惠民福利国产精品午夜一级毛片精品_高清无码操逼免费观看的毛片_惠民福利国产又色又爽又黄的在线观看_91精品久久久久中文字幕_99免费视频在线_欧洲熟妇AV一级_日本不卡在线视频二区三区_嗯…啊摸湿奶头免费视频_国产精品免费观看无遮挡_少妇宾馆粉嫩10p

針對(duì)上述問(wèn)題，上海大學(xué)陳雨教授團(tuán)隊(duì)研究開(kāi)發(fā)了一種新型的CZALO納米脂質(zhì)體，旨在同時(shí)解決動(dòng)脈粥樣硬化的多種病理機(jī)制。骨橋蛋白（OPN）修飾的納米脂質(zhì)體（CZALO），其包含L-精氨酸（L-Arg）和氧化鈰-氧化鋯納米顆粒（CZ NPs）。在炎癥驅(qū)動(dòng)的靶向和OPN介導(dǎo)的內(nèi)吞作用后，從CZALO納米脂質(zhì)體中釋放的CZ NPs通過(guò)模擬多種天然酶（包括超氧化物歧化酶（SOD）、過(guò)氧化氫酶（CAT）、過(guò)氧化物酶（POD）和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GPx））顯著清除ROS，從而抑制膽固醇攝取，促進(jìn)巨噬細(xì)胞表型轉(zhuǎn)變并抑制炎性細(xì)胞因子的分泌，實(shí)現(xiàn)抗氧化和抗炎效果。巨噬細(xì)胞中過(guò)表達(dá)的一氧化氮合酶（NOS）選擇性地催化L-精氨酸原位轉(zhuǎn)化為一氧化氮（NO），從而實(shí)現(xiàn)NO在炎癥部位的精確釋放。NO擴(kuò)散到內(nèi)皮細(xì)胞中后，通過(guò)調(diào)節(jié)衰老相關(guān)分泌表型（SASP）因子的分泌、改善溶酶體功能、打破細(xì)胞周期停滯和減少衰老內(nèi)皮細(xì)胞中的DNA損傷，從而發(fā)揮良好的抗衰老效果。CZALO納米脂質(zhì)體介導(dǎo)的“一石二鳥(niǎo)”抗氧化和抗衰老治療策略在體內(nèi)外均顯示出良好的抗動(dòng)脈粥樣硬化效果，有效減輕動(dòng)脈粥樣硬化負(fù)擔(dān)，且毒性最小。該文章于2025年02月20日以《Macrophage-targeting Antisenescence nanomedicine enables in-Situ NO induction for Gaseous and antioxidative atherosclerosis intervention》為題發(fā)表于《Bioactive Materials》（DOI：10.1016/j.bioactmat.2025.02.025）。

圖1 CZALO納米脂質(zhì)體用于動(dòng)脈粥樣硬化治療的策略示意圖。（a）CZALO納米脂質(zhì)體的合成路線；（b）在OPN介導(dǎo)的主動(dòng)靶向和巨噬細(xì)胞內(nèi)化后，CZALO納米脂質(zhì)體釋放的CZ NPs表現(xiàn)出SOD/CAT/POD/GPx樣活性，有效抑制ROS，抑制膽固醇攝取并重編程巨噬細(xì)胞表型；（c）L-Arg在巨噬細(xì)胞內(nèi)被過(guò)表達(dá)的NOS催化生成NO氣體，NO氣體擴(kuò)散至內(nèi)皮細(xì)胞，通過(guò)打破細(xì)胞周期阻滯、減輕DNA損傷、降低脂褐素和SASP含量、清除ROS等發(fā)揮抗衰老作用

