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針對上述問題，溫州醫(yī)科大學肖健教授開發(fā)出一種具有分級遞送性能的愈合階段自適應(yīng)調(diào)節(jié)水凝膠（F/R凝膠），用于慢性感染傷口的程序化調(diào)控，該凝膠通過陽離子多肽（ε-聚賴氨酸，εPL）與醛基化透明質(zhì)酸（HA-CHO）之間的席夫堿交聯(lián)反應(yīng)快速制備而成，同時包載了εPL修飾的缺氧二氧化鈰納米酶（εPL-CeOv納米酶）以及共負載堿性成纖維細胞生長因子（bFGF）和c-Jun小干擾RNA（c-Jun siRNA）的聚乳酸-羥基乙酸共聚物微膠囊（F/R MCs），具備時序釋放功能，這種水凝膠具有出色的粘附性和自愈合特性，能夠適配不規(guī)則的傷口，有效抵抗細菌感染、促進血管生成、適時促進細胞外基質(zhì)沉積，并抑制真皮纖維化。在感染小鼠傷口模型和兔耳增生性瘢痕傷口模型中，該設(shè)計均證實可實現(xiàn)傷口的快速愈合，同時顯著減少瘢痕形成。該文章于2025年4月20日以《A dynamically phase-adaptive regulating hydrogel promotes ultrafast anti-fibrotic wound healing》為題發(fā)表于《Nature Communications》（DOI：10.1038/s41467-025-58987-w）。

（1）F/R gel的構(gòu)建與表征

陽離子抗菌劑ε-聚賴氨酸（εPL）通過席夫堿反應(yīng)與醛基化透明質(zhì)酸（HA-CHO）形成F/R凝膠網(wǎng)絡(luò)，結(jié)晶態(tài)二氧化鈰納米酶（CeOv）和F/R微膠囊（F/R MCs）均勻嵌入其中（圖1a）。采用W/O/W復(fù)乳液技術(shù)制備負載堿性成纖維細胞生長因子（bFGF）和c-Jun小干擾RNA（c-Jun siRNA）的F/R MCs，掃描電子顯微鏡（SEM）顯示其為粒徑約6.23±2.70 μm的光滑微球（圖1d），熒光標記法證實藥物成功負載（圖1e）。降解測試表明，微膠囊在生理溶液中緩慢分解，藥物（bFGF和c-Jun siRNA）持續(xù)釋放（圖2k）。免疫熒光染色驗證F/R MCs對成纖維細胞中c-Jun基因沉默效率，結(jié)果顯示c-Jun基因表達顯著降低（圖1f）。

圖1 F/R凝膠的設(shè)計及特性。（a）F/R凝膠的制備示意圖，用于慢性感染傷口的程序性調(diào)控；（b）CeOv納米顆粒的透射電子顯微鏡（TEM）圖像；（c）CeOv納米顆粒的高分辨透射電子顯微鏡（HRTEM）圖像及晶格分析；（d）F/R微膠囊的掃描電子顯微鏡（SEM）圖像；（e）F/R微膠囊的共聚焦激光掃描顯微鏡（CLSM）圖像；（f）3T3細胞中c-Jun表達的熒光染色（綠色）

