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針對(duì)上述問(wèn)題，四川大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)院范紅松教授團(tuán)隊(duì)開(kāi)發(fā)了一種能夠可逆調(diào)整剛度變化的磁性縱水凝膠平臺(tái)，以研究磁性介導(dǎo)的細(xì)胞生態(tài)位機(jī)械調(diào)節(jié)對(duì)骨間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSC）神經(jīng)分化的影響。制備了由膠原蛋白（Col）和雙改性透明質(zhì)酸（DHA）組成的雙交聯(lián)水凝膠，以提供支持細(xì)胞生長(zhǎng)的基本生物活性基質(zhì)。通過(guò)摻入多巴胺包被的Fe3O4MNP（FO@PDA），磁誘導(dǎo)水凝膠網(wǎng)絡(luò)的應(yīng)變硬化/軟化，控制水凝膠模量實(shí)現(xiàn)BMSCs神經(jīng)分化和神經(jīng)再生，水凝膠命名為DHAC-F（Double-modified HA-Col-FO@PDA）。使用離合器加固模型解釋具有模量振動(dòng)的磁性開(kāi)關(guān)水凝膠基質(zhì)對(duì)BMSCs神經(jīng)突伸長(zhǎng)的影響。研究揭示了基質(zhì)抗性介導(dǎo)PI3K/AKT信號(hào)通路和鈣信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路機(jī)制。項(xiàng)研究證明了磁性縱水凝膠系統(tǒng)在體內(nèi)創(chuàng)傷修復(fù)中的潛力，為組織再生和創(chuàng)傷治療的新生物材料的設(shè)計(jì)和臨床治療策略提供了啟示。該文章于2024年3月15日以《Magnetic on–off manipulated matrix mechanic vibration to enhance cell clutches-reinforcement and Ca²⁺ influx facilitating BMSCs neural differentiation and TBI repair》為題發(fā)表于《Chemical Engineering Journal》 （DOI：10.1016/j.cej.2024.149521）。

研究示意圖

（1） 磁縱雜化 DHAC-F 水凝膠的制備和表征

通過(guò)三重交聯(lián)過(guò)程制備了磁性縱可逆水凝膠（DHAC-F）（圖1A），包括Col分子自組裝、Col和DHA之間的動(dòng)態(tài)亞胺交聯(lián)以及DHA的紫外線觸發(fā)自由基聚合。為調(diào)節(jié)水凝膠剛度，摻入FO@PDA MNP并與DHA發(fā)生可逆亞胺交聯(lián)。研究了不同F(xiàn)O@PDA MNP濃度的純DHAC水凝膠和磁性DHAC-F水凝膠（DHAC-FL、DHAC-FM和DHAC-FH）的溶脹和降解行為，發(fā)現(xiàn)DHAC-FH水凝膠隨FO@PDA MNP濃度增加，溶脹率最低（圖1B），降解動(dòng)力學(xué)最慢（圖1C）。DA包被納米顆粒通過(guò)靜電相互作用削弱了HA鏈羧基與水凝膠的靜電排斥及與水分子的氫鍵形成。測(cè)量四種水凝膠初始剛度，所有楊氏模量均<2kPa（圖1D），DHAC-F水凝膠楊氏模量高于不含MNP的DHAC水凝膠，因其納米復(fù)合增韌及PDA包被MNPs作為額外交聯(lián)劑增強(qiáng)了網(wǎng)絡(luò)密度和穩(wěn)定性，但三種DHAC-F水凝膠初始楊氏模量無(wú)顯著差異。SEM圖像顯示四種水凝膠均有相互連接微孔結(jié)構(gòu)（圖1E），且三種DHAC-F水凝膠中FO@PDA MNPs分布均勻，孔隙率和孔徑隨其濃度增加而增加（圖1F&G）。隨FO@PDA MNP濃度增加，納米增強(qiáng)效應(yīng)及額外交聯(lián)增加DHAC-F水凝膠剛度，但也破壞了水凝膠網(wǎng)絡(luò)分子間相互作用和交聯(lián)（圖1H），不過(guò)三種DHAC-F水凝膠初始楊氏模量無(wú)明顯差異。

