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針對(duì)上述問(wèn)題，中國(guó)科學(xué)院大學(xué)王育才教授團(tuán)隊(duì)提出了一種體內(nèi)產(chǎn)生耐受性抗原呈遞細(xì)胞（tol-APCs）的新方法，專(zhuān)門(mén)針對(duì)自身免疫性疾病中激活的T細(xì)胞。該方法通過(guò)低免疫原性的mRNA遞送在APCs上產(chǎn)生負(fù)共刺激分子。與激活A(yù)PCs的傳統(tǒng)脂質(zhì)納米顆粒（LNPs）不同，這些專(zhuān)用LNPs旨在最小化免疫原性。通過(guò)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)（DOE）方法優(yōu)化了LNPs的N/P比和組成，以降低免疫原性。研究將編碼關(guān)鍵負(fù)共刺激信號(hào)的PDL1 mRNA封裝到這些專(zhuān)用LNPs中，稱(chēng)為L(zhǎng)NPs/mPDL1。皮下注射后，LNPs/mPDL1被APCs優(yōu)先攝取，從而在體內(nèi)產(chǎn)生PDL1+的tol-APCs。這些tol-APCs通過(guò)PDL1/PD1途徑特異性靶向過(guò)度激活的T細(xì)胞，同時(shí)保留未激活的T細(xì)胞，從而提高治療的安全性。在類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎和潰瘍性結(jié)腸炎的小鼠模型中，該方法不僅抑制了T細(xì)胞的過(guò)度活化，還誘導(dǎo)了調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的擴(kuò)增，減少了炎癥，并顯著減緩了疾病進(jìn)展。該文章于2025年3月28日以《Generation of tolerogenic antigen-presenting cells in vivo via the delivery of mRNA encoding PDL1 within lipid nanoparticles》為題發(fā)表于《Nature Biomedical Engineering》（DOI：10.1038/s41551-025-01373-0）。

圖1：LNPs/mPDL1在體內(nèi)產(chǎn)生的耐受性抗原呈遞細(xì)胞（tol-APCs）用于治療自身免疫性疾?。ˋIDs）。（A）LNPs/mPDL1在體內(nèi)產(chǎn)生tol-APCs的概念示意圖；（B）tol-APCs緩解AIDs的機(jī)制：減少TH1和TH17細(xì)胞，增加Treg細(xì)胞，誘導(dǎo)激活T細(xì)胞凋亡，選擇性靶向激活T細(xì)胞

（1）使用DOE優(yōu)化低免疫原性的LNP

在治療自身免疫性疾?。ˋIDs）時(shí)，目前用于mRNA疫苗佐劑的脂質(zhì)納米顆粒（LNP）配方可能上調(diào)抗原呈遞細(xì)胞（APCs）上共刺激分子（如CD80、CD86和CD40）的表達(dá)，從而引發(fā)非預(yù)期的免疫反應(yīng)。為開(kāi)發(fā)低免疫原性的LNP配方用于AIDs的mRNA治療，研究者系統(tǒng)調(diào)整了LNP配方中四種成分（SM-102、DSPC、DMG-PEG2000和膽固醇）的摩爾比例及N/P比值。以Moderna新冠mRNA疫苗的LNP配方（A0）為參考，通過(guò)Taguchi OA設(shè)計(jì)創(chuàng)建了包含9種配方的庫(kù)A，包裹增強(qiáng)型綠色熒光蛋白（EGFP）mRNA作為報(bào)告基因。在小鼠皮下注射后，評(píng)估了這些配方的免疫原性（圖2a、b）。結(jié)果顯示，LNP的組成和N/P比值顯著影響轉(zhuǎn)染效率和免疫原性，體現(xiàn)在樹(shù)突狀細(xì)胞（DCs）上EGFP和共刺激分子CD80、CD86、CD40的表達(dá)水平差異（圖2c–e），且N/P比值與LNP免疫原性之間存在顯著相關(guān)性。配方A7（SM-102：DSPC：DMG-PEG：膽固醇 = 25:5:0.5:69.5；N/P = 4）在淋巴結(jié)中總DCs和EGFP+ DCs上共刺激分子的表達(dá)水平最低（圖2c–f）。基于A7的進(jìn)一步優(yōu)化產(chǎn)生了庫(kù)B，數(shù)據(jù)顯示A7在庫(kù)B配方中總DCs和EGFP+ DCs上共刺激分子的表達(dá)最低（圖2h–k）。因此，A7被選為用于AIDs體內(nèi)研究的最優(yōu)LNP配方。