HA-CHO與εPL鏈（游離或εPL-CeOv）混合后，醛基與氨基迅速發(fā)生席夫堿反應(yīng)，數(shù)秒內(nèi)形成F/R凝膠（圖2a）。凝膠具有多孔微觀結(jié)構(gòu)，鈰元素均勻分布（圖2b）。流變學測試顯示，凝膠約3.0秒內(nèi)形成穩(wěn)定三維結(jié)構(gòu)，楊氏模量約6.69 kPa。在0%-1000%剪切應(yīng)變范圍內(nèi)，儲能模量（G’）和損耗模量（G”）隨剪切應(yīng)力增加而降低，應(yīng)變約770%時出現(xiàn)G”>G’拐點，表現(xiàn)出剪切稀化行為（圖2d）。應(yīng)變降至1%時，凝膠恢復(fù)彈性狀態(tài)，且該過程可多次循環(huán)可逆，具有良好的可注射性和自愈合特性（圖2e，f）。F/R凝膠在手指關(guān)節(jié)反復(fù)伸直或彎曲時仍能穩(wěn)定粘附（圖2g），且具有良好的拉伸性能（圖2h-j）。在弱酸性微環(huán)境下，凝膠解離，低分子εPL或超小εPL-CeOv釋放發(fā)揮抗菌和免疫調(diào)節(jié)功能。由于PLGA微膠囊尺寸較大且降解緩慢，F(xiàn)/R MCs分解延遲，bFGF/siRNA隨后釋放促進組織再生。藥物釋放曲線顯示，中性PBS中孵育時，εPL-CeOv第6天釋放約91.13%；bFGF和siRNA隨凝膠降解逐漸釋放，第7天bFGF累積釋放量接近85%，siRNA達約74.48%。酸性微環(huán)境（pH=4.5）加速藥物釋放，尤其是εPL-CeOv，符合席夫堿鍵的酸敏感性（圖2k）。該凝膠系統(tǒng)具備分級藥物遞送特性：先釋放抗菌εPL成分，隨后CeOv納米酶清除ROS、調(diào)節(jié)炎癥，最后bFGF和siRNA促進血管新生、細胞增殖并調(diào)節(jié)成纖維細胞亞型，為按需精準給藥提供可能，具有快速抗纖維化傷口愈合的潛力（圖2l）。

圖2 F/R凝膠的表征。（a）凝膠制備的示意圖；（b）F/R凝膠的掃描電子顯微鏡（SEM）圖像及元素分布；（c）F/R凝膠的時間掃描流變曲線；（d）應(yīng)變掃描下的儲能模量（G'）與損耗模量（G''）；（e）交替施加1%與800%應(yīng)變時F/R凝膠的流變變化；（f）凝膠自愈合過程的代表性照片；（g）凝膠粘附性能的代表性照片；（h）凝膠可拉伸性能的代表性照片；（i）凝膠黏附性能的代表性圖片；（j）豬皮張力拉伸測試；（k）F/R凝膠組分在中性PBS（pH = 7.4）和酸性PBS（pH = 4.5）中的體外釋放特性；（l）F/R凝膠在無瘢痕傷口愈合過程中動態(tài)相適應(yīng)調(diào)控功能的示意圖

（2）抗菌和抗生物膜性能

F/R凝膠對耐藥菌感染傷口具有顯著的抗菌效果。以大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和耐甲氧西林金黃色葡萄球菌為模型菌株，F(xiàn)/R凝膠處理后菌落數(shù)量顯著減少，與環(huán)丙沙星相當（圖3a，b）。F/R凝膠對革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌生長均有抑制作用，對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌抑制率約89%，對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌清除率接近95%（圖3a，b）。細菌死活染色證實凝膠能迅速殺死細菌（圖3a，b），掃描電子顯微鏡圖像顯示細菌形態(tài)發(fā)生破壞性變化（圖3c）。F/R凝膠對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和耐甲氧西林金黃色葡萄球菌生物膜的抑制率分別為95.08%、87.10%和87.89%，顯著高于環(huán)丙沙星（圖3d）。同時，該凝膠對成熟生物膜的破壞率分別為82.53%、81.38%和71.35%（圖3e），細菌死活染色進一步驗證其強大的生物膜清除能力（圖3e）。綜合分析生物膜厚度、生物量、粗糙度和綠色熒光強度等參數(shù)后，F(xiàn)/R凝膠比環(huán)丙沙星具有更強的生物膜破壞能力（圖3f，g）。F/R凝膠和空白凝膠的生物膜破壞效率無顯著差異，表明水凝膠基質(zhì)成分（εPL和εPL-CeOv）在解離生物膜方面起關(guān)鍵作用，F(xiàn)/R微膠囊的添加未削弱其抗菌活性。

