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針對上述問題，蘭州大學(xué)范增杰教授團(tuán)隊設(shè)計了一種含有鎂電極的原電池微針（GCMN）貼片。貼片通過原電池機(jī)制運作，通過氧化還原反應(yīng)產(chǎn)生微電流并釋放氫氣和鎂離子。氫氣的抗氧化和抗炎特性、微電流刺激細(xì)胞遷移以及鎂離子促進(jìn)血管生成和巨噬細(xì)胞M2抗炎極化協(xié)同作用，可逆轉(zhuǎn)光老化皺紋并使皮膚再生。此外，該研究還探討了GCMN對轉(zhuǎn)化生長因子-β/Smad（TGF-β/Smad）通路的影響。這種方法有望推動醫(yī)療美容領(lǐng)域的研究和開發(fā)。該文章于2025年03月11日以《Galvanic Cell Bipolar Microneedle Patches for Reversing Photoaging Wrinkles 》為題發(fā)表于《Advanced Materials》（DOI：10.1002/adma.202500552）。

（1）GCMNs的設(shè)計與原理

如圖所示為了制造GCMNs，研究者設(shè)計并制備了由導(dǎo)電陽極和陰極陣列組成的雙極微針陣列，采用兩步模板法，基于聚乳酸（PLA）、多巴胺（DA）改性的聚吡咯（PPy）納米纖維（簡稱DA-PPy）和聚乙二醇（PEG）。PLA被選為微針基材，因其具有良好的生物相容性和優(yōu)異的機(jī)械性能，確保生物安全性和足夠的機(jī)械強(qiáng)度。將增塑劑PEG摻入PLA中，可顯著提高微針的柔韌性和韌性。此外，將DA-PPy摻入PLA中，以提高微針的導(dǎo)電性。將尺寸約為30-40微米的鎂顆粒添加到陽極微針陣列中，使其與陰極微針陣列有所區(qū)別。通過導(dǎo)電材料將陰極和陽極微針陣列連接起來，形成GCMNs。雙極微針在插入組織后利用組織液作為電解質(zhì)溶液，形成完整的原電池回路。在弱堿性組織液中發(fā)生的自發(fā)氧化還原反應(yīng)中，水獲得電子并被還原，導(dǎo)致陰極電極處生成氫氣。同時，鎂在陽極電極處釋放電子，發(fā)生氧化反應(yīng)，轉(zhuǎn)化為鎂離子。這在雙極微針陣列之間形成電位差，促進(jìn)電子的定向流動，最終產(chǎn)生生物電。這些反應(yīng)產(chǎn)生的生物電和鎂離子對細(xì)胞增殖和遷移具有積極影響。此外，氫氣因其抗炎和抗氧化特性，可從病理角度輔助治療光老化皺紋。

圖1. GCMN的制作工藝和工作原理

（2）GCMNs的制備與表征

GCMNs通過模板法制備，陰陽極相連形成完整雙極微針結(jié)構(gòu)，3D打印連接模板助力制備。掃描電鏡圖展示微針表面形貌，所有微針同模板制備，呈11×11陣列，單個微針底徑200微米，高600微米（圖2A）。能量色散譜圖確認(rèn)微針中鎂元素均勻分布，含羅丹明的微針顯微鏡圖顯示其圓錐形尖端，陽極可見鎂顆粒。傅里葉變換紅外光譜分析揭示DA-PPy/PLA/PEG導(dǎo)電基質(zhì)中DA-PPy的特征峰，證實其成功融入基質(zhì)（圖2B）。X射線衍射分析顯示鎂顆粒的特征峰，證明其成功融入導(dǎo)電基質(zhì)（圖2C）。

（3）GCMNs的力學(xué)性能

GCMNs的機(jī)械性能通過在純PLA微針中添加PEG來改善，以減少其脆性和斷裂。使用萬能試驗機(jī)測試了不同PLA/PEG比例的PLA/PEG微針的機(jī)械性能。測試結(jié)果表明，在450微米位移下，三種PLA/PEG比例的微針?biāo)鑹毫Τ氏仍黾雍鬁p少的趨勢（圖2D、E）。

圖2. GCMNs的表征與力學(xué)性能。（A）（i、ii、iv、v和vi）MN的SEM圖像，其中白色箭頭指示鎂顆粒的位置；（iii）MN的照片圖像；（vii）鎂的EDS圖像；（viii）和（ix）含或不含鎂顆粒的MN的羅丹明顯微鏡照片；（B）材料的FT-IR光譜；（C）材料的XRD圖譜；（D，E）MN的機(jī)械性能

