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為此，重慶醫(yī)科大學劉國棟主任、重慶大學蔡開勇教授和漆超副教授研究開發(fā)了一種新型自體納米疫苗，通過免疫原性多米諾效應將免疫抑制性微環(huán)境轉化為活躍的免疫景觀，從而靶向殘余腫瘤細胞并預防GBM復發(fā)。該納米疫苗通過將脂多糖（LPS）和膠質母細胞瘤細胞裂解物（GCL）共載入層狀雙氫氧化物（LDH）納米片中制成，隨后將其整合到可注射的海藻酸水凝膠中，形成LLGA-Gel。該納米疫苗利用GCL的免疫原性潛力以及LPS的免疫刺激特性，誘導細胞焦亡性細胞死亡，增強樹突狀細胞成熟，并促進巨噬細胞向M1表型極化；這些效應最終導致腫瘤部位CD8+T細胞浸潤增加和Foxp3+Treg細胞減少。體內(nèi)實驗表明，這種納米疫苗不僅增強了免疫原性細胞死亡的療效，而且顯著增強了免疫反應，從而顯著降低了同種異體GBM的術后復發(fā)。這項研究強調了納米技術增強的免疫療法在開發(fā)針對GBM的有效納米疫苗方面的前景。該文章于2025年2月3日以《Autologous Nanovaccine Induces Immunogenic Domino Effect to Prevent Postoperative Recurrence of Orthotopic Glioblastoma》為題發(fā)表于《Advanced Functional Materials》（DOI：10.1002/adfm.202412040）。

研究示意圖

（1）納米疫苗的制備與表征

采用水熱法合成的MgAl-LDH納米片為六邊形薄片，直徑約200 nm（SEM，圖2A；TEM，圖2B）。元素映射（圖2B）和XPS（圖2D）證實其主要元素為Al、Mg、O，且均勻分布。AFM（圖2C）分析顯示其厚度約4 nm。脂多糖的紫外-可見吸收光譜在259 nm處有特征峰，加載后顯著降低（圖2E），F(xiàn)T-IR光譜在≈2350 cm?1處有特征峰，LDH-LPS中保留（圖2F），表明脂多糖成功加載。Zeta電位測試（圖2G）顯示LDH納米片在水中帶弱負電荷，加載LPS后負電荷顯著增加，用GCL包覆后LLG的Zeta電位逆轉至≈+13 mV。Bradford蛋白質測定法用于測量GCL的包封效率。XRD圖譜（圖2H）顯示LLG的衍射峰與LDH相似，與氫氧化鎂鋁的標準卡片特征峰一致（PDF#35-0965，Mg?Al?(OH)??·4.5H?O），說明LPS和GCL的加載對LDH的結晶無影響。

圖1 MgAl-LDH的表征。（A）代表性掃描電子顯微鏡（SEM）圖像；（B）透射電子顯微鏡（TEM）圖像和MgAl-LDH的元素映射；（C）原子力顯微鏡（AFM）圖像和MgAl-LDH納米片在兩個不同視角下的厚度；（D）LDH的X射線光電子能譜（XPS）分析；（E）LPS加載前后的紫外-可見光譜；（F）LDH、LPS和LDH-LPS的傅里葉變換紅外光譜（FT-IR）；（G）LDH、LDH-LPS和LLG的Zeta電位測量（n=3）；（H）LDH、LLG和標準鎂鋁氫氧化物卡片（PDF#35-0965，Mg?Al?(OH)??·4.5H?O）的X射線衍射（XRD）圖譜