圖3 F/R凝膠的體外抗菌和抗生物膜活性。（a）不同處理后細菌菌落及細菌死活染色的代表性圖像；（b）菌落計數(shù)和死活細菌的統(tǒng)計分析；（c）F/R凝膠處理前后細菌的掃描電子顯微鏡（SEM）圖像；（d）F/R凝膠對生物膜破壞效果的實驗示意圖；（e）各種處理后成熟生物膜的結(jié)晶紫染色和細菌死活染色圖像；（f）成熟生物膜的生物膜評估值；（g）從e中的共聚焦激光掃描顯微鏡（CLSM）平面量化得到的綠色熒光強度與生物膜深度的關(guān)系

（3）抗氧化和抗炎性能評估

εPL-CeOv是清除活性氧（ROS）的主要成分，通過Ce3?/Ce??氧化態(tài)之間的快速氧化還原循環(huán)接受或轉(zhuǎn)移電子（圖4a）?？瞻啄z和F/R凝膠的ROS清除效率與純εPL-CeOv幾乎相同，而F/R微膠囊的清除活性很低（圖4b-f），表明εPL-CeOv與HA-CHO交聯(lián)不影響其活性，且納米酶在凝膠基質(zhì)中的均勻分布確保了強大的抗氧化能力。密度泛函理論（DFT）計算表明，超小CeOv表面富含氧空位，存在催化活性的Ce3?/Ce??氧化還原電對（圖4g）。電荷密度圖顯示氧空位導(dǎo)致電子重新分布，相鄰Ce原子被還原，Ce的價態(tài)降低約0.47個電子（圖4h）。CeOv對ABTS?·、DPPH·、H?O?、·OH和·O??的結(jié)合能分別為-3.87 eV、-3.97 eV、-4.83 eV、-6.46 eV和-7.46 eV（圖4i），顯著高于CeO?，增強了對自由基的催化活性。圖4j展示了CeOv模擬超氧化物歧化酶（SOD）和過氧化氫酶（CAT）活性的反應(yīng)路徑?！??自由基與CeOv表面結(jié)合，通過與氧空位中的Ce3?相互作用，吉布斯自由能（ΔG）為-2.36 eV，電子從Ce3?轉(zhuǎn)移到氧原子上，生成H?O?，模擬SOD活性。對于CAT模擬過程，H?O?吸附導(dǎo)致Ce??→Ce3?的價態(tài)轉(zhuǎn)變，生成質(zhì)子和氧分子。Ce3?與另一個H?O?分子反應(yīng)，轉(zhuǎn)移質(zhì)子生成H?O，Ce3?重新氧化為Ce??，完成催化循環(huán)。

圖4 體外抗氧化活性和DFT計算。（a）F/R凝膠的ROS清除能力示意圖；（b）F/R凝膠對ABTS自由基的清除實驗；（c）F/R凝膠對DPPH自由基的清除實驗；（d）F/R凝膠對過氧化氫的清除實驗；（e）F/R凝膠對羥基自由基的清除實驗；（f）F/R凝膠對超氧陰離子的清除實驗；（g）氧空位型CeOv納米酶的粒子模型及其單元格構(gòu)型；（h）CeO?（上圖）和CeOv（下圖）的模擬電子密度圖像；（i）CeOv（111）晶面上吸附的ABTS?·、DPPH·、H?O?、·OH和·O??自由基的優(yōu)化結(jié)構(gòu)俯視圖及相應(yīng)的結(jié)合能（Ebinding）值；（j）CeOv（111）晶面上模擬的超氧化物歧化酶（SOD-like）和過氧化氫酶（CAT-like）催化過程的反應(yīng)能譜圖

