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針對上述問題，重慶大學的羅忠等團隊設(shè)計了一種基于水凝膠的生物活性合成皮膚（HBSS），該敷料材料由生物相容性組分構(gòu)成，用于燒傷創(chuàng)面的治療，能夠在局部介導硫化氫（H2S）的釋放，以刺激組織再生，同時抑制細菌感染和過度炎癥反應。具體而言，H2S供體——N-(苯甲酰巰基)苯甲酰胺首先與巰基酮（TK）連接的多巴胺二聚體共同組裝形成納米結(jié)構(gòu)（DDNs），隨后將其整合進以希夫堿為交聯(lián)方式的透明質(zhì)酸-羧甲基殼聚糖水凝膠中。在燒傷創(chuàng)面中升高的酸性環(huán)境可誘導水凝膠降解，釋放出DDNs；隨后，在活性氧（ROS）誘導下，TK連接鍵斷裂，釋放出H2S氣體，同時以自我消耗方式降低局部ROS應激水平。該過程可通過激活AMPK與RAS-MAPK-AP1等促愈合信號通路，促進局部血管生成和組織再生，同時通過激活ERK1/2與NRF2信號通路，實現(xiàn)巨噬細胞由M1型向M2型的免疫重編程。此外，水凝膠網(wǎng)絡(luò)中的殼聚糖組分可有效抑制創(chuàng)面部位的細菌定植，從而防止局部感染。這些特性協(xié)同作用，實現(xiàn)了快速而穩(wěn)健的燒傷創(chuàng)面愈合，為臨床燒傷治療提供了一種新的思路和策略。該文章于2025年4月10日以《Hydrogel-Based Bioactive Synthetic Skin Stimulates Regenerative Gas Signaling and Eliminates Interfacial Pathogens to Promote Burn Wound Healing》為題發(fā)表于《ACS NANO》（DOI：10.1021/acsnano.5c01134）。

研究示意圖

(1) DDNs和HBSS的制備與表征

透射電子顯微鏡（TEM）分析顯示，生成的DDNs具有均勻的球形形態(tài)和高單分散性（圖1A）。動態(tài)光散射（DLS）分析表明，NSHD的加入使納米粒子的尺寸從200 ± 5 nm略微增加至220 ± 7 nm，但對納米粒子的單分散性沒有明顯影響（圖1B）。ζ電位分析顯示，DDNs的表面電荷約為?33.1 mV，與原始PDA納米粒子的電荷（約?31.2 mV）相當（圖1C）。能量色散X射線譜（EDS）結(jié)果表明，硫信號均勻分布在納米粒子中，證實了NSHD成功加載到PDA基體中（圖1D）。通過紫外吸收法的定量分析，NSHD在最終納米粒子中的加載比率約為11.2%。這些數(shù)據(jù)共同確認了DDNs的高均一性和NSHD加載的簡便合成。本研究中使用的HBSS是通過透明質(zhì)酸（HA）和羧甲基殼聚糖（CMC）在希夫堿交聯(lián)作用下合成的。研究人員觀察到，OHA與CMC混合后5分鐘內(nèi)即形成水凝膠（圖1E）。掃描電子顯微鏡（SEM）成像顯示，OHA-CMC水凝膠具有高度多孔和互聯(lián)的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，典型的水凝膠生物材料特性，提供了豐富的空間用于DDN的負載（圖1F）。環(huán)境掃描電子顯微鏡（ESEM）結(jié)果顯示，DDNs能夠輕松地結(jié)合到OHA-CMC水凝膠基體中，最終納米粒子負載量約為85%（圖1G）。此外，傅里葉變換紅外光譜（FTIR）分析驗證了通過希夫堿交聯(lián)形成水凝膠，并成功集成了DDNs（圖1H）。

圖1.（A）DDN的TEM圖像。（B）通過DLS測量的DDN的粒度和分布。(C)DDN的Zeta電位。（D）DDN的EDS結(jié)果。（E）水凝膠形成過程的照片說明。（F）生成的水凝膠的SEM圖像。（G）HBSS樣品的SEM圖像。（H）HA、OHA、CMC、OHA-CMC和HBSS的FTIR光譜

