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針對上述問題，南開大學(xué)余志林教授團隊開發(fā)了一種酶響應(yīng)性原位液 - 液相分離系統(tǒng)，用于靶向無膜細(xì)胞器以增強癌癥化療效果。研究中利用了肽的刺激響應(yīng)性以及液滴與應(yīng)激顆粒（SGs）凝聚的潛在優(yōu)勢。通過在肽中引入硫酸酯酶響應(yīng)性硫酸化酪氨酸，實現(xiàn)了活細(xì)胞中原位相分離的建立。硫酸酯酶是一種在多種癌細(xì)胞中異常過表達的溶酶體定位酶，主要在溶酶體中發(fā)揮催化活性。研究結(jié)果表明，這種原位形成的液滴能夠靶向 SGs，通過與 SGs 的凝聚直接抑制其功能，從而解決癌癥化療中的藥物耐受性問題。該研究于2025年5月7日以《In Situ Liquid-Liquid Phase Separation of Peptides Into Droplets Targeting Membraneless Organelles for Enhanced Cancer Chemotherapy》為題發(fā)表于《Advanced Materials》上（DOI：10.1002/adma.202420399）。

研究示意圖

（1）肽YSO4F的酶響應(yīng)性LLPS研究

肽 YSO4F 及其天然對應(yīng)物 YF 合成與純化后（圖 1A），經(jīng)超高效液相色譜 - 質(zhì)譜（UPLC-MS）評估 YSO4F 的酶響應(yīng)性。UPLC 動力學(xué)研究顯示，加入硫酸酯酶后 YSO4F 逐漸轉(zhuǎn)化為 YF（圖 1B、C）。經(jīng) YF 相分離的濃度依賴性研究確定酶誘導(dǎo) LLPS 的條件，光學(xué)顯微鏡顯示 YF 在 1.4 mm 濃度下形成液滴（圖 1D）。YSO4F 的酶誘導(dǎo) LLPS 通過先在酸性溶液中孵育肽與硫酸酯酶，再調(diào)溶液 pH 至 7.4 進行。相同條件下，單獨 YSO4F 呈均質(zhì)溶液（圖 1E），經(jīng)硫酸酯酶處理后形成明顯液滴（圖 1F），表明硫酸酯酶誘導(dǎo) YSO4F 發(fā)生 LLPS。YSO4F 與硫酸酯酶孵育并調(diào) pH 至 7.4 后，CLSM 圖像顯示形成綠色球形液滴（圖 1G）。CLSM 圖像還顯示不同液滴間的融合，兩個小液滴在 90 秒內(nèi)共醋成一個大液滴（圖 1H）。以上結(jié)果直接證明 YSO4F 在硫酸酯酶誘導(dǎo)酪氨酸殘基硫酸根水解后發(fā)生酶響應(yīng)性 LLPS，為在過表達硫酸酯酶的活細(xì)胞中原位建立相分離奠定基礎(chǔ)。

圖1 A) 硫酸化肽 YSO4F 及其天然對應(yīng)物 YF 的化學(xué)結(jié)構(gòu)。B) 硫酸化肽 YSO4F（100 μm）在不同時間用硫酸酯酶（20 U/mL）處理的超高效液相色譜（UPLC）圖譜。C) 在酶濃度為 20 U/mL 的條件下，YSO4F（100 μm）中硫酸根水解轉(zhuǎn)化率隨時間的變化。D) 不同濃度下肽 YF 的光學(xué)顯微鏡（OM）圖像，從左到右：1.3、1.4、1.5、1.6 和 1.8 mm。E，F(xiàn)) 溶液中肽 YSO4F（1.4 mm）在與硫酸酯酶孵育前（E）和 24 小時后（F）的光學(xué)顯微鏡（OM）圖像。G) 經(jīng)硫酸酯酶處理的 YSO4F（1.4 mm）形成的液滴的共聚焦激光掃描顯微鏡（CLSM）圖像，用于說明熒光恢復(fù)后光漂白（FRAP）過程。H) 經(jīng)硫酸酯酶處理的 YSO4F（1.4 mm）形成的液滴融合的共聚焦激光掃描顯微鏡（CLSM）圖像