（1）CZALO納米脂質(zhì)體的合成與表征

使用非水解溶膠-凝膠法合成Zr ⁴⁺摻雜的二氧化鈰納米顆粒，即CZ NP（圖2a）。通過(guò)透射電子顯微鏡（TEM）圖像顯示，所制備的CZ NPs具有均勻的形態(tài)和離散的分布（圖2b）。元素分布圖和X射線光電子能譜（XPS）分析表明，合成的CZ NPs同時(shí)含有鈰和鋯成分（圖2c）。XPS譜圖證實(shí)了Ce³?和Ce⁴?在元素中的共存，賦予了其類(lèi)酶活性和ROS清除能力（圖2d）。X射線衍射（XRD）分析確認(rèn)了CZ NPs的晶相，驗(yàn)證了其成功合成（圖2e）。如圖2f所示，CZ NPs表現(xiàn)出良好的SOD樣活性，并以濃度依賴(lài)性方式顯著降低O₂^-?含量。CZ NPs催化H₂O₂的分解，同時(shí)將無(wú)色的TMB氧化為藍(lán)色的氧化TMB（ox TMB）。結(jié)果表明，CZ NPs在濃度和時(shí)間依賴(lài)性方面表現(xiàn)出明顯的類(lèi)POD模擬活性(圖2g)。除了POD，過(guò)氧化氫酶（CAT）能夠催化H₂O₂轉(zhuǎn)化為H₂O和O₂（圖2 h）。谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GPx）對(duì)于維持細(xì)胞氧化還原平衡和保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷至關(guān)重要。在谷胱甘肽（GSH）存在下，GPx催化H₂O₂還原為H₂O。同時(shí)，谷胱甘肽還原酶（GR）利用NADPH作為電子供體，將氧化型谷胱甘肽（GSSG）還原為還原型GSH，從而恢復(fù)其抗氧化能力并維持細(xì)胞內(nèi)GSH/GSSG氧化還原平衡（圖2 i）。綜上所述，上述發(fā)現(xiàn)為所構(gòu)建的CZ NP的多功能酶模擬特性提供了強(qiáng)有力的證據(jù)，包括SOD、POD、CAT和GPx活性，這為隨后的抗氧化功能奠定了基礎(chǔ)（圖2 j）。如圖2k、l所示，CZ NPs可以有效地清除ABTS·+、DPPH·和PTIO·，并且其清除能力與CZ NPs的濃度呈正相關(guān)。結(jié)果表明，隨著CZ NPs濃度的增加，·OH清除能力顯著提高（圖2 m）。此外，ESR分析顯示CZ NP有效地抑制·OH（圖2n）。為了提高脂質(zhì)體進(jìn)入動(dòng)脈斑塊的遞送效率，進(jìn)一步通過(guò)邁克爾加成反應(yīng)將OPN共價(jià)修飾到脂質(zhì)體表面（圖2 o）。TEM圖像顯示CZALO為類(lèi)球形，尺寸和分布相對(duì)均勻。顆粒之間沒(méi)有明顯的粘附，表明CZALO納米脂質(zhì)體的成功合成（圖2 p）。為了評(píng)價(jià)CZALO的藥物控制釋放能力，評(píng)估了L-Arg在pH 7.5和6.5下的藥物釋放動(dòng)力學(xué)。如圖2 q所示，L-Arg在前12小時(shí)內(nèi)快速釋放，隨后是緩慢釋放階段，這意味著CZALO可以在具有不同pH水平的生理環(huán)境中實(shí)現(xiàn)L-Arg的持續(xù)和受控釋放。

圖2 CZALO的合成與表征。（a）CZ NP合成工藝示意圖；（b）CZ NP的透射電子顯微鏡（TEM）圖像；（c）CZ NP的元素分布圖；（d）CZ納米顆粒中鈰（Ce）的X射線光電子能譜（XPS）；（e）CZ NPs的X射線衍射（XRD）圖譜；（f）不同濃度CZ NP的超氧化物歧化酶（SOD）樣活性（左）和電子自旋共振（ESR）測(cè)定評(píng)估超氧陰離子（O??）（右）；（g）CZ NP的過(guò)氧化物酶（POD）樣活性示意圖（左）和分析（右）；（h）用于評(píng)估過(guò)氧化氫酶（CAT）樣活性的氧氣（O?）產(chǎn)生（左）和過(guò)氧化氫（H?O?）清除（右）；（i）CZ NP的谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GPx）樣活性示意圖（左）和分析（右）；（j）CZ NP的酶模擬活性示意圖，涵蓋SOD、POD、CAT和GPx；（k-n）（1）用ESR法測(cè)定CZ NPs的羥基自由基（·OH，k）；（2）1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）測(cè)定（m）；（3）2-苯基-4,4,6,6-四甲基哌啶-1-氧自由基（PTIO）測(cè)定（n）；（o）CZALO制備方案示意圖；（p）CZALO的TEM圖像；（q）在pH 6.5和pH 7.5下L-Arg的體外釋放曲線

