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針對上述問題，山東大學張東姣團隊開發(fā)一種基于黑磷（BP）和氨基硅酞菁（SiPc-NH₂）的納米復合水凝膠（BP-PC@GelMA），通過非共價相互作用（如π-π堆積、靜電作用）增強BP的分散性和穩(wěn)定性，減少其氧化降解，并提升其光熱性能和生物相容性。研究進一步探討B(tài)P-PC@GelMA在骨缺損修復中的作用機制，特別是通過調控Hippo/Wnt信號通路和線粒體動態(tài)（融合/分裂、自噬）來促進成骨分化。最終目標是構建一種兼具成骨、抗菌和光熱治療功能的多功能骨修復材料，為臨床治療骨缺損提供新的策略和理論支持。該文章于2025年1月23日以《Improved Black Phosphorus Nanocomposite Hydrogel for Bone Defect Repairing: Mechanisms for Advancing Osteogenesis》為題發(fā)表于《Advanced Healthcare Materials》（DOI：10.1002/adhm.202404934）。

研究示意圖

（1）BP和SiPc-NH2顆粒的生物相容性及合成比例研究

為了研究BP和SiPc-NH₂在細胞培養(yǎng)應用中的最佳濃度，首先評估了BP和SiPc-NH₂對大鼠成骨細胞（rOBs）活力的影響。通過CCK-8檢測了1、3、5天后的細胞增殖情況，結果顯示在1 μM濃度下，BP和SiPc-NH₂的增殖活性隨時間變化顯著不同。SiPc-NH₂在第3天和第5天表現(xiàn)出增殖增加，表明其對細胞活力具有時間依賴性增強作用。相反，BP在同一時間段內增殖活性下降，表明其對細胞活力具有時間依賴性抑制作用（圖1b）。通過活死染色檢測BP和SiPc-NH₂顆粒，結果顯示所有組中均有大量活細胞，僅少數(shù)細胞死亡，與陰性對照組（NC組）相比無顯著差異（圖1a,c）。

隨后，采用堿性磷酸酶（ALP）染色法評估BP對rOBs成骨分化的調控作用，并探索BP和SiPc-NH₂的最佳成骨濃度。結果表明，BP濃度為6μg/mL時，ALP染色強度最高，表明其成骨潛力最強。而在較低（1μg/mL）和較高（12μg/mL）濃度下，ALP染色強度減弱，表明成骨能力下降（圖1d）。此外，研究發(fā)現(xiàn)SiPc-NH₂濃度在0至75 mg/L范圍內，ALP染色結果無顯著差異，表明該濃度范圍內無明顯成骨效果。因此，確定了BP與SiPc-NH₂的最佳合成比例為1:10，即少量BP與足量SiPc-NH₂充分混合。

圖1. BP和SiPc-NH2粒子的生物相容性和合成比例的研究。（a）來自NC、SiPc-NH₂和BP組中的活/死測定的代表性圖像；（b）來自NC、SiPc-NH₂和BP組的CCK-8測定的OD值；（c）顯示每平方毫米活細胞和死細胞數(shù)目的活/死測定；（d）不同濃度的BP和SiPc-NH₂的ALP染色

（2）BP-SiPc-NH₂的表征

采用液相剝離法制備BP納米片，以NMP為剝離劑，有效防止其降解并提高產率。SEM顯示BP為二維片狀結構，液相剝離后形成更小納米片（圖2a）。EDS分析顯示氮、磷、碳和硅在BP表面均勻分布，證明SiPc-NH?成功負載（圖2b）。FT-IR中出現(xiàn)SiPc-NH?特征峰，進一步確認其負載（圖2c）。XPS分析顯示P2p?/?和P2p?/?峰分別在129.7 eV和130.7 eV，額外峰在133.7 eV處（圖2d,e）。SiPc-NH?的引入增加了NIR驅動的ROS生成量（圖2f），改善了BP納米片的分散性（圖2g），可能由于其兩側氨基基團擴展。比較BP和BP-PC的降解前后圖像和紫外光譜，發(fā)現(xiàn)BP-PC一個月內部分降解，而BP顯著降解（圖2h,i）。20 W NIR光照射時，SiPc-NH?顯著提高加熱速率（圖2j,k）。因此，SiPc-NH?增強了BP的熱生成和ROS產生能力，降低了降解速率，改善了分散性，有助于提高生物安全性和抗菌性能。圖2i展示GelMA、BP@GelMA和BP-PC@GelMA的SEM圖像，具有多孔表面結構。在PBS中降解一個月后，表面粗糙度增加甚至部分損傷，證實其優(yōu)異的降解性能（圖2m）。在SBF中浸泡兩周后，水凝膠表面形成礦化晶體（圖2n–q）。檢測水凝膠加熱效果，BP-PC組1分鐘內溫度超過40°C，具有快速升溫殺滅病原菌的潛力（圖2r,s）。