（2）肽YSO4F在癌細(xì)胞中的攝取與原位LLPS研究

選用過表達硫酸酯酶的鼠乳腺癌細(xì)胞系 4T1 作為模型細(xì)胞。在相分離研究前，通過流式細(xì)胞分析和熒光信號強度定量，發(fā)現(xiàn) 4T1 細(xì)胞對 YSO4F 的攝取優(yōu)于 YF（圖 2A、B），推測與其不同的攝取途徑有關(guān)。由于硫酸酯酶在驅(qū)動原位 LLPS 過程中的關(guān)鍵作用及其在溶酶體中的催化微環(huán)境，研究了 YSO4F 的內(nèi)化途徑。共聚焦激光掃描顯微鏡（CLSM）圖像顯示 YF 和 YSO4F 被 4T1 細(xì)胞成功攝?。▓D 2C）。YSO4F 處理的 4T1 細(xì)胞中，肽 FITC 與溶酶體示蹤劑信號的皮爾遜相關(guān)系數(shù)（PCC）值最初約為 0.73，12 小時后降至 0.23（圖 2D），表明肽與溶酶體的共定位及其溶酶體逃逸，闡明了 YSO4F 的溶酶體介導(dǎo)攝取途徑。YSO4F 經(jīng)硫酸酯酶誘導(dǎo)水解為帶正電的 YF 后，可能通過質(zhì)子海綿效應(yīng)促進溶酶體逃逸。此外，CLSM 圖像顯示 4T1 細(xì)胞內(nèi)形成球形液滴，經(jīng) FRAP 研究發(fā)現(xiàn)，肽溶酶體逃逸后，4T1 細(xì)胞內(nèi)的綠色液滴在光漂白后熒光恢復(fù)強勁（圖 2E），表明 YSO4F 在 4T1 細(xì)胞內(nèi)發(fā)生原位相分離形成液滴。

圖2 A) 通過流式細(xì)胞分析法分析 4T1 細(xì)胞在不同時間點攝取 1.4 mM 的肽 YSO4F 和 YF。B) 流式細(xì)胞實驗中，4T1 細(xì)胞與 YSO4F 或 YF 共孵育后的定量熒光強度。C) 4T1 細(xì)胞在 1.4 mM YSO4F 存在下孵育 2、4、8 和 12 小時的共聚焦激光掃描顯微鏡（CLSM）圖像，用 Lyso-Red 熒光示蹤劑染色。D) 用 YSO4F 或 YF 處理的 4T1 細(xì)胞在不同時間點，Lyso-Red 熒光示蹤劑與 FITC 信號之間的皮爾遜相關(guān)系數(shù)（PCC）值。E) 用 YSO4F 處理 12 小時的 4T1 細(xì)胞的共聚焦激光掃描顯微鏡（CLSM）圖像，以確認(rèn)原位形成液滴的熒光恢復(fù)后光漂白（FRAP）特性

（3）基于酶誘導(dǎo)原位 LLPS 系統(tǒng)的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)靶向功能研究