(4) 氫和微電流產(chǎn)生

GCMNs基于鎂與水反應(yīng)生成氫氣的原理，該反應(yīng)具有抗氧化特性，且不會干擾正常代謝氧化或細(xì)胞信號傳導(dǎo)。為評估陽極微針的產(chǎn)氫能力，將陽極微針浸入PBS緩沖液中，并定期拍攝顯微鏡圖像。結(jié)果表明，在12小時內(nèi)可觀察到持續(xù)的氫氣釋放（圖3A）。通過滴定法測定Mg2+濃度變化來量化累計氫氣釋放量，48小時內(nèi)累計氫氣釋放量達(dá)到62.6 mmol，表明微針具有持久的抗炎潛力（圖3B）。氧化還原反應(yīng)可以產(chǎn)生微電流，具有抗炎作用并能增強(qiáng)細(xì)胞遷移能力。使用高精度臺式數(shù)字萬用表在體外和體內(nèi)評估微針的微電流產(chǎn)生能力。結(jié)果表明，當(dāng)微針浸入PBS中時，會迅速產(chǎn)生2.68微安的峰值電流，隨后逐漸下降，持續(xù)24小時（圖3C）。當(dāng)將微針插入小鼠背部皮膚時，觀察到類似的2.55微安峰值電流，逐漸下降但比體外環(huán)境持續(xù)時間更長，這可能是由于體內(nèi)體液體積較小，每次反應(yīng)參與的液體較少，從而延長了電流的持續(xù)時間（圖3D）。

（5）活性氧清除和體外抗氧化能力

研究團(tuán)隊對微針（MN）在體外的自由基清除和抗氧化能力進(jìn)行了研究。如圖3E所示，通過持續(xù)釋放氫氣，在陽性對照組中對DPPH?的清除率達(dá)到87.80±3.15%，而在電刺激（ES）組、空白MN組、鎂MN組和雙極MN組中，清除率分別為13.06±5.18%、42.36±10.57%、55.13±4.85%和84.68±2.52%。此外，對?OH的清除效果在陽性對照組中達(dá)到95.08±0.74%，而在ES組、空白MN組、鎂MN組和雙極MN組中，清除率分別為9.76±1.36%、17.63±0.90%、32.51±2.06%和80.89±1.33%（圖3F）。顯然，鎂MNs和雙極MNs對DPPH·都表現(xiàn)出了很強(qiáng)的清除能力。相反，單獨的ES對自由基清除作用很小。但雙極MNs對·OH和DPPH·的清除活性明顯高于鎂MNs和ES處理的MNs。這種增強(qiáng)可歸因于微電流和原電池反應(yīng)產(chǎn)生的氫氣的協(xié)同作用。隨后，使用ROS檢測試劑盒評估了MN的ROS清除能力。在脂多糖（LPS）刺激下，細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)明顯的綠色熒光信號，表明細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生了ROS（圖3H）。Mg MN和雙極MN觀察到明顯的熒光淬滅，突出了它們強(qiáng)大的ROS清除功效，而ES和空白MN的清除活性最小。半定量分析結(jié)果顯示，對照組自由基生成率為51.61 ±6.70%，陽性對照組為100.00 ± 2.11%，ES組為92.03 ± 2.40%，BlankMNs組為80.44 ± 4.21%，Mg MNs組為67.07 ± 2.97%，和56.60 ± 5.56%，進(jìn)一步證明了MgMN和BipolarMN的有效ROS清除能力（圖3G）。

圖3. GCMNs的產(chǎn)氫和顯著的抗氧化能力。（A）顯示氫生成的時間范圍的顯微鏡圖像；（B）隨著時間推移產(chǎn)生的氫氣量；（C）GCMNs的體外微電流產(chǎn)生；（D）GCMNs的體內(nèi)微電流產(chǎn)生；（E）清除DPPH自由基的能力；（F）清除羥自由基的能力；（G，H）ROS測定和統(tǒng)計學(xué)分析：在用簡單電刺激（ES）、空白MNs、Mg MNs、雙極MNs和正常細(xì)胞培養(yǎng)基（對照組）處理24小時后的L929細(xì)胞，ROS用DCFH-DA染色（綠色）