圖2：使用實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)（DOE）優(yōu)化低免疫原性L(fǎng)NP配方。（A）篩選低免疫原性L(fǎng)NP配方的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)流程；（B）A庫(kù)配方參數(shù)；（C–E）A庫(kù)配方處理后DCs表面CD80、CD86和CD40的流式細(xì)胞術(shù)分析；（F）EGFP+ DCs表面CD80的流式細(xì)胞術(shù)分析；（G）B庫(kù)配方參數(shù)；（H–J）B庫(kù)配方處理后DCs表面CD80、CD86和CD40的流式細(xì)胞術(shù)分析；（K）EGFP+ DCs表面CD80的流式細(xì)胞術(shù)分析

（2）LNPs/mPDL1 治療在體外和體內(nèi)產(chǎn)生 tol-APC

A7配方的脂質(zhì)納米顆粒（LNP）被用于包裹編碼PDL1的mRNA，制備了LNPs/mPDL1。PDL1 mRNA經(jīng)體外轉(zhuǎn)錄、密碼子優(yōu)化、帽子修飾及尿苷替換為N1-甲基偽尿苷，LNPs/mPDL1的平均粒徑為173 nm，zeta電位為12.9 mV。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，經(jīng)LNPs/mPDL1處理24小時(shí)的DC2.4和RAW264.7細(xì)胞，PDL1表達(dá)顯著高于經(jīng)空LNPs或PBS處理的細(xì)胞，表明其可有效將APCs轉(zhuǎn)化為tol-APCs（圖3a–d）。小鼠皮下注射LNPs/mPDL1后，淋巴結(jié)中CD11c+和CD11b+細(xì)胞表面PDL1表達(dá)較高，而CD11b? CD11c?細(xì)胞表面PDL1表達(dá)較低（圖3f、g）。脾臟和外周血中觀察到類(lèi)似結(jié)果，但骨髓中未產(chǎn)生tol-APCs，且誘導(dǎo)的tol-APCs至少維持4天（圖3h、i）。LNPs/mPDL1處理對(duì)共刺激分子表達(dá)的影響顯示，淋巴結(jié)中總APCs上CD80表達(dá)略有增加，CD86和CD40表達(dá)降低；PDL1+ tol-APCs上CD80和CD86表達(dá)增加，CD40表達(dá)降低。脾臟中這些分子在總APCs上表達(dá)適度增加，但在PDL1+ tol-APCs上無(wú)變化或降低，外周血中各APC群體未觀察到變化。結(jié)果表明，LNPs/mPDL1可在體內(nèi)高效生成tol-APCs，且主要影響APCs，對(duì)非APC免疫細(xì)胞影響極小。

圖3：LNPs/mPDL1處理產(chǎn)生的tol-APCs。（A，B）LNPs/mPDL1處理后DC2.4細(xì)胞和RAW264.7細(xì)胞的PDL1表達(dá)（共聚焦顯微鏡圖像及定量分析）；（C，D）流式細(xì)胞術(shù)分析DC2.4細(xì)胞和RAW264.7細(xì)胞表面PDL1表達(dá)；（E）LNPs/mPDL1在體內(nèi)產(chǎn)生PDL1+ APCs的示意圖；（F，G）LNPs/mPDL1處理后腹股溝淋巴結(jié)中CD11c+和CD11b+細(xì)胞表面PDL1的流式細(xì)胞術(shù)分析；（H）LNPs/mPDL1在C57BL/6小鼠中的給藥時(shí)間表；（I）LNPs/mPDL1處理后腹股溝淋巴結(jié)中CD11c+和CD11b+細(xì)胞表面PDL1的流式細(xì)胞術(shù)分析