圖1磁縱雜化 DHAC-F 水凝膠的制備和表征。（A）具有多種交聯(lián)的 DHAC-F 水凝膠的制備。（B） DHAC 水凝膠和 DHAC-F 水凝膠的溶脹行為和 （C） 降解行為。（D） 不含任何 NPs 的 DHA 水凝膠和具有不同 FO@PDA NP 濃度的 DHAC-F 水凝膠（DHAC-FL、DHAC-FM 和 DHAC-FH）的楊氏模量。（E） DHAC-F 水凝膠多孔網(wǎng)絡(luò)的 SEM 圖像（白色箭頭：FO@PDA NP）。（F） DHAC 水凝膠和 DHAC-F 水凝膠的孔隙率和 （G） 孔徑。（H） FO@PDA MNP 和 HA 鏈之間相互作用的示意圖

（2）DHAC-F 水凝膠的磁性開(kāi)-關(guān)縱機(jī)械曲線

根據(jù)磁流變水凝膠假說(shuō)，MF存在時(shí)磁性FO@PDA MNP通過(guò)可逆亞胺鍵共價(jià)鍵合到水凝膠網(wǎng)絡(luò)上，沿MF方向擺動(dòng)產(chǎn)生額外應(yīng)力，導(dǎo)致水凝膠磁性硬化（圖2A）。使用磁流變儀將軸向MF施加于水凝膠（圖2B），采用0到0.2T的脈沖MF（持續(xù)1分鐘）研究其磁力學(xué)曲線（圖2C）。無(wú)MNP的DHAC水凝膠儲(chǔ)能模量（G’）和損耗模量（G''）與MF無(wú)關(guān)，其模量的輕微振動(dòng)可能是由測(cè)量時(shí)施加的剪切力引起（圖2D）。集成MNP的水凝膠在0和0.2T的二元MF下顯示三個(gè)循環(huán)的替代G’和G''（圖2E&F），所有三種集成MNP的水凝膠對(duì)外部MF響應(yīng)迅速，剛度在每個(gè)循環(huán)60s內(nèi)達(dá)到最大值。G’最大值隨FO@PDA MNPs濃度增加而增加，DHAC-FL為~2.5kPa，DHAC-FM為~5.1kPa，DHAC-FH為~9.8kPa，三種水凝膠的模量與天然神經(jīng)組織的模量相匹配（<10kPa）。去除MF時(shí)，三種水凝膠的G’恢復(fù)到初始水平。固定MNPs濃度后，DHAC-FM水凝膠的剛度（G’和G''）隨MF強(qiáng)度升高而增加，穩(wěn)定在約0.2T（圖2G），證明了其磁性硬化曲線，且磁調(diào)節(jié)過(guò)程可逆（圖2H）?？紤]機(jī)械可調(diào)性和便捷性，選擇DHAC-FM水凝膠進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。無(wú)磁性FO@PDA NP時(shí)，DHAC水凝膠剛度為~0.6kPa，DHAC-FM水凝膠（MNPs濃度為~1%）剛度為~0.8kPa，其在可逆MF下可硬化至~5kPa（圖2I），適用于后續(xù)細(xì)胞培養(yǎng)以研究細(xì)胞與基質(zhì)相互作用。

圖2 DHAC-F 水凝膠的磁機(jī)械調(diào)節(jié)。（A） DHAC-F 水凝膠的磁性開(kāi)-關(guān)介導(dǎo)的機(jī)械調(diào)節(jié)的示意圖。（B） 將 MF 軸向施加到水凝膠上的磁流變?cè)O(shè)置示意圖。（C） 由磁流變儀控制的 0 至 0.2 T 脈沖 MF。（D） DHAC 水凝膠的儲(chǔ)能模量 （G′） 和損耗模量 （G′′）。（E） 不同 FO@PDA MNPs 濃度的 DHAC-F 水凝膠的 G′ 和 （F） G′′。（G） DHAC-FM 水凝膠的磁性加固曲線，外部 MF 密度從 0 增加到 0.6 T。（H） DHAC-FM 水凝膠在 0.1 T 脈沖 MF 下的可逆儲(chǔ)能模量和損耗模量。（I） 示意圖顯示 DHAC-FM 水凝膠剛度可以通過(guò)外部 MF 進(jìn)行矩陣機(jī)械設(shè)置進(jìn)行調(diào)整