（4）ROS清除與生物相容性評估

F/R凝膠能夠中斷炎癥性ROS循環(huán)，清除細胞內(nèi)過量ROS并抑制巨噬細胞向促炎性M1型極化。在3T3和人臍靜脈內(nèi)皮細胞（HUVEC）的氧化應(yīng)激模型中，F(xiàn)/R凝膠顯著降低了細胞內(nèi)ROS強度，3T3細胞降低6倍以上，HUVEC細胞降低2倍（圖5b，c）。熒光圖像顯示，F(xiàn)/R凝膠處理后3T3和HUVEC細胞中ROS水平顯著降低（圖5d，e），且羥苯基熒光素（HPF）染色結(jié)果表明細胞活力顯著恢復(fù)（圖5d，e）。在脂多糖（LPS）誘導(dǎo)的巨噬細胞M1型極化模型中，F(xiàn)/R凝膠顯著降低CD86陽性率，僅約為2.56%，與LPS組相比降低了近6.7倍（圖5f，g）。其機制包括bFGF抑制NF-κB信號通路激活，以及εPL-CeOv清除細胞內(nèi)ROS。

F/R凝膠具有良好的生物相容性。血液相容性測試顯示，F(xiàn)/R凝膠組溶血率接近0%，與陰性組相當（圖5h，i）。體內(nèi)生物相容性測試中，將F/R凝膠皮下移植到小鼠皮膚，30天后H&E染色結(jié)果顯示小鼠皮膚和主要器官中無明顯炎癥反應(yīng)或組織異常（圖5k），且所有血常規(guī)和生化指標均在正常范圍內(nèi)（圖5l）。

圖5 F/R凝膠的細胞內(nèi)氧化應(yīng)激消除、巨噬細胞極化效應(yīng)及生物相容性評估。（a）細胞實驗示意圖；（b）3T3和HUVEC細胞上DCFH-DA熒光的流式細胞術(shù)分析；（c）細胞內(nèi)DCFH-DA熒光強度的統(tǒng)計數(shù)據(jù)；（d）3T3細胞上DCFH-DA探針（綠色）、HPF探針（綠色）和活/死細胞染色實驗（Calcein，綠色，PI，紅色）的熒光圖像；（e）相應(yīng)的統(tǒng)計分析；（f）巨噬細胞上CD86標記的流式細胞術(shù)分析；（g）相應(yīng)的統(tǒng)計數(shù)據(jù)；（h）紅細胞顯微圖像；（i）各種處理下的紅細胞溶血率；（j）皮下植入測試示意圖；（k）F/R凝膠植入28天后的皮膚組織H&E染色圖像；（l）血液常規(guī)及生化指標

（5）F/R凝膠促進小鼠感染MRSA的慢性傷口快速愈合

在C57BL/6小鼠背部制造感染耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）的全層切除傷口模型，分別用PBS、貝復(fù)濟凝膠、F/R微膠囊、空白凝膠和F/R凝膠處理。F/R凝膠組傷口閉合速度最快，第4天未愈合傷口面積降至約63.25%，第7天降至約32.56%，第14天幾乎完全愈合，愈合時間縮短約6-7天（圖6a-c）。F/R凝膠組傷口滲出液中細菌菌落數(shù)最低，第7天幾乎無菌（圖6d，e）。第4天，F(xiàn)/R凝膠組傷口中ROS和CD86熒光信號微弱，而M2型巨噬細胞（CD206）染色信號較強，表明炎癥減輕（圖6f）。第7天，F(xiàn)/R凝膠組炎癥不明顯，新生血管標志物CD31和VEGF表達更高，Ki67表達最高，表明細胞增殖活躍（圖6f，g）。第14天，F(xiàn)/R凝膠組再生皮膚中出現(xiàn)新形成的毛囊和皮脂腺，膠原沉積更成熟且排列有序（圖6f）。

圖6 F/R凝膠對小鼠MRSA感染慢性傷口的體內(nèi)快速愈合效果。（a）小鼠全動物實驗的實驗過程示意圖；（b）從第0天到第14天的傷口愈合變化的光學照片和模擬圖；（c）14天內(nèi)傷口面積的變化曲線；（d）2-7天間使用傷口滲出液進行菌落計數(shù)實驗與（e）代表性圖像；（f）在傷口愈合過程中對DHE（紅色）、CD86（綠色）、CD206（紅色）、CD31（紅色）、VEGF（紅色）、Ki67（綠色）和DAPI（藍色）的免疫熒光染色圖像；（g）CD86、iNOS、IL-1β、TNF-α、CD206、Arg1、IL-10和Ki67的相對mRNA表達