（2）CZALO使的巨噬細(xì)胞中的ROS清除和炎癥減弱

與LPS + CZAL組相比，LPS + CZALO組顯示出上級(jí)ROS清除作用，這歸因于由OPN介導(dǎo)的主動(dòng)靶向（圖3a）。使用鈣黃綠素AM/碘化丙啶（PI）染色評(píng)估CZALO對(duì)巨噬細(xì)胞的保護(hù)作用。與其他處理相比，在CZALO組中觀察到PI標(biāo)記的死亡巨噬細(xì)胞的明顯減少（圖3b）。類(lèi)似地，與用CZAL和CZL處理相比，用CZALO處理的巨噬細(xì)胞在Raw 264.7中表現(xiàn)出針對(duì)H₂ O₂誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的穩(wěn)健的抗細(xì)胞凋亡活性（圖3c）。以上結(jié)果共同證實(shí)了CZALO能夠有效地抑制細(xì)胞內(nèi)ROS，保護(hù)巨噬細(xì)胞免受氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的損傷。如圖3d和e所示，在CZALO處理組中紅色熒光強(qiáng)度顯著降低，表明巨噬細(xì)胞中脂質(zhì)滯留的有效減少和巨噬細(xì)胞中脂質(zhì)滯留的顯著抑制。隨后測(cè)量Raw264.7內(nèi)的膽固醇水平，顯示CZALO處理組的細(xì)胞內(nèi)膽固醇水平顯著降低（圖3f）。如圖3g和圖3 h所示，與模型組相比，CZALO處理的巨噬細(xì)胞顯示出顯著降低的CD 86水平和升高的CD 206水平。此外，采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法（ELISA）評(píng)價(jià)了CZALO減少炎癥反應(yīng)的潛力。如圖3 i和j所示，LPS處理后，促炎細(xì)胞因子包括TNF-α和干擾素-γ（IFN-γ）明顯升高。相反，在與CZALO孵育的巨噬細(xì)胞中，這些促炎性細(xì)胞因子的分泌水平顯著降低。此外，與其他組相比，CZALO組的抗炎細(xì)胞因子，如白細(xì)胞介素-4（IL-4）和IL-10增加（圖3 k和l）。這些發(fā)現(xiàn)表明，CZALO促進(jìn)了從促炎M1表型向抗炎M2表型的轉(zhuǎn)變，從而上調(diào)抗炎細(xì)胞因子并下調(diào)促炎細(xì)胞因子（圖3 m）。

圖3 CZALO激活的ROS清除和炎癥減輕。（a）LPS預(yù)處理的Raw264.7細(xì)胞經(jīng)不同濃度LPS處理后細(xì)胞內(nèi)ROS水平變化；（b）各種處理下Raw264.7的代表性活/死染色熒光圖像；（c）H?O?預(yù)處理的Raw264.7在不同處理后的細(xì)胞凋亡評(píng)估（Annexin V-FITC/PI雙染料試劑盒染色，流式細(xì)胞術(shù)分析）；（d）典型的共聚焦激光掃描顯微鏡（CLSM）圖像和（e）Raw264.7中尼羅紅染色的定量分析；（f）不同處理后Raw264.7中的細(xì)胞內(nèi)膽固醇含量；（g，h）不同處理后LPS預(yù)處理的Raw264.7中（g）CD86和（h）CD206的免疫熒光；（i-l）炎癥因子水平，包括（i）TNF-α、（j）IFN-γ、（k）IL-4和（l）IL-10；（m）CZALO介導(dǎo)的ROS消除和巨噬細(xì)胞表型調(diào)節(jié)示意圖