（3）水凝膠力學(xué)中磁致振動(dòng)的解析模型

如圖 3A 所示，當(dāng)施加力時(shí)，基體內(nèi)部發(fā)生變形。標(biāo)準(zhǔn)線性固體 （SLS） 模型可用于描述水凝膠的機(jī)械特性（圖 3B）。對(duì)于彈塑性零件，參數(shù) σEP以及參數(shù)為 H 的塑料單元0和 S邊界用于表示水凝膠的振幅依賴性。在沒(méi)有 MF 的情況下，水凝膠的剛度由初始水凝膠模量和 NP 增韌效應(yīng)決定。磁流變水凝膠的剪切模量隨 MF 增加如圖 3C 所示，外力作用下的基本基體變形、NPs嵌入的微區(qū)基體變形和NPs的進(jìn)一步基體沿外加MF方向的進(jìn)一步基體變形。外部 MF 誘發(fā)的剪切應(yīng)力 σ磁與磁應(yīng)力張量參數(shù)呈正相關(guān)（圖 3D）。在固化的水凝膠中，MNP 在外部 MF 存在下受到限制，但 MNP 在 MF 方向上增加了局部基質(zhì)變形，最終增加了水凝膠的整個(gè)模量。這種剛度的增加不僅在流變學(xué)測(cè)試期間的剪切力變形中很明顯，在進(jìn)一步的局部細(xì)胞介導(dǎo)的基體變形中也很明顯。不可避免的是，COMSOL 模擬了磁誘導(dǎo)的水凝膠剛度變化。如圖 3E 所示，MF 強(qiáng)度隨著距磁體表面距離的增加而降低。MF |B|（～0.1 T） 對(duì)應(yīng)于我們上述磁流變測(cè)試參數(shù)，該區(qū)域用于進(jìn)一步模擬。在沒(méi)有 MF 的情況下，水凝膠在應(yīng)力場(chǎng)模式下的模量幾乎沒(méi)有變化（圖 3F）。然而，使用 MF 時(shí)，水凝膠的模量顯著增加，從 < 1 kPa 增加到 ～5 kPa，這與上述磁流變測(cè)試結(jié)果一致?？傮w而言，該模型為觀察到的水凝膠剛度變化提供了機(jī)械基礎(chǔ)，這是由 MNP 的內(nèi)在特性和施加到周圍基質(zhì)的內(nèi)部磁性介導(dǎo)應(yīng)力引起的。

圖3 磁性縱水凝膠剪切模量變化的解析模型。（A） MNPs 集成復(fù)合水凝膠結(jié)構(gòu)在無(wú) MF （MF OFF） 的變形時(shí)和 （B） 標(biāo)準(zhǔn)線性實(shí)體模型 （SLS） 的方案。（C） MNPs 集成的復(fù)合水凝膠結(jié)構(gòu)在與 MF （MF ON） 一起變形時(shí)，顯示 MNPs 在 MF 方向上引起的額外基體變形，以及 （D） 具有補(bǔ)充磁應(yīng)力張量的 SLS 示意圖。（E） 硼化釹鐵磁鐵 （NdFeB） 的 MF 分布。（F） 表面應(yīng)力張量分布（xy 分量），顯示有或沒(méi)有 MF 的水凝膠的內(nèi)部模量

（4）磁性通-關(guān)可逆剛度通過(guò)離合器加固增強(qiáng) BMSC 伸長(zhǎng)率

BMSCs作為神經(jīng)分化細(xì)胞模型，被原位封裝在DHAC、DHAC-FL、DHAC-FM和DHAC-FH水凝膠中，以評(píng)估9天培養(yǎng)期的生物相容性（圖4A）。選擇DHAC-FM水凝膠評(píng)估基質(zhì)剛度變化對(duì)BMSC細(xì)胞行為的影響。在Con群內(nèi)，細(xì)胞可感知水凝膠剛度和周圍水凝膠變形。OFF水凝膠中添加的MNPs雖無(wú)MF負(fù)載，但會(huì)誘導(dǎo)周圍水凝膠小幅變形，這種變形取決于MNPs濃度。MF負(fù)載會(huì)進(jìn)一步導(dǎo)致水凝膠沿MF方向變形，通過(guò)定期加載和移除外部MF，可獲得細(xì)胞培養(yǎng)期間的動(dòng)態(tài)基質(zhì)剛度（圖4B）。評(píng)估了磁控剛度變化對(duì)BMSC存活的影響（圖4C），發(fā)現(xiàn)OFF水凝膠中添加痕量MNPs對(duì)第5天的細(xì)胞存活無(wú)明顯影響。同樣，ON-OFF水凝膠的可逆剛度也不影響B(tài)MSC的細(xì)胞匯合（圖4D）。研究中使用的MF強(qiáng)度較低（0.1T），具有磁安全性，細(xì)胞存活和匯合度無(wú)顯著差異。