（6）F/R凝膠可抑制小鼠受MRSA感染的慢性傷口瘢痕的形成

對再生皮膚進行外觀檢查和組織病理學評估，重點關(guān)注瘢痕面積、色素沉著、表皮厚度、膠原比例及皮膚附屬器等參數(shù)。F/R凝膠組新生皮膚彈性更好，色素沉著更少，表皮顏色更均勻，組織凹陷更少。第28天，F(xiàn)/R凝膠組新生表皮顏色與周圍組織無明顯色差，而其他組變化不大（圖7a）。F/R凝膠組第21天瘢痕面積僅約17.51%，第28天接近0%，而對照組瘢痕面積從第21天的約59.88%升至第28天的約64.28%（圖7b）。F/R凝膠組表皮厚度接近正常皮膚（約20.54 μm vs.約20.57 μm），而對照組表皮厚度增加6倍（圖7c）。F/R凝膠組觀察到成熟的皮膚附屬器，數(shù)量與正常組織相當，免疫熒光染色證實毛囊形成（圖7c，d）。此外，F(xiàn)/R凝膠組再生組織中觀察到神經(jīng)束（β3-Tublin陽性）再生（圖7d）。

馬松三色染色顯示，F(xiàn)/R凝膠組膠原沉積更成熟、排列更有序，膠原體積分數(shù)值（CFV）更低（約23.90%），接近正常皮膚（約20%），而對照組為78.83%（圖7d，e）。F/R凝膠組I型膠原表達降低，III型膠原表達增加，表明其防止纖維化瘢痕形成的能力（圖7d-f）。c-Jun表達顯著緩解，TGF-β表達下降，而F/R MCs組中c-Jun表達未受影響，可能由于其在愈合過程中快速流失，突顯了凝膠系統(tǒng)協(xié)同促進無瘢痕愈合的必要性。

圖7 F/R凝膠減輕小鼠MRSA感染慢性傷口的纖維化疤痕形成。（a）從第21天到第28天的瘢痕區(qū)域變化的光學照片和模擬圖；（b）處理后瘢痕組織的變化曲線和顏色分析（L值越高表示顏色越白，A值越高表示顏色越紅）；（c）通過H&E染色分析的表皮厚度和毛囊計數(shù)；（d）第21天到第28天傷口組織的H&E染色、Masson染色以及COL I（紅色）、COL III（綠色）、TGF-β（紅色）、c-Jun（紅色）、CK19（綠色）、β3-Tublin（紅色）和DAPI（藍色）的免疫熒光染色圖像；（e）基于組織切片分析的膠原體積比、分形維度值和空隙度值；（f）第28天COL I、COL III和c-Jun的相對mRNA表達

（7）熒光激活細胞分選（FACS）和轉(zhuǎn)錄組測序分析

研究假設(shè)通過遞送堿性成纖維細胞生長因子（bFGF）和c-Jun小干擾RNA（c-Jun siRNA），可調(diào)節(jié)成纖維細胞亞型，實現(xiàn)抗纖維化傷口愈合。第7天流式細胞術(shù)（FACS）實驗顯示，F(xiàn)/R凝膠組中網(wǎng)狀成纖維細胞比例顯著低于對照組，而脂肪成纖維細胞比例增加（圖8a，b）。F/R凝膠組中α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）表達水平適度且穩(wěn)定，而其他組α-SMA表達持續(xù)升高，表明其存在纖維化風險（圖8d，e）。干細胞抗原-1（Sca-1）在F/R凝膠組中表達水平較高（圖8d，e）。第14天的轉(zhuǎn)錄組分析顯示，F(xiàn)/R凝膠組中有318個差異表達基因，其中175個上調(diào)，143個下調(diào)（圖8g）。Eln基因（編碼彈性蛋白）在F/R凝膠組中顯著上調(diào)（圖8h），與血管再生（Myl7）、肌肉再生（Myog）、毛囊發(fā)育和附屬器再生（Sp6、Gsdma3、Elf5）相關(guān)的基因也顯著上調(diào)，而與纖維化瘢痕形成相關(guān)的基因（如Ugt8a、Il-11、Gcgr、Tgfbr3l）表達下調(diào)。c-Jun表達在F/R凝膠組中受到抑制。KEGG通路富集分析顯示，代謝通路顯著富集，涉及IL-17、NF-κB、JAK-STAT、HIF-1和TGF-β通路（圖8i）。GO分析表明，差異表達基因主要參與細胞對TGF-β刺激的反應(yīng)等生物學過程（圖8j）。

