合材料和微珠凝膠的 I - T 曲線，其中 AMF 以 5 秒激活和 5 秒停用的交替模式循環(huán)；（p） 不同涂層后微珠凝膠的凝膠化；（q） miS@cGRAS 的損傷愈合能力和重塑潛力；（r） 通過(guò)在 37°C 下連續(xù)步進(jìn)應(yīng)變（1% 應(yīng)變 → 100% 應(yīng)變 → 1% 應(yīng)變）測(cè)量，展示微珠凝膠的流變自修復(fù)性能；（s） 可注射 miS@cGRAS 能適應(yīng) TBI 腔

(3) cGRAS 的生物相容性和細(xì)胞毒性

通過(guò)對(duì) PEI 劑量的優(yōu)化，在最小化細(xì)胞毒性與維持高效基因轉(zhuǎn)染之間取得平衡。將 MB、cGRAS 和 miS@cGRAS 與 NIH-3T3 細(xì)胞系（源自小鼠胚胎成纖維細(xì)胞的成纖維細(xì)胞系）及神經(jīng)干細(xì)胞（NSC）共孵育 24 小時(shí)，以評(píng)估其體外細(xì)胞毒性。在 NIH-3T3 細(xì)胞中評(píng)估含 PEI - MX 的 cGRAS 的細(xì)胞毒性，結(jié)果顯示，當(dāng) MX 濃度低于 200 μg mL?1 且 PEI - MX 中的 PEI 濃度低于 1 μg mL?1 時(shí)，無(wú)顯著細(xì)胞毒性，后續(xù)實(shí)驗(yàn)據(jù)此選擇濃度。各種凝膠孵育后，NIH-3T3 細(xì)胞的活性保持在 80% 以上（圖 4a）。CLSM 圖像顯示，MB、cGRAS、miS@cGRAS 和 miS@cGRAS + AMF 與 NIH-3T3 細(xì)胞共孵育 7 天時(shí)細(xì)胞附著良好，表明其良好的生物相容性（圖 4b - e）。這種相容性歸因于生物相容性肽（如 RGD 和 MMPs）具有良好的細(xì)胞親和力。水凝膠的粘附特性使其能夠彌合生物材料表面與細(xì)胞之間的間隙。GelMA 基水凝膠通過(guò)明膠的羥基和胺基與甲基丙烯酸酐反應(yīng)合成，保留了用于細(xì)胞粘附和酶切的生物活性基序。值得注意的是，miS@cGRAS 在不同導(dǎo)電層濃度下，無(wú)論有無(wú) AMF 處理，均展現(xiàn)出良好的生物相容性，即使經(jīng)過(guò)幾分鐘的 AMF 暴露也未顯現(xiàn)顯著毒性。

在 NIH-3T3 細(xì)胞中展現(xiàn)出良好的生物相容性后，還利用從 ED16  Wistar大鼠胚胎收集和分離的 NSCs 來(lái)評(píng)估細(xì)胞活性（圖 4f、g）。明視野圖像捕捉了 miS@cGRAS 與神經(jīng)球共培養(yǎng) 1、3 和 7 天的情況（圖 4h）。第一天，神經(jīng)元開(kāi)始在 miS@cGRAS 上生長(zhǎng)神經(jīng)突起，隨著孵育時(shí)間的延長(zhǎng)，神經(jīng)突起變得更長(zhǎng)，證明了其強(qiáng)大的生物相容性。與對(duì)照組相比，miS@cGRAS 處理組也顯示出明顯的神經(jīng)突起萌發(fā)，表明引入 miS@cGRAS 并未引發(fā)任何不良反應(yīng)（圖 4i）。為了監(jiān)測(cè)神經(jīng)突起的生長(zhǎng)，使用 βIII - 筒蛋白（Tuj1）對(duì)神經(jīng)突起進(jìn)行染色，以在凝膠上可視化它們。培養(yǎng)一周后，神經(jīng)突起在微珠周圍生長(zhǎng)，表明這些材料可以作為合適的生物支架，并在水凝膠表面提供大量的細(xì)胞粘附肽（圖 4k、l）。此外，在 AMF 刺激下，觀察到圍繞 miS@cGRAS 延伸的長(zhǎng)而密集的神經(jīng)突起，表明外部電流的產(chǎn)生可以增強(qiáng)神經(jīng)細(xì)胞的增殖并建立神經(jīng)突起連接（圖 4l、m）。AMF 促進(jìn)神經(jīng)生長(zhǎng)的機(jī)制可以解釋為：外部電刺激能有效傳遞電信號(hào)，促進(jìn)神經(jīng)沖動(dòng)的及時(shí)傳遞，并支持生物信息的交流。此外，非侵入性的無(wú)線遠(yuǎn)端電刺激顯著減少了與神經(jīng)組織的接觸，最小化了通常與植入電極相關(guān)的界面效應(yīng)和炎癥反應(yīng)。