細(xì)胞通過(guò)施加細(xì)胞力感知周圍基質(zhì)的機(jī)械特性，并調(diào)節(jié)其生物行為，如FA形成、細(xì)胞骨架蛋白擴(kuò)散和表達(dá)增加以響應(yīng)基質(zhì)電阻（圖4E）。為將此分析與細(xì)胞行為和基質(zhì)剛度變化聯(lián)系起來(lái)，形成“電機(jī)-離合器”模型，包含基質(zhì)、FAs、肌球蛋白和產(chǎn)生力的肌動(dòng)球蛋白細(xì)胞骨架之間的動(dòng)態(tài)分子鍵（圖4F）。在這個(gè)模型中，細(xì)胞通過(guò)延伸肌動(dòng)球蛋白細(xì)胞骨架的聚合細(xì)胞內(nèi)肌動(dòng)蛋白束來(lái)開(kāi)始伸長(zhǎng)。相反方向上，肌球蛋白作為馬達(dá)，將肌動(dòng)蛋白束拉向細(xì)胞中心，產(chǎn)生逆行流動(dòng)。FA作為連接，可通過(guò)測(cè)量其對(duì)基質(zhì)的抵抗來(lái)改變肌動(dòng)蛋白細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)的運(yùn)動(dòng)，從而影響肌動(dòng)蛋白聚合。在神經(jīng)誘導(dǎo)分化培養(yǎng)條件下，離合器的工作性能可決定BMSCs的最終神經(jīng)突伸長(zhǎng)。

作為細(xì)胞伸長(zhǎng)的指標(biāo)，圖4G的肌動(dòng)蛋白染色結(jié)果顯示，所有三組中培養(yǎng)的BMSCs隨時(shí)間呈現(xiàn)延伸和分支過(guò)程（神經(jīng)元的形態(tài)學(xué)特征）。第1天，OFF組BMSCs拉長(zhǎng)得更短，而ON-OFF組BMSCs拉長(zhǎng)得更長(zhǎng)，沿神經(jīng)突出現(xiàn)薄的毛發(fā)狀絲狀偽足。第5天，ON-OFF組神經(jīng)突長(zhǎng)度最長(zhǎng)（圖4H）。此外，BMSCs的圓度顯示ON-OFF組明顯降低，表明細(xì)胞擴(kuò)散程度較高（圖4I）。與Con水凝膠相比，OFF水凝膠的圓度略有降低。對(duì)于無(wú)磁縱的公共矩陣（OFF組），單個(gè)FA工作循環(huán)的電機(jī)-離合器模型的典型過(guò)程如圖4J所示。FA離合器逐漸與滑動(dòng)的肌動(dòng)蛋白絲嚙合，以在開(kāi)始時(shí)驅(qū)動(dòng)肌動(dòng)蛋白聚合。當(dāng)超過(guò)綁定時(shí)間時(shí)，有界離合器開(kāi)始斷裂并停止向外伸長(zhǎng)。這種“加載和失效”響應(yīng)導(dǎo)致用于調(diào)節(jié)細(xì)胞擴(kuò)散和伸長(zhǎng)的有效結(jié)合離合器飽和。而在磁性O(shè)N-OFF矩陣中，矩陣從軟變?yōu)閳?jiān)硬，然后又回落為軟。ON-OFF矩陣在MF應(yīng)用的時(shí)間點(diǎn)經(jīng)歷了更多的硬化期。這個(gè)多余的硬化期加強(qiáng)了FA離合器的負(fù)載狀態(tài)，減少了它們的失效并形成更多針對(duì)肌動(dòng)蛋白逆行的錨點(diǎn)，最終增強(qiáng)了肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架組裝和細(xì)胞伸長(zhǎng)。