圖8 通過FACS和轉(zhuǎn)錄組測序測量分析細胞分子水平的潛在調(diào)控機制。（a）FACS實驗對傷口組織的過程示意圖；（b）傷口組織中成纖維細胞亞型的流式細胞術(shù)結(jié)果；（c）通過c-Jun沉默策略調(diào)控的成纖維細胞亞型示意圖；（d）第7天、14天和28天傷口組織中的α-SMA（綠色）和Sca-1（紅色）標記物的免疫熒光染色圖像；（e）α-SMA和Sca-1信號的平均熒光強度；（f）測試樣本的Pearson相關(guān)系數(shù)矩陣熱圖；（g）F/R凝膠組與對照組在第14天的火山圖分析；（h）參與愈合過程的篩選差異表達基因的熱圖；（i）差異表達基因的KEGG富集分析；（j）GO富集分析

（8）F/R凝膠促進兔耳傷口無瘢痕愈合

在兔耳傷口模型中評估了F/R凝膠的抗瘢痕愈合效果。通過切除直徑8 mm的全層皮膚并感染耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）構(gòu)建兔耳增生性傷口模型（圖9a）。F/R凝膠顯著提高了傷口愈合效率，第7天傷口開始加速閉合，第14天愈合效率達約87.66%（圖9c）。對照組在第21天傷口閉合后出現(xiàn)嚴重紅色增生性瘢痕，第28天仍未消退，瘢痕面積約為28.3 mm2，占初始傷口面積的56.33%。而F/R凝膠組再生組織逐漸恢復(fù)至與周圍正常皮膚一致，表皮平整，顏色均一，彈性相似。

超聲成像、H&E染色和馬松三色染色結(jié)果顯示，F(xiàn)/R凝膠組組織更平整，厚度接近正常皮膚，表皮厚度與正常組織相近（圖9d-f）。F/R凝膠組的瘢痕評估指數(shù)（SEI）、瘢痕厚度和瘢痕隆起角度值最小（圖9e），瘢痕色素沉著評分較低。馬松染色顯示，F(xiàn)/R凝膠組膠原纖維沉積減少，排列有序，與正常皮膚相當，而其他組膠原纖維呈漩渦狀結(jié)構(gòu)（圖9f）。膠原纖維取向分布顯示，F(xiàn)/R凝膠組膠原排列與正常皮膚相似（圖9g）。這些結(jié)果表明，F(xiàn)/R凝膠在兔耳感染傷口模型中可有效加速傷口閉合并減輕纖維化瘢痕形成。

圖9 F/R凝膠對兔耳增生傷口的無瘢痕愈合效果。（a）兔耳傷口模型和隨后的動物實驗示意圖；（b）從第0天到第28天傷口愈合變化的光學照片、模擬圖及（c）統(tǒng)計數(shù)據(jù)；（d）評估與兔耳瘢痕形成相關(guān)的指標示意圖；（e）SEI、瘢痕厚度、瘢痕凸起角度和顏色測量的統(tǒng)計數(shù)據(jù)；（f）超聲成像（紅色虛線表示增生性瘢痕區(qū)）、H&E染色和Masson染色圖像；（g）基于f圖中的Masson染色圖像分析的膠原纖維方向分布