（2）HBSS的力學性能、藥物釋放、抗氧化能力和抗菌性能

皮膚組織常受機械應力影響，這對燒傷創(chuàng)面敷料的機械穩(wěn)定性構(gòu)成挑戰(zhàn)。研究人員通過分析HBSS的壓縮和膨脹性能，研究了其在燒傷創(chuàng)面環(huán)境中的穩(wěn)定性。在OHA:CMC比例為3:1時，OHA-CMC水凝膠和HBSS的膨脹率分別為278%和267%（圖2A），有助于排出創(chuàng)面滲出液并保持濕潤環(huán)境，且HBSS的抗壓強度達到97.4 KPa（圖2B）。流變學測試表明，HBSS具有較高的儲能模量，適合作為燒傷創(chuàng)面敷料（圖2C）。HBSS在模擬燒傷創(chuàng)面滲出液中（500 μM H2O2，pH 6.5）孵育后，顯示出良好的降解性能，7天內(nèi)完全降解，剩余重量降至20%（圖2D, 2E）。DDNs在相同條件下處理2天后，TEM顯示其平均水動力學尺寸減少至120 ± 5 nm（圖2F），支持HBSS在創(chuàng)面環(huán)境中的降解釋放治療性載荷。H2S生成測試表明，酸性環(huán)境和H2O2能促進HBSS釋放H2S，4天后H2S釋放量達到32.5 μM（圖2G）。此外，DDNs具有顯著的抗氧化效果，能夠清除DPPH（圖2H, 2I），進一步證實HBSS能夠有效清除創(chuàng)面過量ROS，促進創(chuàng)面修復。研究人員測試了CMC整合的HBSS對常見燒傷創(chuàng)面感染病原菌（銅綠假單胞菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌）的抗菌效果。結(jié)果顯示，HBSS組的殺菌效率分別為60.3%、59.3%和67.8%，高于OHA-CMC組（圖2J?K）。細菌處理后的掃描電鏡（SEM）圖像顯示，細菌壁塌陷，證實了HBSS通過殼聚糖的抗菌作用有效消除附著細菌，防止創(chuàng)面感染（圖2L）。

圖2.（A）具有不同組成的水凝膠基樣品的溶脹特性。（B）具有不同組成的水凝膠基樣品的壓縮性能。（C）HBSS和OHA-CMC樣品之間生物力學性能的比較分析。（D）水凝膠基樣品隨時間降解的照片說明。（E）水凝膠基樣品的降解率。（F）H2O2引發(fā)降解前后DDN尺寸的比較。（G）不同條件下HBSS隨時間的H2S釋放曲線。（H）不同濃度下DDN的DPPH清除能力。（I）無DDN的OHA-CMC水凝膠和HBSS的DPPH清除能力。（K）不同水凝膠基樣品的抗菌活性的統(tǒng)計分析。（L）不同處理后金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和銅綠假單胞菌的SEM圖像

（3）HBSS的體外生物相容性

為了研究HBSS在臨床相關(guān)條件下的安全性，研究人員首先通過CCK-8法在跨腔培養(yǎng)系統(tǒng)中測試了其對皮膚細胞群體的生物相容性（圖3A），其中水凝膠放置在上室，細胞接種在下室。測試的細胞系包括HUVECs、L929s和RAW 264.7。結(jié)果表明，HUVECs、L929s和RAW 264.7細胞在與HBSS孵育3天后，細胞活力未出現(xiàn)明顯下降（圖3B、C）。這些結(jié)果也通過共聚焦激光掃描顯微鏡（CLSM）進一步驗證（圖3E）。這些觀察結(jié)果表明，由于選用了生物相容性生物聚合物成分，HBSS無毒。為確保足夠的ROS清除效果，使用ROS反應性熒光探針DCFH-DA進行的熒光成像顯示，HBSS處理能有效清除細胞內(nèi)的ROS（圖3D），再次驗證了HBSS衍生的巰基化多巴胺單元對ROS清除的貢獻（圖3F）。有趣的是，WB分析顯示，HBSS處理顯著激活了巨噬細胞群體中的Nrf2信號通路（圖3G?I），這是一種在活細胞中已知的抗氧化機制，可能有助于清除燒傷創(chuàng)面引發(fā)的皮膚細胞中的ROS。Nrf2和血紅素加氧酶-1（HO-1）的相對表達分別比對照組高出108%和92%。總體而言，HBSS能夠高效減輕生物環(huán)境中的ROS應激，且具有較高的安全性，能夠促進細胞增殖。