圖4 miS@cGRAS的生物相容性及細(xì)胞毒性。（a）NIH-3T3細(xì)胞與MB、cGRAS及miS@cGRAS共孵育后的細(xì)胞活性；（b-e）NIH-3T3細(xì)胞與不同微珠共培養(yǎng)的共聚焦圖像，AMF照射促進(jìn)細(xì)胞增殖且無(wú)明顯毒性；（f-i）原代培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞實(shí)驗(yàn)時(shí)間表、取材過(guò)程及與miS@cGRAS共培養(yǎng)的明亮視野圖像，顯示微珠上顯著的神經(jīng)突生長(zhǎng)且無(wú)細(xì)胞毒性，其生長(zhǎng)模式與對(duì)照組相似；（j）NSCs與MB、cGRAS及miS@cGRAS共孵育后的細(xì)胞活性；（k-m）NSCs在微珠上的神經(jīng)突生長(zhǎng)示意圖、共聚焦圖像及其神經(jīng)突連接的代表性圖像，顯示微珠培養(yǎng)時(shí)NSCs的強(qiáng)健生長(zhǎng)現(xiàn)象及優(yōu)異的生物相容性

（4）原子力顯微鏡下質(zhì)子海綿效應(yīng)和電穿孔介導(dǎo)的溶酶體逃逸

帶正電的 PEI - MX 通過(guò)質(zhì)子海綿效應(yīng)實(shí)現(xiàn)內(nèi)質(zhì)-溶酶體逃逸，使 miR6236 海綿進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，AMF 刺激結(jié)合質(zhì)子海綿效應(yīng)可增強(qiáng)膜電穿孔，提高基因載體貨物進(jìn)入細(xì)胞的效率（圖 5a）。CLSM 圖像顯示，PEI-MX 因其陽(yáng)離子特性較純MX逃逸效率更高，AMF 應(yīng)用可改變膜電位，增強(qiáng)電穿孔和溶酶體排除，組合方式的溶酶體逃逸效率最高（圖 5b、c）。在體外轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)中，將 miR6236 海綿（miS）應(yīng)用于 cGRAS，miS 配備了兩個(gè)強(qiáng)啟動(dòng)子和雙報(bào)告基因（編碼 d2EGFP 和 mCherry）。miS 通過(guò)靶向在早期受損神經(jīng)微環(huán)境中高豐度的 miR6236 來(lái)促進(jìn)神經(jīng)再生。在 NIH - 3T3 細(xì)胞系中，miS@cGRAS 的轉(zhuǎn)染效率優(yōu)于 ctS@cGRAS，且 AMF 誘導(dǎo)的電穿孔與質(zhì)子海綿效應(yīng)協(xié)同作用可增強(qiáng)轉(zhuǎn)染效率。在原代神經(jīng)元中，miS@cGRAS 處理后，EGFP 表達(dá)降低，表明 miS 成功表達(dá)且 miR6236 與海綿結(jié)合并耗盡 EGFP 表達(dá)（圖 5e、f、g）。流式細(xì)胞儀分析進(jìn)一步確認(rèn)了轉(zhuǎn)染效率。miS@PEI - MX 組的轉(zhuǎn)染效率相較于游離 miS 有所提高，這歸因于轉(zhuǎn)染劑涂層有助于 miS 的高效細(xì)胞內(nèi)遞送（圖 5i、j、k）。此外，AMF 刺激使 ctS@cGRAS 或 miS@cGRAS 的轉(zhuǎn)染效率提高至 1.6 倍（圖 5h），熒光定量數(shù)據(jù)表明 AMF 有效促進(jìn)細(xì)胞對(duì)基因載體的攝取，轉(zhuǎn)染效率提升至 1.36 倍（圖 5h），與熒光強(qiáng)度測(cè)量結(jié)果一致。這些發(fā)現(xiàn)證實(shí)了 miR6236 海綿的功能，表明 miS@PEI - MX 與 AMF 刺激聯(lián)合應(yīng)用有望優(yōu)化基因遞送，推動(dòng)神經(jīng)再生治療的發(fā)展。