為了進(jìn)一步探索CZALO抗氧化/抗炎作用的潛在生物學(xué)機(jī)制，進(jìn)行了一項(xiàng)高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析，以比較LPS刺激的巨噬細(xì)胞（模型組）和CZALO處理的巨噬細(xì)胞（實(shí)驗(yàn)組）之間的差異表達(dá)基因（DEG）（圖4a）。如火山圖所示，CZALO處理后，2519個(gè)基因顯著上調(diào)，2932個(gè)基因顯著下調(diào)（圖4 b）。進(jìn)行基因本體（GO）分析以闡明這些基因在生物學(xué)過(guò)程、細(xì)胞組分和分子功能中的變化（圖4c）。KEGG的氣泡圖分析顯示，豐富的信號(hào)通路與炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)相關(guān)，包括TNF信號(hào)通路、Toll樣受體信號(hào)通路、NF-κB信號(hào)通路和NOD樣受體信號(hào)通路，其可能在CZALO的抗氧化和抗炎作用中發(fā)揮關(guān)鍵作用（圖4d）?；蚣患治觯℅SEA）分析還表明，與模型組相比，CZALO處理組中的DEG在幾種途徑中顯著富集，包括TNF信號(hào)傳導(dǎo)途徑、Toll樣受體信號(hào)傳導(dǎo)途徑、NF-κ B信號(hào)傳導(dǎo)途徑和NOD樣受體信號(hào)傳導(dǎo)途徑（圖4 e)。與模型組相比，用CZALO處理的Raw 264.7中DEG如白細(xì)胞介素-1 β（IL-1β）、CD 86、白血病抑制因子（Lif）、TNF、IL-6、白細(xì)胞介素-12 β（IL-12β）和核因子κ B亞基1（Nfkb 1）顯著下調(diào)（圖4g）。

圖4 不同處理后Raw264.7細(xì)胞的高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。（a）模型組與CZALO組差異表達(dá)基因（DEG）的主成分分析（PCA）；（b）火山圖展示與模型組相比，CZALO處理的Raw264.7中上調(diào)（綠色）和下調(diào)（粉紅色）的基因（通過(guò)RNA-Seq分析）；（c）不同處理后Raw264.7中DEG的基因本體（GO）標(biāo)注分析結(jié)果；（d）與模型組相比，CZALO處理的Raw264.7細(xì)胞中DEGs的KEGG途徑分析；（e）基因集富集分析（GSEA）圖展示模型組和CZALO治療組之間TNF信號(hào)通路（上）和Toll樣受體信號(hào)通路（下）中基因的富集；（f）圓形圖展示DEG和關(guān)鍵信號(hào)通路之間的相互作用；（g）圓形熱圖表示與TNF信號(hào)通路和Toll樣受體信號(hào)通路相關(guān)的DEG的表達(dá)水平