圖4 磁通-關(guān)可逆剛度通過(guò)電機(jī)-離合機(jī)構(gòu)觸發(fā)的離合-加固調(diào)節(jié) BMSC 的增殖、形態(tài)和伸長(zhǎng)。（A） 位于三種不同水凝膠中的細(xì)胞的力態(tài)示意圖：DHAC 水凝膠（也稱為 Con 水凝膠）、不含 MF 的 DHAC-FM 水凝膠 （OFF） 和具有可逆 MF 的 DHAC-FM 水凝膠（開(kāi)-關(guān)）。（B） 細(xì)胞培養(yǎng)期間 3 種水凝膠的剛度設(shè)置。（C） BMSCs 在三種水凝膠中 5 天的活/死染色和 （D） 細(xì)胞匯合統(tǒng)計(jì)。（E） 抵抗基體變形的胞力示意圖。（F） 用于檢查剛度對(duì)單元展開(kāi)影響的電機(jī)離合器模型方案。（G） 鬼筆環(huán)肽/DAPI 染色的 BMSC 的 CLSM 圖像。（H， I） 每個(gè)細(xì)胞的神經(jīng)突長(zhǎng)度 （H） 和圓度 （I） 的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)。（J） 負(fù)責(zé)剛度影響的單元伸長(zhǎng)率的離合器加固機(jī)構(gòu)的方案

（5）磁性開(kāi)關(guān)矩陣調(diào)節(jié) BMSC 的神經(jīng)分化

在檢測(cè)基質(zhì)剛度變化對(duì)BMSCs伸長(zhǎng)影響后，研究了其機(jī)械轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制，特別是細(xì)胞骨架與TRPV4表達(dá)和功能的關(guān)系。TRPV4是機(jī)械敏感離子通道，可在力作用下發(fā)生構(gòu)象扭曲。第7天評(píng)估三種水凝膠（Con、OFF、ON-OFF）中TRPV4基因表達(dá)（圖5A），ON-OFF組表達(dá)最高，TRPV4抑制劑RN1734使其顯著下降。免疫熒光染色和蛋白表達(dá)強(qiáng)度也顯示ON-OFF組TRPV4最高（圖5B）。藥物抑制劑消除了機(jī)械敏感離子通道的激活，類似于非磁性縱水凝膠。TRPV4高表達(dá)導(dǎo)致Ca2?內(nèi)流，激活多種轉(zhuǎn)錄因子促進(jìn)神經(jīng)元存活和可塑性。Fluo-4標(biāo)記的Ca2?染色顯示，不應(yīng)用MF時(shí)，引入痕量MNP的細(xì)胞Ca2?無(wú)顯著差異（圖5C）?？赡鍹F顯著改變Ca2?水平，這種增加可被TRPV4抑制劑下調(diào)。ON-OFF模式通過(guò)誘發(fā)TRPV4信號(hào)傳導(dǎo)控制基體剛度（圖5D）。推測(cè)磁性縱可逆基質(zhì)促進(jìn)BMSC神經(jīng)分化。將BMSCs封裝在Con、OFF、ON-OFF水凝膠中，在神經(jīng)源性培養(yǎng)基中培養(yǎng)研究體外神經(jīng)再生（圖5E）。ON-OFF水凝膠促進(jìn)BMSC神經(jīng)分化啟動(dòng)，第7天Tuj1基因表達(dá)上調(diào)（圖5F）。IF染色證實(shí)Tuj1在ON-OFF水凝膠中積累水平較高，表明可逆剛度對(duì)BMSC早期神經(jīng)分化的積極影響（圖5G）。通過(guò)檢測(cè)神經(jīng)絲（NF）基因和蛋白表達(dá)研究BMSCs神經(jīng)成熟。NF保護(hù)神經(jīng)元免受機(jī)械應(yīng)力并確保細(xì)胞彈性。第14天，與其他非磁性縱水凝膠相比，ON-OFF水凝膠中NF基因表達(dá)更高（圖5H），蛋白表達(dá)也證實(shí)增強(qiáng)的神經(jīng)突生長(zhǎng)（圖5I）。為說(shuō)明可逆剛度對(duì)BMSC神經(jīng)成熟的影響，用抗PSD95抗體免疫染色檢查突觸蛋白活性。ON-OFF水凝膠PSD95基因和蛋白表達(dá)最高（圖5J&K）。與PSD95趨勢(shì)相反，GFAP在第21天ON-OFF組基因表達(dá)最低，表明磁性縱水凝膠阻礙BMSCs星形膠質(zhì)細(xì)胞分化（圖5L）。長(zhǎng)期GFAP蛋白表達(dá)也證實(shí)了這一點(diǎn)（圖5M）。這些結(jié)果表明，磁性縱可逆基質(zhì)促進(jìn)BMSCs向神經(jīng)元而非星形膠質(zhì)細(xì)胞分化。