圖2. BP、BP-PC、BP@GelMA和BP-PC@GelMA的表征_{。（a）BP和BP-PC的TEM圖像；（b）BP-PC的元素圖譜；（c）BP和BP-PC的FT-IR光譜；（e）BP和BP-PC的XPS測量和高分辨率P2p譜；（f）BP和BP-PC在不同濃度（10、15、20 mg L}?1）下的ROS生成量；（g）BP和BP-PC在不同濃度（10、15、20 mg L?1）下的分散穩(wěn)定性；（h）降解前后BP-PC的照片和UV光譜；（i）降解前后BP的照片和UV光譜；（j，k）在808 nm NIR光照射（功率密度為2.0 W cm?2）下，記錄BP和BP-PC的溫度變化；（l）GelMA、BP@GelMA和BP-PC@GelMA的SEM圖像；（m）在不同組的PBS中降解一個月后的表面形態(tài)；（n-q）在SBF中浸泡兩周后不同組的表面礦化結果；（r，s）當用808 nm NIR光（功率密度2.0 W cm?2）照射時，不同基團下的水凝膠的溫度響應效應

（3）BP@GelMA和BP-PC@GelMA成骨性能的研究

為了進一步分析BP@GelMA和BP-PC@GelMA中的細胞活力，采用了活死染色技術。結果顯示，所有實驗組中均有大量活細胞，僅少數(shù)細胞死亡，與NC組相比無顯著差異（圖3a）。隨后，研究了BP@GelMA和BP-PC@GelMA的最佳成骨濃度，以確定后續(xù)實驗的濃度。分析顯示，在0–25 μg/mL濃度范圍內，ALP染色結果與NC組相比有顯著差異，顯示出良好的成骨效果，且隨著濃度增加效果增強（圖3b）。綜合考慮生物相容性和成骨潛力，后續(xù)實驗中使用25 μg/mL的BP@GelMA和BP-PC@GelMA。

此外，研究了BP@GelMA和BP-PC@GelMA對細胞遷移的影響。在培養(yǎng)12和24小時后，Transwell實驗和劃痕實驗顯示，兩種材料均顯著增強了rOBs的遷移能力（圖3c,d）。值得注意的是，BP-PC@GelMA組的遷移細胞數(shù)量更多，顯示出更顯著的促遷移效果。此外，劃痕實驗表明，BP-PC@GelMA組在24小時后實現(xiàn)了100%的愈合率，凸顯了其在促進細胞遷移和組織再生方面的功效。接下來，研究了BP@GelMA和BP-PC@GelMA復合材料的成骨潛力。ALP是早期成骨細胞分化的關鍵標志物。在誘導的第7天，ALP染色顯示BP-PC@GelMA組的ALP含量升高，表明BP-PC@GelMA涂層促進了成骨細胞分化（圖3e）。在誘導的第14天，礦化結節(jié)的形成也顯示出類似的結果，支持其作為晚期成骨分化的關鍵指標。在先前的研究中，已確定GelMA不影響rOBs的增殖或成骨分化。因此，未單獨設置GelMA組進行比較分析。關于成骨相關蛋白的表達，BP-PC@GelMA組的RUNX2、ALP和COL-1水平顯著升高（圖3f）。

圖3. BP@GelMA和BP-PC@GelMA的成骨潛力研究_{。（a）存活/死亡試驗的代表性圖像；（b）不同濃度的BP@GelMA和BP-PC@GelMA的ALP染色；（c，d）在不同組下培養(yǎng)12和24小時后進行的Transwell和劃痕試驗；（e）每組ALP和ARS染色的代表性圖像；（f）成骨分化相關蛋白ALP、COL-1和RUNX2在不同組間rOB中的表達水平}

（4）BP@GelMA和BP-PC@GelMA的體外光熱抗菌效果研究

如圖4a,b所示，在沒有近紅外（NIR）照射的情況下，所有實驗組均顯示出顯著的細菌生長，瓊脂平板上存在大量金黃色葡萄球菌和大腸桿菌菌落。在NIR光照射3分鐘后，BP@GelMA和BP-PC@GelMA組均表現(xiàn)出顯著的光熱效應。BP@GelMA組中仍殘留少量孤立的細菌菌落，而BP-PC@GelMA組的菌落幾乎完全被清除。將NIR照射時間延長至5分鐘后，兩組的細菌菌落數(shù)量急劇減少，幾乎完全消失。進一步的定量分析表明，經過3分鐘NIR照射后，BP@GelMA對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抗菌率分別達到98%和99.7%。5分鐘后，抗菌率保持在100%。對于BP-PC@GelMA組，僅需3分鐘NIR照射即可對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌達到100%的抗菌率，5分鐘后效果仍保持在100%。相應的掃描電子顯微鏡（SEM）圖像顯示，SiPc-NH₂的引入增強了NIR輻射觸發(fā)的抗菌效果。這些效果表現(xiàn)為顯著的細胞皺縮、細菌聚集和模糊的細胞邊界，表明細菌細胞壁結構受損?；钏廊旧@示，BP-PC@GelMA組中活菌密度較低，需進一步研究（圖4c）。總體而言，這些發(fā)現(xiàn)證實了光熱療法能夠有效破壞微生物結構，導致其死亡和清除（圖4d）。