（3）PDL1⁺tol-APCs在體外選擇性降低活化T細(xì)胞

PD1在激活的T細(xì)胞上表達(dá)水平較高，而在幼稚T細(xì)胞上表達(dá)較低，對(duì)防止T細(xì)胞過(guò)度激活和促進(jìn)免疫耐受起關(guān)鍵作用（圖4a、b）。體外實(shí)驗(yàn)中，用CD3/CD28激動(dòng)劑抗體（αCD3/CD28）刺激的T細(xì)胞PD1表達(dá)水平更高，模擬了體內(nèi)T細(xì)胞的激活狀態(tài)。為探究由LNPs/mPDL1產(chǎn)生的tol-APCs是否能抑制T細(xì)胞反應(yīng)，將激活的T細(xì)胞用羧基熒光素琥珀酰亞胺酯（CFSE）標(biāo)記后，與通過(guò)LNPs/mPDL1處理生成的PDL1+ tol-DCs共培養(yǎng)（圖4a）。48小時(shí)后，觀察到CD4+和CD8+ T細(xì)胞的增殖顯著減少（圖4c）。此外，PDL1作為程序性死亡配體，與激活T細(xì)胞上的PD1結(jié)合可誘導(dǎo)凋亡。因此，研究了由LNPs/mPDL1產(chǎn)生的tol-APCs是否能選擇性地促進(jìn)過(guò)度激活的T細(xì)胞凋亡。將經(jīng)PBS、LNPs或LNPs/mPDL1處理的DCs與刺激或未刺激的T細(xì)胞共培養(yǎng)12小時(shí)（圖4d）。結(jié)果顯示，由LNPs/mPDL1產(chǎn)生的tol-APCs顯著促進(jìn)了刺激T細(xì)胞的凋亡，但對(duì)未刺激T細(xì)胞無(wú)影響（圖4e、f）。這一效應(yīng)通過(guò)刺激T細(xì)胞中增強(qiáng)的caspase-3/7活性得到進(jìn)一步證實(shí)。

圖4：LNPs/mPDL1產(chǎn)生的tol-APCs在體外抑制激活T細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)其凋亡。（A）T細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)方案；（B）刺激和未刺激T細(xì)胞上PD1的表達(dá)；（C）CFSE標(biāo)記的刺激T細(xì)胞的增殖；（D）T細(xì)胞死亡實(shí)驗(yàn)方案；（E，F(xiàn)）Annexin V/PI染色分析刺激和未刺激T細(xì)胞的凋亡和壞死比例