圖3.（A）transwell共培養(yǎng)系統(tǒng)示意圖。（B）與不同樣品孵育3天后的L929存活率（。（C）與不同樣品孵育3天后的HUVEC存活率。（D）響應于不同處理的L929細胞和HUVEC中ROS的相對含量。（E）顯示不同處理后L929細胞和HUVEC增殖的熒光圖像（（F）不同樣品減輕皮膚相關(guān)細胞中氧化應激的能力。（G）用不同樣品處理后巨噬細胞中Nrf 2和HO-1蛋白的表達水平。（H）不同處理后巨噬細胞中Nrf 2蛋白的相對表達。（I）HO-1蛋白的相對表達。處理組的設(shè)置：NaSH、對照（PBS）、OHA-CMC水凝膠、水凝膠-PDA NP復合物（HPN）和負載NSHD的水凝膠（HN）組

圖4. (A)不同處理后L929 s、HUVECs和RAW 264.7細胞中的H2S水平。（B）HUVECs的管形成效率。（C）血管分支數(shù)目的統(tǒng)計分析。（D）不同處理后血管長度的統(tǒng)計分析。（E）AMPK、p-AMPK、TXNIP、（F）不同處理后L929細胞的遷移能力。（G）不同處理后L929細胞中MEK 1、AP-1和RAS蛋白的表達

（5）HBSS的抗炎作用

為研究HBSS是否通過改變巨噬細胞組成來逆轉(zhuǎn)SBW的炎癥狀態(tài)，研究人員首先用LPS誘導RAW 264.7細胞轉(zhuǎn)變?yōu)镸1表型，并監(jiān)測其形態(tài)學變化。LPS處理后的RAW 264.7細胞表現(xiàn)為橢圓形和突觸形態(tài)，且iNOS表達顯著上調(diào)，表明成功誘導為促炎M1型表型。與此相比，HBSS處理后的LPS誘導RAW 264.7細胞表現(xiàn)出從變形蟲形態(tài)到梭形形態(tài)的顯著變化，天線形成減少（圖5A），并伴隨M2特征標記物CD206的上調(diào)。免疫熒光分析顯示，HBSS處理的巨噬細胞iNOS表達降低，而CD206表達增加（圖5B）。在巨噬細胞表型變化的基礎(chǔ)上，研究人員進一步通過ELISA測試評估了培養(yǎng)體系中的細胞因子分泌情況。LPS誘導顯著降低抗炎細胞因子IL-4和IL-10的分泌，同時增加了促炎細胞因子如TNF-α和IL-1β的分泌，表明巨噬細胞的促炎潛力增強。與此不同，HBSS處理LPS誘導的RAW 264.7細胞顯著增加了IL-4和IL-10的分泌，同時減少了IL-1β和TNF-α的分泌（圖5C?F）。這些趨勢與q-PCR分析中相關(guān)細胞因子mRNA水平的結(jié)果一致，表明HBSS能夠?qū)1型巨噬細胞重新編程為M2型表型，從而抑制過度的炎癥反應（圖5G?J）。進一步分析HBSS處理后巨噬細胞的生化變化，證實了多巴胺單體和H?S通過清除創(chuàng)面微環(huán)境中的ROS，能夠阻斷相關(guān)的促炎信號事件，從而減輕局部炎癥。WB分析顯示，HBSS處理顯著激活了MAPK-Erk1/2-p38信號通路，這與H?S的抗炎作用一致（圖5K?M）。因此，這些作用協(xié)同介導了M1型巨噬細胞向M2型的高效重編程，并抑制了下游的炎癥反應。

圖5. (A)各種處理后LPS誘導的巨噬細胞的形態(tài)學變化。（B）用樣品處理后LPS誘導的巨噬細胞中CD 206和iNOS的表達。（C-F）用不同樣品處理后不同巨噬細胞中IL-1β、TNF-α、IL-4和IL-10的表達水平。（G-J）用不同樣品處理后不同巨噬細胞中TNF-α、IL-1β、IL-4和IL-10的表達。（K）WB檢測不同樣品處理后巨噬細胞中p-p38和p-Erk 1/2蛋白的表達;（L）不同樣品處理后巨噬細胞中p-Erk 1/2蛋白的相對表達;（M）不同樣品處理后巨噬細胞中p-Erk 1/2蛋白的相對表達。p38的表達