圖5 磁性開(kāi)關(guān)矩陣通過(guò) TRPV4 誘發(fā)的 Ca²⁺ 促進(jìn) BMSCs 的神經(jīng)分化流入。（A） 7 天后 TRPV4 在 BMSC 中的基因表達(dá)。免疫熒光 （IF） 染色和 （B） TRPV4 和 （C） 細(xì)胞內(nèi) Ca²⁺ 的熒光強(qiáng)度7 天后 BMSC 中的水平。（D） TRPV4 誘發(fā) Ca²⁺ 內(nèi)流通過(guò)基質(zhì)剛度調(diào)節(jié)促進(jìn) BMSC 的神經(jīng)分化的機(jī)制示意圖。（E） 表征不同階段神經(jīng)分化結(jié)果的方案示意圖。（F） 基因表達(dá)，（G） 7 天后 BMSC 中 Tuj1 的 IF 圖像和熒光強(qiáng)度。（H） 基因表達(dá)，（I） 14 天后 NF 的 IF 圖像和熒光強(qiáng)度。（J） 基因表達(dá)，（K） 21 天后 PSD95 的 IF 圖像和熒光強(qiáng)度。（L） 基因表達(dá)，（M） 21 天后 GFAP 的 IF 圖像和熒光強(qiáng)度

（6）磁性縱矩陣中 BMSC 神經(jīng)分化的 RNA 測(cè)序研究

采用RNA測(cè)序分析研究基質(zhì)剛度變化通過(guò)肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架聚合介導(dǎo)的機(jī)械轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑促進(jìn)BMSCs神經(jīng)分化的生物學(xué)機(jī)制。在ON-OFF和OFF樣本中發(fā)現(xiàn)677個(gè)差異表達(dá)基因（DEGs），其中257個(gè)上調(diào)，420個(gè)下調(diào)（圖6A）。GO Chord圖顯示DNA修復(fù)、神經(jīng)遞質(zhì)分泌和運(yùn)輸、基于肌動(dòng)蛋白絲的過(guò)程的調(diào)節(jié)等GO術(shù)語(yǔ)之間的關(guān)系（圖6B）。進(jìn)一步評(píng)估OFF和ON-OFF水凝膠之間差異神經(jīng)相關(guān)表達(dá)基因（DNEGs）的表達(dá)，與OFF水凝膠相比，ON-OFF水凝膠中更多DNEG的表達(dá)水平上調(diào)（圖6C）。GO分類顯示，與OFF水凝膠相比，ON-OFF水凝膠中的DNEGs與神經(jīng)元分化相關(guān)（圖6D）。此外，與細(xì)胞內(nèi)機(jī)械轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)，OFF vs Con和ON-OFF vs Con的GO項(xiàng)結(jié)果都與“細(xì)胞間粘附”和“細(xì)胞粘附”有關(guān)。與Con相比，ON-OFF水凝膠顯示出與細(xì)胞外基質(zhì)組織相關(guān)的GO項(xiàng)明顯上調(diào)，表明對(duì)細(xì)胞生態(tài)位重塑的有效反應(yīng)。KEGG富集表明，與OFF水凝膠相比，ON-OFF水凝膠中“磷脂酰肌醇3激酶-蛋白激酶B（PI3K-AKT）”信號(hào)通路、“鈣信號(hào)通路”和“粘著斑”信號(hào)通路上調(diào)（圖6E）。細(xì)胞內(nèi)Ca2?可能激活小GTP酶Ras，進(jìn)而募集PI3K。PI3K-AKT信號(hào)通路通過(guò)激活肌動(dòng)蛋白成核劑調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的動(dòng)力學(xué)，參與干細(xì)胞的自我更新。Ca2?通過(guò)多種反饋效應(yīng)觸發(fā)細(xì)胞內(nèi)鈣信號(hào)通路。與OFF水凝膠相比，ON-OFF水凝膠中PI3K-AKT和鈣信號(hào)的富集通路顯示出磁性縱的可逆基質(zhì)介導(dǎo)與機(jī)械轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的生物過(guò)程。KEGG分析還表明，PI3K-Akt通路中富集了27個(gè)基因，鈣通路中富集了12個(gè)基因（圖6F&G）。根據(jù)RNA測(cè)序結(jié)果和上述蛋白質(zhì)表達(dá)，推斷磁性縱的可逆基質(zhì)激活了TRPV4離子通道的開(kāi)放，導(dǎo)致Ca2?增加內(nèi)流，觸發(fā)PI3K-AKT和細(xì)胞內(nèi)鈣信號(hào)通路，通過(guò)促進(jìn)肌動(dòng)蛋白聚合以實(shí)現(xiàn)BMSC的神經(jīng)分化（圖6H）。