（6）細(xì)胞增殖、遷移和血管生成

為了評估微針（MN）對細(xì)胞增殖、遷移和血管生成能力的影響，研究者進(jìn)行了多項實驗。通過MTT實驗檢測細(xì)胞活力，結(jié)果顯示所有實驗組的細(xì)胞存活率均超過85%，高于對照組，表明MN具有良好的生物相容性(圖4A)。圖4B活/死細(xì)胞雙染色實驗進(jìn)一步證實了這一點，顯示MN處理后的細(xì)胞具有較高的存活率。圖4C清楚地表明，與MN共培養(yǎng)3天后，細(xì)胞骨架形態(tài)學(xué)沒有顯著差異。在細(xì)胞遷移實驗中，使用劃痕實驗評估了MN對成纖維細(xì)胞遷移能力的影響。結(jié)果顯示，鎂MN組和雙極MN組的傷口閉合率顯著高于對照組，表明MN能夠顯著促進(jìn)細(xì)胞遷移(圖4D、E)。此外，研究者還通過人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）實驗，發(fā)現(xiàn)MN處理組的細(xì)胞分支點和管長度均高于對照組，表明MN能夠有效促進(jìn)血管生成(圖4F-H)。

（7）促進(jìn)巨噬細(xì)胞M2體外極化分析

在巨噬細(xì)胞M2極化實驗中，研究者發(fā)現(xiàn)鎂離子能夠刺激巨噬細(xì)胞向M2表型極化。與對照組相比，鎂MN組和雙極MN組的M2極化水平顯著提高，表明MN能夠有效促進(jìn)巨噬細(xì)胞的抗炎極化(圖4I)。這些實驗結(jié)果表明，MN具有良好的生物相容性，能夠顯著促進(jìn)細(xì)胞增殖、遷移和血管生成，同時具有抗炎作用，有助于皮膚損傷的修復(fù)和再生。

圖4. GCMNs的體外生物相容性、細(xì)胞增殖、遷移、血管生成和巨噬細(xì)胞極化效應(yīng)。（A）MTT試驗結(jié)果；（B）活/死雙染色實驗；（C）鬼筆環(huán)肽染色的細(xì)胞骨架形態(tài)學(xué)；（D，E）在各種處理24小時后，使用細(xì)胞遷移測定法評價成纖維細(xì)胞遷移；（F-H）細(xì)胞管形成試驗的結(jié)果和統(tǒng)計分析；（I）巨噬細(xì)胞M2極化的流式細(xì)胞術(shù)分析

（8）光老化皺紋的治療效果及組織學(xué)分析

研究者采用了UV誘導(dǎo)的光老化小鼠模型。小鼠被隨機(jī)分為五組：一組不進(jìn)行任何治療，其他組分別接受單純電刺激（ES）、空白微針（Blank MNs）、鎂微針（Mg MNs）或雙極微針（Bipolar MNs）治療（圖5A）。在治療期間，獲取了小鼠背部皮膚的圖像（圖5B），結(jié)果顯示，14天后雙極微針組僅表現(xiàn)出輕微的皺紋。相比之下，單純電刺激組有一定的改善，但總體效果有限。為了進(jìn)一步評估微針治療對光老化皺紋的影響，小鼠在第14天被處死，并收集背部皮膚組織進(jìn)行組織學(xué)和免疫組化分析。H&E染色結(jié)果顯示（圖5C），模型組、電刺激組、空白微針組和鎂微針組的表皮呈現(xiàn)不規(guī)則增厚和結(jié)締組織炎癥細(xì)胞浸潤，而雙極微針組的表皮顯示出顯著的恢復(fù)，盡管仍略低于對照組。Masson三色染色用于評估膠原蛋白的損傷和修復(fù)情況。結(jié)果顯示，模型組、電刺激組和空白微針組的皮膚膠原纖維明顯減少，部分膠原纖維出現(xiàn)碎片化、排列紊亂和分布不均（圖5D）。鎂微針組的膠原纖維排列有所改善，而雙極微針組則表現(xiàn)出更顯著的改善，膠原纖維排列有序、連續(xù)且含量增加。圖5E、F免疫組化分析顯示，雙極微針組的膠原蛋白1（COL-1）和膠原蛋白3（COL-3）水平顯著高于其他實驗組，與對照組無顯著差異，表明GCMNs對受損皮膚的膠原蛋白再生具有顯著的促進(jìn)作用。