將 YSO4F 與 TPP-YSO4F 按 9:1 摩爾比混合，制備了混合物 m-YSO4F-Lm（圖 3A），其中 m 表示混合物，Lm 表示靶向線粒體的配體。，證實了其酶誘導(dǎo)的 LLPS。同樣，通過混合 YF 和 TPP-YF 制備了含配體的液滴 d-YF-Lm。通過監(jiān)測肽 FITC 與線粒體示蹤劑信號的共定位，評估了形成的液滴的線粒體靶向特性（圖 3B）。CLSM 圖像顯示，m-YSO4F-Lm 處理 12、16 和 20 小時后，F(xiàn)ITC 與線粒體示蹤劑信號的 PCC 值逐漸增加（圖 3C），表明液滴在細(xì)胞質(zhì)中圍繞線粒體積累。通過 MTT 實驗評估了 m-YSO4F-Lm 對癌細(xì)胞的毒性及其誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的機制。結(jié)果表明，YSO4F、m-YSO4F-Lm 和 d-YF-Lm 均能略微降低 4T1 細(xì)胞的活性（圖 3D），其中 m-YSO4F-Lm 由于其增強的細(xì)胞攝取和線粒體靶向特性，對 4T1 細(xì)胞表現(xiàn)出較高的毒性。由于靶向配體在毒性中的關(guān)鍵作用，通過監(jiān)測線粒體的完整性來探究 m-YSO4F-Lm 殺死癌細(xì)胞的機制。CLSM 圖像顯示，經(jīng) m-YSO4F-Lm 處理 24 小時的 4T1 細(xì)胞中出現(xiàn)強烈的綠色熒光信號，表明線粒體去極化，從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡（圖 3E）。通過流式細(xì)胞實驗定量分析了不同處理下 4T1 細(xì)胞中紅色和綠色熒光信號的強度比值，結(jié)果表明，經(jīng) m-YSO4F-Lm 處理的 4T1 細(xì)胞中 J - 聚集體顯著減少（圖 3F），證明了線粒體去極化和功能障礙是細(xì)胞凋亡的原因?？傮w而言，研究表明原位形成的共醋液滴具有線粒體靶向特性，可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

圖3 A) 通過 YSO4F 與配體 TPP-YSO4F 混合制備液滴前體混合物 m-YSO4F-Lm 及其在 4T1 細(xì)胞中原位相分離成液滴 d-YF-Lm 以靶向線粒體并誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的示意圖。B) 用 Mito-Red 染色線粒體后，經(jīng) m-YSO4F-Lm（1.4 mm）處理 12、16 和 20 小時的 4T1 細(xì)胞的共聚焦激光掃描顯微鏡（CLSM）圖像。C) 用 YSO4F 或 m-YSO4F-Lm 處理的 4T1 細(xì)胞在不同時間點，Mito-Red 熒光示蹤劑與 FITC 信號之間的皮爾遜相關(guān)系數(shù)（PCC）值。D) 4T1 細(xì)胞經(jīng) YSO4F、d-YF-Lm 和 m-YSO4F-Lm 在不同濃度下處理 24 小時后的細(xì)胞活性。E) 用 JC-1 標(biāo)記的 4T1 細(xì)胞經(jīng) m-YSO4F-Lm（1.4 mM）處理 0、6、12、18 和 24 小時后的共聚焦激光掃描顯微鏡（CLSM）圖像。F) 用不同處理孵育的 JC-1 標(biāo)記的 4T1 細(xì)胞中，與 J-聚集體（紅色）和 J-單體（綠色）信號相關(guān)的熒光強度比值的流式細(xì)胞分析結(jié)果