圖6 第 21 天 BMSCs 神經(jīng)分化的 RNA 測(cè)序分析。（A） ON-OFF 水凝膠中 BMSCs 下調(diào)基因 （藍(lán)色，420） 和上調(diào)基因 （紅色，257） 的火山圖。（B） ON-OFF 水凝膠中差異表達(dá)基因 （DEG） 的豐富和弦圖。（C） 熱圖顯示了 OFF 和 ON-OFF 水凝膠之間 BMSCs 的差異表達(dá)神經(jīng)相關(guān)基因 （DENG）。（D） 與 OFF 水凝膠相比，ON-OFF 水凝膠中 DENG 的基因本體論 （GO） 分類。（E） 與 OFF 水凝膠相比，ON-OFF 水凝膠中富集的 KEGG 通路。（F） OFF 和 ON-OFF 水凝膠中 PI3K-AKT 信號(hào)通路相關(guān)基因的熱圖。（G） OFF 和 ON-OFF 水凝膠中鈣信號(hào)通路相關(guān)基因的熱圖。（H） 基質(zhì)剛度如何通過(guò)激活 PI3K-AKT 和鈣信號(hào)通路調(diào)節(jié) BMSCs 神經(jīng)元分化，最終促進(jìn)肌動(dòng)蛋白聚合的示意圖

（7）TBI 后磁縱神經(jīng)元再生和神經(jīng)功能恢復(fù)

在SD大鼠中建立TBI模型，將TBI大鼠分為4組：注射PBS的對(duì)照組（TBI）、DHAC水凝膠處理組（Con）、DHAC-FM水凝膠處理組（OFF）和DHAC-FM水凝膠伴交替MF處理的ON-OFF組，另設(shè)正常大鼠為陽(yáng)性對(duì)照（Sham）。TBI建模、治療及神經(jīng)功能恢復(fù)評(píng)估流程如圖7A所示。TBI后28天處死大鼠并收集器官。HE染色顯示三種水凝膠（Con、OFF、ON-OFF）生物相容性良好，未引起明顯結(jié)構(gòu)損傷、炎癥等病理變化。評(píng)估TBI后28天腦組織完整性，TBI組出現(xiàn)大空腔，水凝膠組空腔減小，尤其是ON-OFF組，部分空腔有細(xì)胞松散浸潤(rùn)（圖7B）。作為軸突和髓鞘再生指標(biāo)，NF和MBP的IF染色顯示ON-OFF組表達(dá)最高（圖7C），OFF組表達(dá)略高于TBI組，表明生物活性水凝膠可誘導(dǎo)神經(jīng)纖維和髓鞘再生，磁縱機(jī)械信號(hào)進(jìn)一步增強(qiáng)這種影響。GAP43和PSD95染色研究突觸形成，ON-OFF組陽(yáng)性熒光信號(hào)最高（圖7D、D1&D2），OFF組GAP43面積高于Con組，可能是DA修飾的MNPs促進(jìn)軸突生長(zhǎng)所致，證實(shí)ON-OFF水凝膠在體內(nèi)促進(jìn)TBI后神經(jīng)再生和大腦結(jié)構(gòu)重塑。