（4）PDL1⁺tol-APC 選擇性降低體內(nèi)活化的 T 細(xì)胞

通過(guò)過(guò)繼細(xì)胞轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探究了LNPs/mPDL1在體內(nèi)產(chǎn)生的tol-APCs是否能選擇性減少激活的T細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)使用BALB/c裸鼠以減少宿主免疫系統(tǒng)對(duì)轉(zhuǎn)移細(xì)胞的清除。小鼠皮下注射PBS、LNPs或LNPs/mPDL1。從BALB/c小鼠脾臟中分離T細(xì)胞，用αCD3/CD28激活并標(biāo)記不同濃度的CFSE，其中未刺激T細(xì)胞（未用αCD3/CD28處理）CFSE水平低，刺激T細(xì)胞CFSE水平高。兩種T細(xì)胞按1:1比例混合后，在LNPs/mPDL1注射24小時(shí)后過(guò)繼轉(zhuǎn)移至BALB/c裸鼠（圖5a）。流式細(xì)胞術(shù)分析證實(shí)了受體小鼠體內(nèi)有效生成了tol-DCs（圖5b）。經(jīng)LNPs/mPDL1處理的小鼠中，刺激T細(xì)胞的比例顯著降低（圖5c）。對(duì)于轉(zhuǎn)移的T細(xì)胞，LNPs/mPDL1處理小鼠中刺激T細(xì)胞在總轉(zhuǎn)移T細(xì)胞中的比例以及刺激T細(xì)胞與未刺激T細(xì)胞的比值均顯著低于對(duì)照組（圖5d、e）。具體而言，LNPs/mPDL1在體內(nèi)選擇性減少了轉(zhuǎn)移的激活CD4+和CD8+ T細(xì)胞，降低了小鼠脾臟中激活與未激活CD4+和CD8+ T細(xì)胞的比值，同時(shí)增加了未激活T細(xì)胞的比例（圖5f、g）。這些結(jié)果表明，皮下注射LNPs/mPDL1可選擇性減少過(guò)度激活的T細(xì)胞，對(duì)幼稚T細(xì)胞影響極小，突顯了該方法的治療安全性（圖5h）。

圖5：LNPs/mPDL1處理在體內(nèi)產(chǎn)生的tol-APCs選擇性減少激活的T細(xì)胞。（A）T細(xì)胞過(guò)繼轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)示意圖；（B）CD11c+細(xì)胞表面PDL1的表達(dá)；（C）轉(zhuǎn)移的刺激T細(xì)胞在總脾細(xì)胞中的比例；（D）轉(zhuǎn)移T細(xì)胞的定量分析；（E）轉(zhuǎn)移的刺激T細(xì)胞與未刺激T細(xì)胞的比例；（F）轉(zhuǎn)移的刺激CD4+ T細(xì)胞在總轉(zhuǎn)移CD4+ T細(xì)胞中的比例；（G）轉(zhuǎn)移的刺激CD8+ T細(xì)胞在總轉(zhuǎn)移CD8+ T細(xì)胞中的比例；（H）tol-APCs選擇性靶向激活T細(xì)胞的示意圖

（6）體內(nèi)產(chǎn)生的tol-APC可改善小鼠的RA進(jìn)展

在類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（RA）小鼠模型中評(píng)估了LNPs/mPDL1的治療潛力。DBA/1小鼠在第0天和第21天用II型膠原免疫建立RA模型。第28天，小鼠分為4組：未處理對(duì)照組、LNPs組、LNPs/mPDL1組和依那西普（iTNF-α）組，各組分別在第28天、第32天、第36天和第40天接受處理，并在第42天前每隔一天評(píng)估關(guān)節(jié)炎指數(shù)（圖6a）。結(jié)果顯示，LNPs/mPDL1在RA模型小鼠中有效生成了tol-APCs（補(bǔ)充圖21），顯著延緩了疾病進(jìn)展，關(guān)節(jié)腫脹和炎癥反應(yīng)得到緩解，效果與iTNF-α相當(dāng)（圖6b–d）。第42天，后膝關(guān)節(jié)Safranin O/fast green（SO/FG）染色顯示LNPs/mPDL1和iTNF-α組小鼠軟骨厚度顯著增加（圖6e、g及擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖1a）。免疫組化（IHC）染色證實(shí)，治療后關(guān)節(jié)中IFN-γ和TNF-α等炎癥因子減少（圖6f、g及擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖1b、c）。LNPs/mPDL1處理的小鼠后膝關(guān)節(jié)中CD8+ T細(xì)胞和CD4+ T細(xì)胞浸潤(rùn)顯著減少，Treg細(xì)胞增加（擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖1d–g）。流式細(xì)胞術(shù)分析顯示，LNPs/mPDL1處理后，淋巴結(jié)中產(chǎn)生促炎細(xì)胞因子IL-17A、TNF-α或IFN-γ的CD4+ T細(xì)胞顯著減少，而Treg細(xì)胞增加（補(bǔ)充圖22和23），且LNPs/mPDL1在減少促炎性CD4+ T細(xì)胞方面比iTNF-α更有效。此外，LNPs/mPDL1處理后，RA小鼠脾臟、腋窩和腹股溝淋巴結(jié)以及血液中的循環(huán)效應(yīng)T（Teff）細(xì)胞顯著減少（補(bǔ)充圖24和25）。綜上所述，LNPs/mPDL1治療可有效緩解RA癥狀。