圖5 miS@PEI-MX的溶酶體逃逸能力及體內(nèi)轉(zhuǎn)染效果。（a）基因載體載體貨物（miS@PEI-MX）溶酶體逃逸的示意圖；（b-c）共聚焦圖像顯示溶酶體信號(hào)（綠色）與顆粒（紅色）的共定位及Pearson系數(shù)比較量化；（d）通過(guò)無(wú)線電穿孔和機(jī)械力在cGRAS上發(fā)生轉(zhuǎn)染，miS@PEI-MX通過(guò)溶酶體逃逸轉(zhuǎn)錄雙mRNA以表達(dá)功能，mCherry為指示基因，EGFP為目標(biāo)基因用于測(cè)量miR6236水平；（e-f）用對(duì)照海綿（ctS）或miR6236海綿（miS）處理后神經(jīng)元轉(zhuǎn)染信號(hào)的放大CLSM圖像及成功轉(zhuǎn)染miS至神經(jīng)元后的偽彩色基因表達(dá)信號(hào)圖像；（g-i）EGFP/mCherry比值量化分析，流式細(xì)胞術(shù)評(píng)估m(xù)iR6236海綿功能（通過(guò)測(cè)量雙報(bào)告基因表達(dá)水平）及不同納米復(fù)合物配方（對(duì)照、PEI-MX、僅miS、miS@PEI-MX、miS@PEI-MX+AMF）的轉(zhuǎn)染能力；（j-k）流式細(xì)胞術(shù)評(píng)估不同納米復(fù)合物處理細(xì)胞的轉(zhuǎn)染能力及相應(yīng)實(shí)驗(yàn)的平均熒光強(qiáng)度

（5）體外刺激 NSC 分化和功能恢復(fù)

在評(píng)估 NSC 海綿效應(yīng)后，通過(guò) CLSM 圖像評(píng)估了 miS@cGRAS 對(duì) NSC 分化的影響（圖 6a）。AMF 處理組每天使用 3.2 kW 功率、1 MHz 頻率的 AMF 輻照 3 分鐘，直至 NSC 固定。到第 7 天，CLSM 圖像顯示 NSC 分化和神經(jīng)突起生長(zhǎng)明顯（圖 6a）。通過(guò)分析神經(jīng)標(biāo)志物 Tuj1 和膠質(zhì)纖維酸性蛋白（GFAP，星形細(xì)胞標(biāo)志物）的表達(dá)來(lái)評(píng)估分化結(jié)果。與 ctS@cGRAS 相比，miS@cGRAS 處理的 NSC 顯著萌發(fā)，類似于 miRNA 海綿效應(yīng)（圖 6b）。AMF 暴露可有效促進(jìn)神經(jīng)元分化，Tuj1 陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)量顯著增加，但對(duì)星形細(xì)胞分化無(wú)明顯影響（圖 6c）。此外，AMF 刺激促進(jìn) ctS@cGRAS 或 miS@cGRAS 中的神經(jīng)突起延長(zhǎng)，表明實(shí)現(xiàn)了電流誘導(dǎo)的 NSC 神經(jīng)分化（圖 6d）。AMF 誘導(dǎo)的電刺激激活了促進(jìn)神經(jīng)萌發(fā)和神經(jīng)生長(zhǎng)的多條細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路，包括鈣信號(hào)通路、cAMP 和 MAPK 通路，這些通路共同協(xié)調(diào)細(xì)胞反應(yīng)，刺激神經(jīng)萌發(fā)，促進(jìn)神經(jīng)連接形成和突觸可塑性。