（3）CZALO介導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞衰老緩解

在促炎性巨噬細(xì)胞中過(guò)表達(dá)的NO合酶可以選擇性地催化L-Arg產(chǎn)生NO，NO逐漸擴(kuò)散到內(nèi)皮細(xì)胞中，在內(nèi)皮細(xì)胞中通過(guò)調(diào)節(jié)SASP因子的分泌、改善溶酶體功能、破壞細(xì)胞周期停滯和減少衰老內(nèi)皮細(xì)胞中的DNA損傷來(lái)發(fā)揮抗衰老功能（圖5a）。采用與HUVECs和Raw 264.7共培養(yǎng)的transwell系統(tǒng)來(lái)模擬動(dòng)脈粥樣硬化微環(huán)境。用熒光染料DAF-FMDA檢測(cè)HUVECs內(nèi)NO水平。如預(yù)期的，與L和CZL組相比，CZAL和CZALO組在HUVEC中表現(xiàn)出更高的熒光強(qiáng)度，證實(shí)用CZALO處理后HUVEC中的NO水平顯著增加（圖5 b）。當(dāng)分別用L、CZL、CZAL和CZALO處理HUVEC時(shí)，炎性細(xì)胞因子的表達(dá)被顯著抑制（圖5c-f）。同時(shí)，進(jìn)行了Western印跡實(shí)驗(yàn)，以評(píng)估IL-6和IL-8在HUVECs中的表達(dá)水平，NO處理導(dǎo)致IL-6和IL-8的蛋白質(zhì)表達(dá)顯著降低（圖5l）。上述實(shí)驗(yàn)表明，由CZALO產(chǎn)生的NO顯著降低SASP水平，包括炎性細(xì)胞因子和ROS。NO治療組（CZAL組和CZALO組）降低HUVECs中SA-β-Gal的水平（圖5g）。此外，生物透射電子顯微鏡（bio-TEM）觀察顯示CZALO處理可以減少HUVEC中脂褐素的積累（圖5 h）。CLSM圖像顯示在衰老細(xì)胞中γ-H2 AX熒光強(qiáng)度顯著增加。然而，在CZALO組中γ-H2 AX的熒光強(qiáng)度顯著降低（圖5i），證實(shí)CZALO處理可以有效地保護(hù)HUVEC免受DNA損傷。為了進(jìn)一步確認(rèn)CZALO的抗衰老性能，使用免疫熒光染色評(píng)估了與衰老正相關(guān)的細(xì)胞周期停滯標(biāo)志物p16和p53的表達(dá)水平。免疫熒光圖像顯示CZALO處理后p16和p53的熒光強(qiáng)度顯著降低，表明基于CZALO的NO處理可以顯著降低p16和p53的表達(dá)（圖5 j和k）。Western印跡結(jié)果與之前結(jié)果一致，表明CZALO處理后H₂ O₂組中γ-H2 AX、p16和p53的蛋白表達(dá)顯著降低（圖51）?？偟膩?lái)說(shuō)，從CZALO釋放的NO顯著降低γ-H2 AX、p16和p53的表達(dá)水平，從而促進(jìn)DNA修復(fù)并減輕細(xì)胞周期停滯。

圖5 內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)CZALO介導(dǎo)的衰老減緩。（a）示意圖顯示CZALO選擇性釋放NO以緩解內(nèi)皮細(xì)胞衰老；（b）不同制劑處理后人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）細(xì)胞內(nèi)NO含量的變化；（c-f）不同處理后（c）IL-1β、（d）IL-6、（e）IL-8和（f）TNF-α在H?O?誘導(dǎo)的衰老HUVEC中的分泌水平；（g）衰老和NO氣體處理的HUVEC中SA-β-gal染色的代表性圖像；（h）不同處理后HUVECs的生物透射電鏡圖像；（i）DNA損傷標(biāo)記物γ-H2AX的代表性免疫熒光圖像；（j，k）細(xì)胞周期停滯標(biāo)志物的代表性免疫熒光圖像，包括（j）p16和（k）p53；（l）Western blotting檢測(cè)不同處理組HUVEC中IL-8、IL-6、p53、p16和γ-H2AX的表達(dá)水平

高通量轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析，其揭示了H₂ O₂刺激的HUVEC（模型組）和CZALO處理的HUVEC（實(shí)驗(yàn)組）之間的顯著DEG（圖6a）。如圖6 b所示，火山圖證明，在CZALO處理后，202個(gè)基因顯著上調(diào)，而391個(gè)基因顯著下調(diào)。為了更深入地了解CZALO介導(dǎo)的DEG的生物學(xué)功能，進(jìn)行了GO分析以探索生物學(xué)過(guò)程、細(xì)胞組分和分子功能的變化（圖6c）。此外，KEGG途徑氣泡圖顯示在CZALO處理期間，諸如NF-κ B信號(hào)傳導(dǎo)、AGE-β信號(hào)傳導(dǎo)、MAPK信號(hào)傳導(dǎo)和TGF-β信號(hào)傳導(dǎo)的途徑顯著富集（圖6d）。GSEA分析進(jìn)一步證實(shí)，與對(duì)照組相比，與這些信號(hào)傳導(dǎo)途徑相關(guān)的DEG在CZALO處理組中顯著富集（圖6 e）。圓形圖進(jìn)一步證實(shí)了這些信號(hào)傳導(dǎo)途徑與衰老相關(guān)基因的密切關(guān)聯(lián)，表明CZALO誘導(dǎo)的NO潛在地具有良性抗衰老作用（圖6 f）。進(jìn)一步分析了這三種途徑中DEG的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)在CZALO處理的HUVEC中，DEG如白細(xì)胞介素-1 α（IL-1α）、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β2（TGFβ2）、叉頭盒O 1（FOXO 1）和超氧化物歧化酶2（SOD 2）的錫永水平顯著下調(diào)，這與先前的發(fā)現(xiàn)一致（圖6 g）。總之，CZALO產(chǎn)生的NO可有效調(diào)節(jié)SASP因子的分泌，增強(qiáng)溶酶體功能，緩解細(xì)胞周期停滯，并減少衰老內(nèi)皮細(xì)胞的DNA損傷，從而發(fā)揮強(qiáng)效抗衰老作用。