（4）無膜應(yīng)激顆粒靶向功能研究

完成膜細(xì)胞器靶向研究后，進一步探索了原位 LLPS 系統(tǒng)對無膜應(yīng)激顆粒（SG）的靶向功能。合成與 G3BP2 具有可靠親和力的配體 FGDF-YSO4F 和 FGDF-YF，將其與親本肽混合，得到混合物 m-YSO4F-LSG 和液滴 d-YF-LSG（圖 4A）。微量熱泳動（MST）研究顯示 FGDF-YF 與 G3BP2 的結(jié)合常數(shù)為 21.6 μm，表明其對 SG 具有潛在靶向活性（圖 4B）。在 MST 研究中，固定 YF 濃度為 1.4 mm 維持液滴結(jié)構(gòu)，將 FGDF-YF 濃度設(shè)置為與單獨配體 MST 研究相同范圍，結(jié)果顯示配體加入液滴 d-YF-LSG 后，配體 - 蛋白結(jié)合增強 3.9 倍（圖 4C），表明液滴募集配體和蛋白，促進它們結(jié)合。根據(jù) MST 結(jié)合曲線，配體與蛋白結(jié)合在 FGDF-YF 濃度 70 - 100 μm 時達到穩(wěn)定平臺階段，因此以 5% 含量將配體混入混合物或液滴中（圖 4A）。MTT 實驗顯示，YSO4F、m-YSO4F-LSG 或 d-YF-LSG 處理 A549 細(xì)胞未顯著降低細(xì)胞活性（圖 4D），表明肽對癌細(xì)胞細(xì)胞毒性低。索拉非尼對 A549 細(xì)胞表現(xiàn)出中等細(xì)胞毒性，半致死劑量（IC50）值約為 13 μm（圖 4E）。然而，m-YSO4F-LSG 或 d-YF-LSG 預(yù)處理 A549 細(xì)胞后，再與索拉非尼共孵育，導(dǎo)致顯著細(xì)胞死亡，特別是 m-YSO4F-LSG 與索拉非尼聯(lián)合處理使索拉非尼 IC50 值降至 3 μm，表明原位形成液滴具有細(xì)胞毒性增敏作用。m-YSO4-LSG 存在下孵育 A549 細(xì)胞，再用索拉非尼刺激，導(dǎo)致 A549 細(xì)胞內(nèi)明顯形成共醋液滴（圖 4F），線掃描分析顯示肽 FITC 和 G3BP2-IF 染色信號顯著重疊。相比之下，YSO4F 孵育的 A549 細(xì)胞（也在 A549 細(xì)胞中形成共醋液滴）未顯示 FITC 和 IF 染色信號重疊（圖 4G），結(jié)果強有力地表明原位形成液滴與蛋白 G3BP2 重疊源于配體與蛋白 G3BP2 結(jié)合。

圖4 A) 通過 YSO4F 與配體 FGDF-YSO4F 混合制備混合物 m-YSO4F-LSG 及其在 A549 細(xì)胞中原位 LLPS 形成液滴 d-YF-LSG 以靶向應(yīng)激顆粒（SG）并誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的示意圖。B, C) 微量熱泳動（MST）實驗曲線顯示配體 FGDF-YF（B）或液滴 d-YF-LSG（C）與蛋白 G3BP2 的結(jié)合親和力隨配體濃度的變化。D) A549 細(xì)胞經(jīng) YSO4F、d-YF-LSG 或 m-YSO4F-LSG 處理 24 小時后的細(xì)胞活性。E) A549 細(xì)胞單獨用索拉非尼（Sor：1）處理 12 小時，或用 YSO4F（2）、FGDF-YSO4F（3）、d-YF-LSG（4）或 m-YSO4F-LSG（5）處理 12 小時后與索拉非尼共孵育 12 小時，其中顯示了半致死劑量（IC50）值。F, G) 共聚焦激光掃描顯微鏡（CLSM）圖像顯示用 m-YSO4F-LSG（1.4 mm）（F）或 YSO4F（1.4 mm）（G）處理 12 小時并用索拉非尼共孵育 2 小時的 A549 細(xì)胞的免疫熒光染色 G3BP2

（5）原位形成液滴的 SG 靶向功能及機制研究

原位形成的液滴通過凝聚整個應(yīng)激顆粒（SG）或招募單個蛋白 G3BP2 來增強索拉非尼的細(xì)胞毒性。共聚焦激光掃描顯微鏡（CLSM）圖像顯示，經(jīng) m-YSO4F-LSG 處理并用索拉非尼刺激的 A549 細(xì)胞中，肽 FITC 與 T 細(xì)胞內(nèi)抗原 1（TIA-1）免疫熒光染色信號顯著共定位（圖 5A），表明液滴與整個 SG 的凝聚；而經(jīng) YSO4F 處理的 A549 細(xì)胞中，綠色 FITC 和紅色免疫熒光染色信號完全分離（圖 5B），直接證明了原位形成液滴的 SG 靶向特性。CLSM 圖像還顯示，用 NT-647 熒光染料標(biāo)記的 G3BP2 與 d-YF-LSG 共孵育后，綠色 FITC 和紅色 NT-647 熒光信號高度重疊（圖 5C），表明液滴招募了 G3BP2。此外，在未用索拉非尼刺激的 A549 細(xì)胞中，m-YSO4F-LSG 也能使蛋白免疫熒光染色信號與肽 FITC 信號共定位（圖 5D），表明即使在無 SG 形成的條件下，液滴也能招募蛋白 G3BP2，招募蛋白可能是增強索拉非尼細(xì)胞毒性的次要途徑。