鑒于神經(jīng)突起延長(zhǎng)與神經(jīng)再生的密切關(guān)系，降低 miR6236 水平可能有助于增強(qiáng)損傷后的神經(jīng)再生。為了在體外模擬損傷后的環(huán)境，將 NSC 種植在用硫酸軟骨素蛋白多糖（CSPG）包被的表面上（圖 6e），CSPG 在中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后的星形膠質(zhì)細(xì)胞瘢痕中積累。假設(shè) miR6236 會(huì)在 CSPG 抑制性基質(zhì)上積累，耗盡 miR6236 將導(dǎo)致神經(jīng)突起長(zhǎng)度增加。通過(guò)電穿孔將表達(dá) miR6236 海綿的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到 NSC 中，立即進(jìn)行接種，以克服 CSPG 基質(zhì)對(duì)神經(jīng)生成的限制（圖 6g）。轉(zhuǎn)染后，神經(jīng)元在 CSPG 包被的表面上培養(yǎng) 7 天，然后固定并分析以評(píng)估 miR6236 耗盡對(duì)神經(jīng)再生的影響。與未處理組相比，CSPG 表面的 NSC 培養(yǎng)顯示出受損神經(jīng)突起的不健康模式（圖 6f）。預(yù)測(cè)在 CSPG 包被的表面上，表達(dá) miR6236 靶向海綿的神經(jīng)元比表達(dá)對(duì)照海綿的神經(jīng)元延伸出顯著更長(zhǎng)的神經(jīng)突起（圖 6h,i）。CLSM 圖像顯示，對(duì)照海綿組的神經(jīng)突起生長(zhǎng)不連續(xù)且呈珠狀，而 miR6236 海綿組顯示連續(xù)的神經(jīng)突起生長(zhǎng)，支持 miR6236 耗盡增強(qiáng)神經(jīng)再生的觀點(diǎn)。此外，AMF 刺激進(jìn)一步增強(qiáng)了神經(jīng)突起生長(zhǎng)，在對(duì)照海綿組中神經(jīng)突起長(zhǎng)度增加了 1.8 倍，在 miR6236 海綿組中增加了 1.4 倍（圖 6j）。鑒于 miRNA 在脊髓損傷、創(chuàng)傷性腦損傷和中風(fēng)中的新興作用，miR6236 可能在中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后上調(diào)。這些發(fā)現(xiàn)表明，miR6236 耗盡有潛力增強(qiáng)損傷中樞神經(jīng)元的再生。

圖6 TBI動(dòng)物研究。（a）TBI實(shí)驗(yàn)時(shí)間線、處理過(guò)程及犧牲/免疫染色分析示意圖；（b）展示TBI手術(shù)過(guò)程的圖片；（c）體內(nèi)轉(zhuǎn)染過(guò)程及治療后48小時(shí)TBI腔周圍的CLSM圖像，放大圖像顯示綠色熒光（EGFP）相對(duì)于紅色熒光（mCherry）減少，部分細(xì)胞僅顯示mCherry，表明miR6236完全耗盡及EGFP表達(dá)抑制；（d）有無(wú)AMF照射的轉(zhuǎn)染效率量化；（e）TBI生物響應(yīng)總結(jié)及miS@cGRAS治療效果，未處理組出現(xiàn)嚴(yán)重神經(jīng)營(yíng)炎性，miS@cGRAS治療組炎癥減輕、神經(jīng)營(yíng)退因子抑制及神經(jīng)修復(fù)能力增強(qiáng)；（f）傷后7天拍攝的CLSM圖像，顯示損傷部位鄰近區(qū)域的小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞（綠色，Iba1染色）、星形膠質(zhì)細(xì)胞（紫色，GFAP染色）和神經(jīng)絲陽(yáng)性細(xì)胞（黃色，NF200染色），細(xì)胞核呈藍(lán)色，DAPI染色；（g-i）免疫響應(yīng)、瘢痕邊界和NF200浸潤(rùn)面積的定量分析

（6）miS@cGRAS 對(duì) TBI 的體內(nèi)研究

在小鼠 TBI 模型中評(píng)估 miS@cGRAS 的體內(nèi)效應(yīng)。7 周齡雌性 C57BL/6 小鼠每組 5 只，通過(guò)從運(yùn)動(dòng)皮層去除腦組織至 1.5 mm 深度建立損傷模型，miS@cGRAS 在損傷后立即注射到受影響區(qū)域，并在植入后一天開(kāi)始 AMF 刺激直至處死小鼠。結(jié)果顯示，miS@cGRAS 促進(jìn) TBI 中的基因傳遞和轉(zhuǎn)染。植入 miS@cGRAS 并應(yīng)用 AMF 后，治療后 48 小時(shí)的大腦 CLSM 圖像顯示 TBI 腔周圍有強(qiáng)烈的基因表達(dá)（圖 7c）。AMF 暴露 3 分鐘提高了轉(zhuǎn)染效率，從約 18% ±5% 提高到 32% ±5%（圖 7d），表明磁電刺激改善了電穿孔并促進(jìn)了基因貨物進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)。