（6）HBSS在體內(nèi)的SBW治療功效

研究人員在背部帶有1 cm2圓形感染性三度燒傷創(chuàng)面的小鼠模型上全面研究了HBSS治療對燒傷創(chuàng)面（SBW）愈合的促進作用（圖6A）。HBSS治療顯著減少了創(chuàng)面面積，治療14天后創(chuàng)面幾乎完全愈合，表面形成小結(jié)痂，并無感染跡象（圖6B）。相比之下，控制組和OHA-CMC組在第14天創(chuàng)面明顯較大，創(chuàng)面處有可見滲出液，表明感染性SBW的愈合不足。定量分析顯示，HBSS組的最終創(chuàng)面面積最小，比治療組的對照組小35%（圖6C）。通過HE染色和Masson三色染色進一步分析了不同治療組的SBW愈合情況，在治療7天時，HBSS組顯著提高了創(chuàng)面區(qū)域的上皮覆蓋度，并部分再生了受損的毛囊（圖6E）。到治療第14天，HBSS組創(chuàng)面幾乎完全愈合，創(chuàng)面上皮完全重建。Masson染色結(jié)果顯示，HBSS組的膠原沉積優(yōu)于其他所有組，幾乎與健康皮膚組織相當（圖6F）。另外，研究人員通過免疫熒光染色CD31和Ki67檢測了創(chuàng)面組織的血管化，表明創(chuàng)面再生的強度（圖7A）。HBSS組的毛細血管密度是對照組的1.9倍，明顯高于其他處理組（圖7B、C），表明創(chuàng)面區(qū)域的血管系統(tǒng)成功恢復，促進了適當?shù)膫谟?。WB分析顯示，HBSS處理顯著激活了AMPK和AP1信號通路（圖6D），這一結(jié)果與體外數(shù)據(jù)一致，支持了提出的傷口愈合機制。這些數(shù)據(jù)表明，HBSS可以高效加速感染性SBW的愈合，且具有較高的安全性。

圖6.（A）實驗方案的示意圖。（B）顯示從第0天到第14天的各種治療后建立的SBW傷口的時間依賴性愈合的代表性照片。（C）從第0天到第14天的不同治療后傷口面積的定量分析。比例尺：（D）不同處理后小鼠中關(guān)鍵蛋白介質(zhì)表達的WB測定。（E，F(xiàn)）第7天和第14天傷口組織的代表性（E）H&E和（F）Masson染色圖像

（7）HBSS介導的體內(nèi)巨噬細胞重編程

研究人員進一步分析了燒傷創(chuàng)面（SBW）部位的巨噬細胞組成，以闡明愈合機制。結(jié)果顯示，控制組的SBW組織在治療7天后表現(xiàn)出高水平的iNOS和低水平的CD206，表明創(chuàng)面仍受到嚴重炎癥的影響。相比之下，HBSS治療顯著上調(diào)了CD206的表達，同時降低了iNOS的表達（圖7D、E）。具體而言，HBSS組CD206的水平比未處理的對照組高1.92倍，而iNOS水平降低了62.14%（圖7F、G），表明HBSS治療能夠有效地將巨噬細胞從促炎M1表型重編程為抗炎M2表型，有助于緩解SBW部位的過度炎癥反應。同時，通過PCR檢測創(chuàng)面組織中與炎癥相關(guān)的細胞因子的mRNA水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)HBSS治療顯著下調(diào)了TNF-α和IL-1β的mRNA表達，同時恢復了IL-4和IL-10的mRNA表達，其細胞豐度與健康皮膚組織相當（圖7H?K）。此外，創(chuàng)面組織的生化分析顯示，HBSS顯著激活了NRF-2和ERK1/2信號通路，有效抑制了過度的炎癥反應（圖7L?O）。綜上所述，HBSS能夠通過減輕巨噬細胞介導的慢性炎癥反應，促進SBW的愈合。

圖7.(A)治療14天后傷口的CD 31和Ki 67免疫染色。（B）CD 31表達的統(tǒng)計。（C）Ki 67表達的統(tǒng)計。（D）治療14天后傷口中CD 206表達的免疫染色。(E)治療14天后傷口中的iNOS免疫染色。（F）CD 206表達的統(tǒng)計。（G）iNOS表達的統(tǒng)計分析（細胞核用DAPI（藍色）標記）。（H?K）正常小鼠皮膚和不同實驗組TNF-α、IL-1β、IL-4和IL-10的相對表達，（L）WB檢測不同處理后小鼠p-Erk 1/2和p-p38蛋白的表達。(M)不同處理后小鼠中Nrf 2和HO-1蛋白的WB測定。（N-O）圖L和M中蛋白表達的統(tǒng)計學