圖5. 活體光老化皺紋的治療效果及組織學(xué)分析。（A）動物實驗的時間軸；（B）在第-21天、第0天、第7天和第14天，用不同干預(yù)處理的小鼠背部皮膚的照片；（C）膠原蛋白1和3的蘇木精-伊紅（H&E）染色和免疫組織化學(xué)結(jié)果；（D-F）Masson三色染色和免疫組織化學(xué)的定量分析

（9）體內(nèi)抗炎、巨噬細(xì)胞M2極化和血管生成

為了進(jìn)一步探討微針（MN）治療是否能夠減輕體內(nèi)炎癥因子的產(chǎn)生，研究者進(jìn)行了免疫組化染色，以量化IL-1β、IL-6和TNF-α的表達(dá)水平（圖6）。結(jié)果表明，與未治療的模型組相比，經(jīng)ES、鎂MN和雙極MN治療后，皮膚組織中IL-1β、IL-6和TNF-α的分泌量顯著減少。然而，與模型組相比，空白MN組并未抑制炎癥因子的表達(dá)。鎂MN的顯著抗炎特性源于鎂與組織液反應(yīng)生成氫氣，已知氫氣能夠抑制炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生。盡管ES組在之前的自由基清除實驗中影響不大，但在這里也顯示出明顯的抗炎抑制效果，而雙極MN組同時具備鎂離子、電刺激和氫氣，展現(xiàn)出最佳的抗炎能力。

同時，通過免疫熒光檢測評估了抗炎過程中巨噬細(xì)胞的極化情況。圖7A、B結(jié)果顯示，模型組和空白MN組中M1型巨噬細(xì)胞標(biāo)志物CD86的表達(dá)較高，而在鎂MN組、ES組尤其是雙極MN組中表達(dá)降低。相反，M2型巨噬細(xì)胞標(biāo)志物CD206在模型組和空白MN組中幾乎不表達(dá)，但在鎂MN組、ES組和雙極MN組中表達(dá)較高。這一結(jié)果與體外流式細(xì)胞術(shù)趨勢一致，表明鎂離子對巨噬細(xì)胞的M2極化有影響。此外，研究者推測MN釋放的鎂離子應(yīng)具有強(qiáng)大的促血管生成能力，通過檢測組織中CD31的表達(dá)來評估，結(jié)果顯示ES組、鎂MN組和雙極MN組的CD31表達(dá)水平較高，證明了GCMNs中鎂離子的促血管生成能力。

圖6. GCMNs的抗炎能力。（A）紫外線引起的皮膚炎癥的示意圖；（B）顯示TNF-α、IL-1α和IL-6表達(dá)水平的免疫組織化學(xué)圖像；（C-E）TNF-α、IL-1α和IL-6表達(dá)的統(tǒng)計學(xué)分析

圖7. GCMNs在體內(nèi)對巨噬細(xì)胞M2極化和血管生成的促進(jìn)作用。（A-C）CD86、CD206和CD31的免疫熒光圖像；（D-F）免疫熒光定量分析

（10）GCMNs的信號通路及其分子機(jī)制

TGF-β/Smad通路在細(xì)胞增殖、分化、膠原蛋白合成和免疫調(diào)節(jié)等過程中起著關(guān)鍵作用。為了評估不同處理對TGF-β1、Smad-3和MMP-9表達(dá)水平的影響，研究者進(jìn)行了免疫熒光染色（圖8A-C）。結(jié)果顯示，雙極微針組的TGF-β和Smad-3表達(dá)水平顯著高于模型組和空白微針組，而MMP-9表達(dá)水平顯著降低。進(jìn)一步的Western Blot分析（圖8 G）和實時定量PCR（圖8H、I）結(jié)果也支持了這一結(jié)論，表明GCMNs通過激活TGF-β/Smad-3信號通路，促進(jìn)膠原蛋白積累，抑制膠原蛋白降解，從而有效修復(fù)光老化皺紋。

圖8. GCMNs通過TGF-β/Smad-3信號通路治療光老化皺紋。（A-C）TGF-β1、Smad-3和MMP-9的免疫熒光圖像；（D-F）免疫熒光的定量分析；（G）通過蛋白質(zhì)印跡法在體內(nèi)和體外檢測TGF-β1和Smad-3蛋白表達(dá)水平；（H，I）TGF-β1和Smad-3的RT-qPCR結(jié)果