TBI會(huì)導(dǎo)致學(xué)習(xí)、記憶和認(rèn)知功能障礙等神經(jīng)精神后遺癥。采用MWM實(shí)驗(yàn)評(píng)估TBI后的長(zhǎng)期神經(jīng)功能恢復(fù)。典型游泳路線顯示，經(jīng)過(guò)6天學(xué)習(xí)，五組大鼠的平臺(tái)尋找軌跡顯著減少（圖7E）。第21天移除水下平臺(tái)記錄逃逸潛伏期，五組的逃逸潛伏期在訓(xùn)練后不同程度減少（圖7F），ON-OFF組明顯小于TBI、Con和OFF組，與Sham組相似，表明磁控可逆矩陣有效促進(jìn)TBI后大鼠的空間學(xué)習(xí)能力。第28天評(píng)估記憶功能，ON-OFF組大鼠最頻繁穿越隱藏平臺(tái)區(qū)域，且在目標(biāo)象限內(nèi)停留時(shí)間最多（圖7E、G和H），表明ON-OFF水凝膠顯著提高TBI大鼠的記憶能力。以上結(jié)果表明，磁性縱的可逆基質(zhì)有助于TBI后大鼠的長(zhǎng)期神經(jīng)功能恢復(fù)。

綜上所述，結(jié)果證實(shí)磁性縱的可逆基質(zhì)中的離合器強(qiáng)化效應(yīng)通過(guò)PI3K-AKT和鈣依賴性肌動(dòng)蛋白自組裝調(diào)節(jié)細(xì)胞伸長(zhǎng)來(lái)介導(dǎo)BMSC神經(jīng)分化（圖7I）。在離合器增強(qiáng)效應(yīng)下，磁性縱基質(zhì)中的BMSC表現(xiàn)出肌動(dòng)蛋白自組裝上調(diào)，增強(qiáng)的細(xì)胞內(nèi)機(jī)械信號(hào)激活PI3K-AKT和鈣信號(hào)通路，促進(jìn)神經(jīng)分化相關(guān)基因Tuj1、NF、PSD95和GFAP的表達(dá)，最終促進(jìn)TBI后神經(jīng)功能恢復(fù)。相比之下，F(xiàn)As參與的非磁性縱基質(zhì)的“加載和失敗”在肌動(dòng)蛋白聚合中沒(méi)有顯著促進(jìn)作用，導(dǎo)致神經(jīng)分化和神經(jīng)功能恢復(fù)較弱。

圖7 TBI 后用磁性縱水凝膠治療的大鼠的恢復(fù)評(píng)估。（A） TBI 建模、水凝膠植入、MF 負(fù)荷和神經(jīng)再生評(píng)估的示意圖。IF 表示免疫熒光染色，MF 表示 MF 加載點(diǎn)，MWM 表示莫里斯水迷宮。（B） TBI 后 28 天不同組的大腦圖片。假動(dòng)作表示僅暴露顱骨而沒(méi)有任何植入的大鼠，TBI 表示注射 100 μL PBS 的 TBI 大鼠，Con 組表示用 DHAC 水凝膠治療的 TBI 大鼠，OFF 組表示用 DHAC-FM 水凝膠治療的 TBI 大鼠，ON-OFF 組表示用 DHAC-FM 水凝膠治療的 TBI 大鼠伴有交替的 MF。（C） NF/髓鞘堿性蛋白 （MBP） 的典型 IF 染色圖像。每個(gè)視野的 （C1） NF 和 （C2） MBP 陽(yáng)性區(qū)域的定量。（D） PSD95/生長(zhǎng)相關(guān)蛋白-43 （GAP43） 的 IF 染色圖像。每個(gè)視野的 （D1） PSD95 和 （D2） GAP43 陽(yáng)性區(qū)域的定量。（E） TBI 后第 28 天 MWM 的典型痕跡。（F） TBI 后第 21 至 27 天 MWM 中的逃逸潛伏期。（G） TBI 后第 28 天的穿越時(shí)間和 （H） 象限停留時(shí)間。（I） 磁性縱的可逆基質(zhì)的示意圖通過(guò)調(diào)節(jié)機(jī)械轉(zhuǎn)導(dǎo)介導(dǎo)的 PI3K-AKT 和鈣信號(hào)通路，通過(guò)離合器增強(qiáng)的肌動(dòng)蛋白組織介導(dǎo) BMSCs 神經(jīng)分化