Western blot 實驗顯示，經(jīng)肽和索拉非尼處理的 A549 細(xì)胞中，m-YSO4F-LSG 處理的細(xì)胞磷酸化 p38（P-p38）和裂解的 caspase-3 水平顯著增加（圖 5F），證實了原位形成液滴增強了索拉非尼的 caspase 依賴性凋亡途徑。盡管天然液滴 d-YF-LSG 和配體 FGDF-YSO4F 與索拉非尼共孵育也能提高活化 caspase-3 水平，但與 m-YSO4F-LSG 相比，其改善有限，表明原位相分離在抑制 SG 功能方面具有優(yōu)勢。CLSM 圖像顯示，在 m-YSO4F-LSG + 索拉非尼處理的細(xì)胞中，RACK1 被液滴招募的情況顯著減少（圖 5G），與傳統(tǒng) SG 抑制劑 ISRIB 的結(jié)果一致。Western blot 分析還顯示，索拉非尼處理的 A549 細(xì)胞中 MTK1 磷酸化被顯著抑制，而添加 m-YSO4F-LSG 或 ISRIB 可增加 MTK1 磷酸化水平（圖 5H），表明液滴 - SG 共醋液滴阻止了 RACK1 的隔離，并隨后激活了 MTK1 磷酸化，從而抑制了 SG 功能（圖 5I）。

圖5 A, B) 經(jīng) m-YSO4F-LSG（A）或 YSO4F（B）處理 12 小時并用索拉非尼刺激 2 小時的 A549 細(xì)胞的免疫熒光染色 TIA-1 的共聚焦激光掃描顯微鏡（CLSM）圖像。C) 含有 NT-647 標(biāo)記的蛋白 G3BP2 的液滴 d-YF-LSG 的共聚焦激光掃描顯微鏡（CLSM）圖像。D) 僅用 m-YSO4F-LSG 處理 12 小時的 A549 細(xì)胞的免疫熒光染色 G3BP2 的共聚焦激光掃描顯微鏡（CLSM）圖像。E, F) 經(jīng) PBS（1）、m-YSO4F-LSG（2）處理 24 小時，或經(jīng) Sor（3）處理 12 小時，以及經(jīng) d-YF-LSG（4）、FGDF-YSO4F（5）或 m-YSO4F-LSG（6）處理 12 小時后與索拉非尼共孵育 12 小時的 A549 細(xì)胞內(nèi) p38、P-p38、caspase-3 和裂解 caspase-3 水平的 Western blot 實驗（E）和定量數(shù)據(jù)（F）。G) 預(yù)孵育 12 小時 m-YSO4F-LSG（1.4 mm）并用索拉非尼（13 μm）額外孵育 2 小時的 A549 細(xì)胞的免疫熒光染色 G3BP2 和 RACK1 的共聚焦激光掃描顯微鏡（CLSM）圖像。H) 經(jīng) PBS、索拉非尼（13 μm）處理 2 小時，預(yù)孵育 m-YSO4F-LSG（1.4 mm）12 小時或 ISRIB（200 nm）2 小時并用索拉非尼（13 μm）額外孵育 2 小時的 A549 細(xì)胞內(nèi) MTK1 和 P-MTK1 水平的 Western blot 實驗。I) 原位形成液滴抑制 SG 功能并激活 caspase 依賴性凋亡途徑的機制示意圖。統(tǒng)計分析采用單因素方差（ANOVA）分析。*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001