（2）細胞焦亡與LLG納米疫苗的抗腫瘤效果和免疫原性細胞死亡（ICD）機制

前期研究已證實LPS可啟動炎癥小體形成，炎癥小體激活caspase-1，進而切割gasdermin D（GSDMD），其N端片段轉移到細胞膜形成孔洞，導致細胞腫脹、裂解，引發(fā)細胞焦亡。本研究旨在驗證LLG納米疫苗的體外抗腫瘤效果。選用GL261膠質瘤細胞為腫瘤細胞模型，HT22神經(jīng)元細胞為正常細胞模型，采用CCK-8試劑盒評估LLG的細胞毒性及生物安全性。結果顯示，LPS對GL261細胞的細胞毒性呈濃度依賴性，LDH加載后增強（圖3A）。LLG處理后，GSDMD切割水平升高，N端帶增加（圖3B），這源于LDH促進GL261細胞對LPS的攝取，GCL的加載進一步增強此作用（圖3D、E）。因此，LLG在相同濃度下抗腫瘤效果最佳。Caspase-1抑制劑Z-VAD-FMK顯著增加細胞存活率（圖3C），證實caspase-1介導的GSDMD激活是細胞焦亡的關鍵。此外，LLG在80 μg/mL濃度下對HT22神經(jīng)元細胞無明顯細胞毒性（圖3A），因其攝取量低（圖S4A、B，支持信息）。這表明LLG納米疫苗可選擇性靶向并消除腫瘤細胞，而不影響正常神經(jīng)細胞，最大限度地提高治療效果并減少對健康腦組織的損害。

細胞焦亡以細胞腫脹、細胞膜破裂為特征，釋放細胞內(nèi)容物激活炎癥反應，被視為免疫原性細胞死亡（ICD）。推測LPS誘導的細胞焦亡可促進GL261細胞釋放抗原物質，激活腫瘤免疫原性。ICD的標志包括細胞表面鈣網(wǎng)蛋白（CRT）外翻、ATP分泌和高遷移率族蛋白B1（HMGB1）釋放。LLG處理后，GL261細胞表面CRT信號最強（圖3F、G），而其他組信號較低。ATP和HMGB1水平在各治療組均升高，LLG處理效果最顯著（圖3I、J）。HMGB1的免疫熒光染色顯示其從細胞核到細胞質的轉位及細胞外釋放（圖3H）。這些結果表明LLG通過攜帶腫瘤裂解物，觸發(fā)廣泛的抗原釋放，增強免疫原性。

圖2（A）不同樣本處理24小時后GL261和HT22細胞的存活率（n=3）；（B）GL261細胞的GSDMD和β-ACTIN的Western blot分析；（C）GL261細胞存活率（24小時，有無Z-VAD-FMK，n=3）；（D）GL261細胞與LDH和LDH-GCL共孵育4小時的CLSM圖像（Cy5.5標記，DAPI染色）；（E）GL261和HT22細胞與LDH和LDH-GCL共孵育4小時的流式細胞術分析；（F）GL261細胞中CRT分布的CLSM圖像（LDH、LPS、LDH-LPS和LLG處理）；（G）GL261細胞CRT暴露的流式細胞術定量分析（n=3）；（H）GL261細胞內(nèi)HMGB1分布的CLSM圖像（LDH、LPS、LDH-LPS和LLG處理）；（I）GL261細胞HMGB1釋放譜（n=3）；（J）GL261細胞細胞外ATP分泌（n=3）

（3）LLG促進DCs成熟和巨噬細胞極化

DCs和巨噬細胞對LDH-GCL的攝取顯著增加（圖4A）。與單獨的LDH相比，LLG處理組中M1型巨噬細胞數(shù)量顯著增加（圖4B）。LLG處理組中M2型巨噬細胞數(shù)量處于最低水平（圖4C）。LLG處理組中M1型巨噬細胞的極化效果顯著（圖4D）。在抗原共存條件下，LLG組中CD80和CD86雙陽性DC的數(shù)量超過其他組（圖4E）。LLG處理組中M1型巨噬細胞的極化效果顯著（圖4F）。LLG處理組中M2型巨噬細胞數(shù)量處于最低水平（圖4G）。LLG處理組中CD80和CD86雙陽性DC的數(shù)量超過其他組，表明LLG具有最佳的DC促成熟功能（圖4H）。

圖3（A）流式細胞術分析游離LDH和LDH-GCL在RAW264.7細胞（左）和DC2.4細胞（右）中的細胞攝??；（B）使用游離LDH和LDH-GCL培養(yǎng)的RAW264.7細胞、DC2.4細胞的細胞吞噬定量分析（n=3）；（C，D）不同材料處理后RAW264.7細胞中M1巨噬細胞（CD11b?CD86?，C）和M2巨噬細胞（CD11b?CD206?，D）的流式細胞術分析；（E）與不同材料預處理的膠質瘤細胞共培養(yǎng)后DC成熟度的流式細胞術分析；（F，G）RAW264.7細胞中M1巨噬細胞（F）和M2巨噬細胞（G）的相對定量（n=3）；（H）與預處理的GL261共培養(yǎng)后成熟的DC2.4的相對定量（n=3）