圖6 不同處理的HUVEC的高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。（a）主成分分析（PCA）顯示模型組和CZALO組之間的差異表達(dá)基因（DEGs）；（b）火山圖描繪了用CZALO處理的HUVEC與模型組相比的上調(diào)（藍(lán)色）和下調(diào)（綠色）基因（使用RNA-Seq進(jìn)行分析）；（c）不同處理下HUVEC中DEGs的基因本體（GO）注釋分析；（d）與模型組相比，CZALO處理的HUVEC中DEGs的KEGG通路分析；（e）基因集富集分析（GSEA）圖顯示模型組和CZALO治療組之間AGE-RAGE通路（上圖）和TGF-β信號(hào)通路（下圖）中的基因富集；（f）圓形圖顯示DEG和關(guān)鍵信號(hào)通路之間的相互作用；（g）圓形熱圖顯示與AGE-RAGE、NF-κB和TGF-β信號(hào)通路相關(guān)的DEG表達(dá)水平

（4）CZALO對(duì)ApoE^?/?小鼠動(dòng)脈粥樣硬化的治療作用及機(jī)制

離體熒光圖像顯示，CZALO組的胸主動(dòng)脈和主動(dòng)脈根部的熒光強(qiáng)度明顯強(qiáng)于CZAL組，表明CZALO由于OPN使能的主動(dòng)靶向而有效地在斑塊內(nèi)蓄積（圖7a和b）。為了進(jìn)一步研究CZALO的體內(nèi)抗動(dòng)脈粥樣硬化功效，給ApoE?/?小鼠喂食了8周的高脂飲食，以誘導(dǎo)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊，如圖7 c所示。然后從動(dòng)脈粥樣硬化小鼠中取出主動(dòng)脈，并縱向切開(kāi)以暴露動(dòng)脈內(nèi)膜。根據(jù)觀察斑塊的ORO染色（圖7 d和e），與生理鹽水組（32.59%）、L組（26.44%）、CZL組（23.17%）和CZAL組（16.55%）相比，CZALO組顯示出最低的平均斑塊面積百分比（13.72%）。同樣，為了進(jìn)一步研究抗動(dòng)脈粥樣硬化的功效和機(jī)制，采集了主動(dòng)脈弓的冷凍切片和石蠟切片。冷凍切片用ORO染色，結(jié)果顯示ORO染色面積從14.5%減少到5.8%（圖7 f和g），表明CZALO顯著減少了斑塊面積。這些發(fā)現(xiàn)證實(shí)了CZALO在縱向和橫向都能顯著減少斑塊面積。H&E染色表明，與鹽水組相比，接受CZALO治療的動(dòng)脈粥樣硬化小鼠表現(xiàn)出壞死核心從42.31%減少至30.25%（圖7 h和i）。此外，平滑肌細(xì)胞的遷移、增殖和膠原的生成可能加劇斑塊的形成和血管狹窄，Masson染色（圖7 j和k）證明CZALO有效減少血管平滑肌細(xì)胞浸潤(rùn)和減少斑塊中膠原積聚，這有利于穩(wěn)定動(dòng)脈粥樣硬化斑塊。