第 7 天處死的小鼠觀察到傷口的短期變化，分為 5 組：1）假手術(shù)組，2）cGRAS 組，3）ctS@cGRAS 組，4）miS@cGRAS 組，5）miS@cGRAS + AMF 組。miS@cGRAS + AMF 處理后，大腦的炎癥較弱且 TBI 腔較小。IVIS 圖像顯示 TBI 位點(diǎn)的水凝膠植入。miS@cGRAS 治療通過(guò)平衡免疫反應(yīng)、調(diào)節(jié)瘢痕邊界、恢復(fù)神經(jīng)可塑性和保護(hù)大腦完整性，顯示出減輕 TBI 不良影響的潛力（圖 7e）。第 7 天評(píng)估 miS@cGRAS 在促進(jìn)抗炎方面的作用。假手術(shù)組顯示出大量的巨噬細(xì)胞 / 小膠質(zhì)細(xì)胞，而 cGRAS 處理組的 Iba - 1 水平顯著降低，表明 ECM 樣 cGRAS 減少了病變體積和炎癥（圖 7f、g）。與假手術(shù)組相比，cGRAS 和 miS@cGRAS + AMF 處理組的星形膠質(zhì)細(xì)胞更少且排列更松散（圖 7f - h），這可能歸因于微凝膠的微孔結(jié)構(gòu)，有助于細(xì)胞滲透到創(chuàng)傷部位，為再生和愈合創(chuàng)造更有利的環(huán)境。

使用 NF200 標(biāo)記的 CLSM 圖像評(píng)估受累區(qū)域的軸突浸潤(rùn)，虛線標(biāo)示浸潤(rùn)區(qū)域（圖 7f、i）。量化結(jié)果顯示，假手術(shù)組顯示約 15.4% 的 NF200 陽(yáng)性浸潤(rùn)，miS@cGRAS + AMF 組的 NF200 浸潤(rùn)面積進(jìn)一步增加至 36.7%，分別是假手術(shù)組和 miS@cGRAS 組的 2.4 倍和 1.3 倍。術(shù)后 14 天通過(guò) CD31 標(biāo)記評(píng)估血管恢復(fù)，miS@cGRAS + AMF 組顯示出明顯的血管形成，部分血管超過(guò) 100 μm 并在 miS@cGRAS 內(nèi)部通道增殖。這些發(fā)現(xiàn)表明，miS@cGRAS 通過(guò)促進(jìn)神經(jīng)發(fā)生和血管生成，為神經(jīng)損傷后的有效組織再生提供了有利的微環(huán)境。

圖7 TBI動(dòng)物研究。（a）TBI實(shí)驗(yàn)時(shí)間線、處理過(guò)程及犧牲/免疫染色分析示意圖；（b）展示TBI手術(shù)過(guò)程的圖片；（c）體內(nèi)轉(zhuǎn)染過(guò)程及治療后48小時(shí)TBI腔周圍的CLSM圖像，放大圖像顯示綠色熒光（EGFP）相對(duì)于紅色熒光（mCherry）減少，部分細(xì)胞僅顯示mCherry，表明miR6236完全耗盡及EGFP表達(dá)抑制；（d）有無(wú)AMF照射的轉(zhuǎn)染效率量化；（e）TBI生物響應(yīng)總結(jié)及miS@cGRAS治療效果，未處理組出現(xiàn)嚴(yán)重神經(jīng)營(yíng)炎性，miS@cGRAS治療組炎癥減輕、神經(jīng)營(yíng)退因子抑制及神經(jīng)修復(fù)能力增強(qiáng)；（f）傷后7天拍攝的CLSM圖像，顯示損傷部位鄰近區(qū)域的小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞（綠色，Iba1染色）、星形膠質(zhì)細(xì)胞（紫色，GFAP染色）和神經(jīng)絲陽(yáng)性細(xì)胞（黃色，NF200染色），細(xì)胞核呈藍(lán)色，DAPI染色；（g-i）免疫響應(yīng)、瘢痕邊界和NF200浸潤(rùn)面積的定量分析