（4）評估同種異體GBM術后復發(fā)的預防

為了將LLG納米疫苗錨定在腫瘤部位，以實現(xiàn)腫瘤疫苗和免疫佐劑的持續(xù)緩慢釋放，該研究將LLG嵌入Alg-Gel構建LLGA-Gel藥物儲存庫。Alg-Gel和LLGA-Gel均具有均勻且完整的多孔結構。LLGA-Gel在手術切除后第33天對GBM術后復發(fā)的抑制作用最強（圖5C、D）。與對照組相比，LA-Gel和LLA-Gel對腫瘤復發(fā)有一定抑制作用，LLGA-Gel抑制作用最強（圖5E）。LLGA-Gel治療組的腦切片中幾乎不存在惡性腫瘤細胞（圖5F）。LLGA-Gel組的TUNEL染色顯示廣泛的DNA斷裂和細胞死亡（圖5G）。LLGA-Gel組小鼠的中位生存時間延長至103天，對照組為31天（圖5H）。除對照組外，治療過程中小鼠體重無顯著變化（圖5I）。LLGA-Gel組未觀察到肝腎功能指標差異和主要器官嚴重損傷。

圖4（A）實驗設計示意圖；（B）腫瘤接種后第12天手術切除，黃色圓圈表示顱內(nèi)骨窗定位點；（C）手術后各組小鼠膠質瘤生物發(fā)光信號強度量化（n=3）；（D）不同治療方法手術后膠質瘤小鼠的代表性生物發(fā)光圖像（n=3）；（E）不同水凝膠治療后小鼠的T?加權磁共振成像（T? W-MRI）圖像，黃色圓圈指向腫瘤組織；（F，G）手術后33天各組小鼠腦組織切片的H&E和TUNEL染色；（H）不同治療方法手術后膠質瘤小鼠的生存曲線（n=8）；（I）手術后各組小鼠體重評估（n=8）

（5）LLGA-Gel在體內(nèi)誘導抗腫瘤免疫反應的療效

脾臟中CD4+和CD8+ T細胞顯著增加（圖6A、C），F(xiàn)oxp3+/CD4+ Treg細胞減少（圖6B、D）。在LLGA-Gel處理的腫瘤組織中，CD8細胞毒性T細胞和CD4 T細胞浸潤顯著增加（圖6E），F(xiàn)oxp3 Treg細胞減少（圖6F）。LLGA-Gel治療后，腫瘤組織中M1型巨噬細胞顯著增加（圖6G、J），M2型巨噬細胞減少（圖6K），成熟DCs標志物CD80和CD86在總DCs中的表達增強（圖6G）。此外，LLGA-Gel治療顯著降低了IL-10和IL-12水平，同時增加了IFN-γ和TNF-α水平（圖6I）。

圖5（A）術后小鼠脾臟組織中CD3?CD8?和CD3?CD4? T細胞百分比的代表性流式細胞術分析（n=3）；（B）術后小鼠脾臟組織中CD3?CD4?Foxp3? T細胞百分比的流式細胞術分析（n=3）；（C）各組小鼠術后脾臟組織中CD3?CD8? T細胞比例（n=3）；（D）各組小鼠脾臟組織中CD3?CD4?Foxp3? Tregs數(shù)量定量分析（n=3）；（E，F(xiàn)）腫瘤中CD8? T細胞（E）和Foxp3? Tregs（F）浸潤的免疫熒光檢測；（G，H）不同藥物治療后腫瘤組織中成熟樹突狀細胞百分比的流式細胞術分析（G）和定量分析（H，n=3）；（I）不同治療后腫瘤組織中IL-10、IL-12、IFN-γ和TNF-α的標準化相對表達水平熱圖；（J，K）不同治療組腫瘤組織中巨噬細胞M2（J）和M1（K）的免疫熒光圖像