圖7 CZALO在ApoE?/?小鼠中的抗動(dòng)脈粥樣硬化療效。（a，b）動(dòng)脈粥樣硬化小鼠的心臟和主動(dòng)脈的離體熒光圖像（a）及相應(yīng)的定量分析（b）；（c）治療方案示意圖；（d，e）不同處理后動(dòng)脈粥樣硬化小鼠主動(dòng)脈的油紅O（ORO）染色代表性圖像（d）及定量分析（e）；（f，g）主動(dòng)脈弓切片的ORO染色代表性圖像（f）及主動(dòng)脈竇的相應(yīng)定量分析（g）；（h-k）主動(dòng)脈根部切片的代表性免疫組織化學(xué)圖像及定量分析，包括（h，i）蘇木精-伊紅（H&E）染色和（j，k）Masson三色染色

受上述結(jié)果的鼓舞，研究者對(duì)CZALO在體內(nèi)對(duì)抗動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的機(jī)制進(jìn)行了深入的探索。首先研究了CZALO誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞極化和重組免疫微環(huán)境以發(fā)揮抗炎作用的潛力。如圖8a所示，使用F4/80、CD 86和CD 206分別標(biāo)記巨噬細(xì)胞、M1巨噬細(xì)胞和M2巨噬細(xì)胞進(jìn)行多重免疫熒光染色。生理鹽水組的動(dòng)脈炎小鼠在其主要?jiǎng)用}中表現(xiàn)出高百分比的CD 86+巨噬細(xì)胞（M1型）和低百分比的CD 206+巨噬細(xì)胞（M2型）。CZALO治療明顯減少了CD 86+巨噬細(xì)胞，并增加了CD 206+巨噬細(xì)胞，證實(shí)CZALO促進(jìn)M1（炎癥）巨噬細(xì)胞向M2（抗炎）巨噬細(xì)胞極化。此外，CZALO通過(guò)降低包括TNF-α和IFN-γ在內(nèi)的炎性因子的血清水平而顯示出有效的抗動(dòng)脈粥樣硬化功能，如圖8b-e所示。上述結(jié)果表明，CZALO通過(guò)促進(jìn)巨噬細(xì)胞從炎性M1型向抗炎性M2型的極化并降低炎性因子的血清水平來(lái)對(duì)抗體內(nèi)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊。根據(jù)γ-H2 AX免疫熒光染色，在生理鹽水組中觀察到顯著的亮黃色熒光信號(hào)，而CZALO組顯示斑塊內(nèi)熒光信號(hào)顯著降低（圖8 f和j）。接下來(lái)，使用細(xì)胞衰老的生物標(biāo)志物（包括p16、p21和p53）進(jìn)行免疫熒光染色，以評(píng)價(jià)CZALO的抗衰老效果。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，在鹽水組中觀察到p16的顯著紅色熒光信號(hào)，而在CZALO處理組中斑塊內(nèi)的熒光信號(hào)顯著降低（圖8 g和k）。類(lèi)似地，在p21和p53免疫熒光染色圖像中，生理鹽水組顯示出強(qiáng)的熒光信號(hào)，而CZALO組中的熒光信號(hào)逐漸減弱（圖8h-1、i和m）。上述結(jié)果表明，CZALO通過(guò)下調(diào)衰老標(biāo)志物γ-H2 AX、p21、p16和p53在動(dòng)脈粥樣硬化的治療中發(fā)揮抗衰老作用。綜上所述，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證明CZALO具有協(xié)同抗炎和抗衰老作用，從而有效治療動(dòng)脈粥樣硬化。

圖8 CZALO在ApoE?/?小鼠中的抗動(dòng)脈粥樣硬化機(jī)制。（a）ApoE?/?小鼠經(jīng)不同處理后的主動(dòng)脈根部切片的代表性免疫熒光圖像（用CD86、CD206和F4/80抗體染色）；（b-e）血清中炎癥因子水平，包括（b）TNF-α、（c）IFN-γ、（d）IL-4和（e）IL-10；（f-m）主動(dòng)脈根切片的代表性免疫熒光圖像及定量分析，包括抗（f，j）γ-H2AX、（g，k）p16、（h，l）p53和（i，m）p21抗體染色