圖8 TBI后不同治療對(duì)神經(jīng)恢復(fù)的全腦成像分析及行為評(píng)估。（a）未治療TBI與miS@cGRAS有效治療對(duì)比示意圖；（b）不同材料治療TBI的全鼠腦重建3D圖像，突出SMI312（軸突標(biāo)志，綠色）和剩余損傷區(qū)域（橙色）；（c）顯示損傷部位周圍新生軸突纖維再生的圖像，miS@cGRAS+AMF組新生神經(jīng)元密度最高；（d）各組剩余損傷體積和新生軸突體積量化（n=3）；（e）顯示多巴胺神經(jīng)傳遞的全鼠腦3D圖像，酪氨酸羥化酶（TH）染成黃色；（f）miS@cGRAS+AMF組放大圖像顯示TH標(biāo)志及受損側(cè)（紫色）清晰的黑質(zhì)紋狀體纖維束，與正常側(cè)（藍(lán)色）對(duì)比；（g）多巴胺能腦區(qū)TH細(xì)胞密度比較；（h-i）多巴胺能腦區(qū)TH陽(yáng)性細(xì)胞強(qiáng)度和密度量化；（j）紋狀體對(duì)稱性評(píng)估，受損側(cè)（左腦，紫色）和未受損側(cè)（右腦，藍(lán)色）；（k）創(chuàng)傷周邊區(qū)域血管成像的凝集素染色腦圖像；（l-n）血管長(zhǎng)度、表面積和分支量化

（7）miS@cGRAS 處理后全腦中的新生神經(jīng)元

腦損傷（TBI）會(huì)延長(zhǎng)炎癥反應(yīng)，促進(jìn)miR6236富集，并降低大腦中的多巴胺神經(jīng)傳遞（圖8a）。研究使用3D全鼠腦清除和免疫染色技術(shù)，發(fā)現(xiàn)miS@cGRAS與AMF聯(lián)合治療顯著減少殘留損傷體積，增強(qiáng)神經(jīng)再生，表現(xiàn)為SMI312標(biāo)記的新神經(jīng)元數(shù)量最多（圖8b,d）。神經(jīng)纖維向損傷部位延伸，AMF照射進(jìn)一步促進(jìn)神經(jīng)再生和組織修復(fù)。治療后新生神經(jīng)元區(qū)域顯著增加，形成密集的神經(jīng)纖維網(wǎng)絡(luò)，歸因于miR6236的下調(diào)。外部渦流場(chǎng)的應(yīng)用使新生神經(jīng)元體積比對(duì)照組增加3.63倍，比單獨(dú)miS@cGRAS治療增加1.33倍，顯示協(xié)同促進(jìn)神經(jīng)發(fā)生和組織修復(fù)的潛力。

在多巴胺神經(jīng)傳遞方面，通過(guò)分析酪氨酸羥化酶（TH）的分布和活性，發(fā)現(xiàn)miS@cGRAS+AMF組的TH強(qiáng)度在黑質(zhì)和黑質(zhì)紋狀體纖維束中顯著高于其他組（圖8i），表明治療刺激了多巴胺合成。該組黑質(zhì)紋狀體纖維束大小幾乎對(duì)稱，紋狀體形態(tài)對(duì)稱性恢復(fù)，左右腦平衡改善（圖8j）。此外，miS@cGRAS+AMF治療使創(chuàng)傷周邊區(qū)域血管生成增加約128%（圖8k,l,n），增強(qiáng)組織修復(fù)和恢復(fù)。

行為測(cè)試顯示，miS@cGRAS+AMF組在圓柱測(cè)試、網(wǎng)格測(cè)試和生面條測(cè)試中表現(xiàn)最佳，表明運(yùn)動(dòng)功能和精細(xì)動(dòng)作技能恢復(fù)。生物可降解性和H&E染色評(píng)估表明，水凝膠植入物在14天內(nèi)降解，無(wú)毒性副產(chǎn)物，具有良好的生物相容性。