圖6：LNPs/mPDL1在體內(nèi)產(chǎn)生的tol-APCs抑制類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（RA）的進(jìn)展。（A）RA誘導(dǎo)及治療方案；（B）RA小鼠隨時(shí)間變化的平均關(guān)節(jié)炎指數(shù)；（C）RA小鼠的腳跟墊典型圖像；（D）RA小鼠隨時(shí)間變化的爪子厚度；（E，F(xiàn)）關(guān)節(jié)切片的SO/FG染色和IFN-γ、TNF-α染色圖像；（G）tol-APCs在RA關(guān)節(jié)中減少炎癥細(xì)胞和細(xì)胞因子的示意圖

（7）體內(nèi)產(chǎn)生的tol-APC可緩解DSS誘發(fā)的小鼠的UC

在DSS誘導(dǎo)的潰瘍性結(jié)腸炎（UC）小鼠模型中，C57BL/6小鼠隨機(jī)分為4組，第0–7天飲用3% DSS水，第1、3、5天分別接受PBS、LNPs、LNPs/mPDL1和環(huán)孢素處理（圖7a）。健康小鼠作為對(duì)照。結(jié)果顯示，LNPs/mPDL1在UC模型小鼠中有效誘導(dǎo)tol-APCs，顯著降低DAI評(píng)分（圖7b、c，補(bǔ)充圖26），減輕體重下降（圖7d），恢復(fù)結(jié)腸長(zhǎng)度（圖7e、f），結(jié)腸長(zhǎng)度從PBS處理的5.6 cm恢復(fù)至6.6 cm。組織學(xué)分析顯示LNPs/mPDL1緩解了UC小鼠的壞死細(xì)胞、黏膜損傷和腺窩結(jié)構(gòu)破壞（圖7g），治療效果與環(huán)孢素相當(dāng)。IHC染色顯示LNPs/mPDL1顯著減少CD4+和CD8+ T細(xì)胞浸潤(rùn)，增加Treg細(xì)胞水平，降低腸道炎癥部位TNF-α水平（圖7h，擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖2）。流式細(xì)胞術(shù)分析顯示，LNPs/mPDL1處理后，與環(huán)孢素等其他組相比，TH17細(xì)胞減少，Treg細(xì)胞增加（圖7i，補(bǔ)充圖27）。此外，LNPs/mPDL1顯著減少腸系膜和腹股溝淋巴結(jié)、脾臟和血液中的效應(yīng)T（Teff）細(xì)胞（補(bǔ)充圖28）。綜上所述，LNPs/mPDL1在緩解DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎方面表現(xiàn)出有效性。

圖7：LNPs/mPDL1在體內(nèi)產(chǎn)生的tol-APCs在DSS誘導(dǎo)的潰瘍性結(jié)腸炎（UC）小鼠中發(fā)揮治療作用。（A）UC誘導(dǎo)及治療方案；（B）疾病進(jìn)展的DAI評(píng)分；（C）第7天的DAI評(píng)分；（D）體重變化；（E，F(xiàn)）小鼠結(jié)腸圖像及長(zhǎng)度；（G）結(jié)腸切片的H&E染色及組織學(xué)評(píng)分；（H）CD4免疫組化染色及CD4+細(xì)胞數(shù)量分析；（I）腸系膜淋巴結(jié)中CD4+ T細(xì)胞的IL-17A表達(dá)分析