（6）原位LLPS系統(tǒng)的體內(nèi)化療效果及生物安全性研究

驗證原位 LLPS 系統(tǒng)的無膜細(xì)胞器靶向功能后，開展動物實驗研究原位形成液滴的體內(nèi)化療效果。用 A549 細(xì)胞皮下注射建立荷瘤 Balb/c 小鼠模型，腫瘤體積約 100 mm3 時，小鼠隨機分七組，每組接受四次給藥，每隔一天一次。索拉非尼腹腔注射，肽瘤內(nèi)注射，聯(lián)合給藥時交替日注射。治療期間，每兩天記錄一次給藥小鼠體重和腫瘤體積，21 天后解剖研究腫瘤組織。腫瘤生長曲線和重量顯示，m-YSO4F-LSG 聯(lián)合索拉非尼組腫瘤生長最慢（圖 6A、B），表明原位形成液滴對索拉非尼化療有增敏效果。解剖腫瘤組織大小也證實了聯(lián)合注射抑制腫瘤生長（圖 6C）。接著，通過解剖腫瘤組織切片的 CLSM 研究，探究肽的體內(nèi)相分離和原位形成液滴的 SG 靶向行為?？赡茏C實了肽的硫酸酯酶誘導(dǎo)體內(nèi)相分離。此外，給藥后 24 小時小鼠腫瘤組織切片顯示，綠色肽 FITC 和紅色 G3BP2 免疫熒光染色信號顯著重疊，皮爾遜相關(guān)系數(shù)（PCC）約 0.77（圖 6D）。而用 YSO4F 和索拉非尼注射的小鼠腫瘤組織內(nèi)，肽和蛋白熒光信號幾乎分離，PCC 值低（圖 6），結(jié)果證明 m-YSO4F-LSG 成功靶向 SG。WB 實驗評估腫瘤組織蛋白水平，確認(rèn)增強化療效果機制（圖 6F），顯示 m-YSO4F-LSG 和索拉非尼聯(lián)合治療組 P-p38 蛋白水平上調(diào)最明顯（圖 6G），伴隨 caspase-3 水平下調(diào)和裂解 caspase-3 水平增加，表明原位形成液滴通過激活 caspase 依賴性凋亡途徑增強治療效果。對治療小鼠腫瘤組織和主要器官進行蘇木精 - 伊紅（H&E）染色實驗，確認(rèn)腫瘤細(xì)胞凋亡并評估生物安全性（圖 6H）。m-YSO4F-LSG + 索拉非尼治療小鼠腫瘤組織內(nèi)細(xì)胞萎縮和凋亡特征顯著，支持治療效果。

圖6 A-C) 經(jīng) PBS、d-YF-LSG、m-YSO4F-LSG、索拉非尼（Sor）、YSO4F + 索拉非尼、d-YF-LSG + 索拉非尼和 m-YSO4F-LSG + 索拉非尼處理的小鼠解剖的腫瘤組織的腫瘤生長曲線（A）、腫瘤重量（B）和代表性圖像（C）。D, E) 經(jīng) m-YSO4F-LSG + 索拉非尼（D）和 YSO4F + 索拉非尼（E）處理的小鼠腫瘤組織冰凍切片的共聚焦激光掃描顯微鏡（CLSM）圖像。F, G) 經(jīng) PBS（1）、m-YSO4F-LSG（2）、索拉非尼（3）、d-YF-LSG + 索拉非尼（4）和 m-YSO4F-LSG + 索拉非尼（5）給藥的小鼠腫瘤組織內(nèi) p38、P-p38、caspase-3 和裂解 caspase-3 蛋白水平的 Western blot 實驗（F）或定量數(shù)據(jù)（G）。H) 經(jīng) m-YSO4F-LSG + 索拉非尼給藥后小鼠的腫瘤組織和主要器官的蘇木精 - 伊紅（H&E）染色圖像。統(tǒng)計分析采用單因素方差（ANOVA）分析。*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001