圖4. BP@GelMA和BP-PC@GelMA的體外光熱抗菌作用_{。（a）金黃色葡萄球菌（S. aureus）在808 nm近紅外光（功率密度2.0 W cm}?2）照射3分鐘和5分鐘后的生長情況；（b）大腸桿菌（E. coli）在808 nm近紅外光（功率密度2.0 W cm?2）照射3分鐘和5分鐘后的生長情況；（c）BP和BP-PC處理之前和之后，細菌的SEM圖像及細菌菌落的代表性活/死測定圖像；（d）BP-PC抗菌機理示意圖

（5）BP-PC@GelMA增強大鼠顱骨缺損的體內修復

為了評估體內骨再生的效果，將三種不同的水凝膠構建體GelMA、BP@GelMA和BP-PC@GelMA植入SD大鼠的顱骨缺損中，持續(xù)4周或8周（圖5a）。術后所有四組SD大鼠恢復良好，未出現(xiàn)因實驗干預導致的死亡。

為了研究BP-PC@GelMA水凝膠對骨缺損愈合的影響，通過Micro-CT分析觀察了NC組、GelMA組、BP@GelMA組和BP-PC@GelMA組中新骨的形成情況。術后4周和8周，NC組和GelMA組在手術區(qū)域顯示出明顯的骨缺損。相比之下，BP-PC@GelMA組與其他三組相比，新骨形成顯著增強（圖5b）。通過定量形態(tài)學分析感興趣區(qū)域（ROI），BP-PC@GelMA組在術后4周的骨體積與組織體積比（BV/TV）顯著高于其他三組。術后8周，BP-PC@GelMA組的BV/TV達到68.08%，顯著超過其他組。此外，術后4周，BP-PC@GelMA組的骨小梁分離度（Tb.Sp）為0.72μm，顯著低于其他組。術后8周，BP-PC@GelMA組的Tb.Sp為0.45μm，顯著低于其他組（圖5c）。

通過HE染色和Masson三色染色評估新骨的質量和數(shù)量。結果顯示，在術后4周時，BP@GelMA和BP-PC@GelMA組顯示出顯著的骨再生增強。這些組中新骨小梁的形成增加，表明成骨活性增強。在術后8周時，BP@GelMA和BP-PC@GelMA組顯示出新骨體積的逐步增加，其缺損邊緣和表面，成熟骨呈現(xiàn)深紅色，與NC組和GelMA組中藍色染色的新骨形成鮮明對比，表明BP@GelMA和BP-PC@GelMA支架在再生過程中促進了更高水平的礦化和成熟（圖5d）。為了進一步研究骨再生過程中的成骨分化，進行了堿性磷酸酶（ALP）和I型膠原（COL-1）的免疫組化（IHC）染色。BP-PC@GelMA組中ALP和COL-1陽性細胞數(shù)量顯著高于其他兩組（圖5e）。這表明BP-PC@GelMA有效增強了成骨分化并促進了骨再生。

圖5. BP-PC@GelMA可增強顱骨缺損的體內修復_{。（a）大鼠治療方案示意圖；（b）大鼠顱骨缺損的三維micro-CT掃描圖像；（c）骨體積分數(shù)（BV/TV）和骨小梁間距（Tb.Sp.）的定量分析；（d）術后4周和8周時顱骨缺損的蘇木精-伊紅（HE）染色和Masson三色染色圖像；（e）顱骨缺損后8周進行的堿性磷酸酶（ALP）和Ⅰ型膠原（COL-1）免疫組化（IHC）染色}

（6）對BP-PC@GelMA處理的rOBs進行定量蛋白質組學測序分析

通過設定閾值（|log2 FC|≥0 and q-value≤0.05），篩選出差異表達蛋白（DEGs）?；鹕綀D顯示，BP-PC@GelMA組中共有254個基因表達發(fā)生顯著變化，其中157個上調，97個下調（圖6a）。熱圖中展示了前20個差異最顯著的基因（圖6b）。關鍵差異基因：Sle25a11（維持線粒體融合/分裂事件及嵴的形態(tài)，通過調節(jié)線粒體谷胱甘肽水平抑制細胞凋亡）、SDHC（參與線粒體電子傳遞鏈復合體II）、Hk2（維持線粒體外膜完整性，防止促凋亡分子釋放）、STX17（調控自噬體與溶酶體膜的融合）和 Mtfr11（調控線粒體形態(tài)穩(wěn)態(tài)及AMPK依賴的應激誘導線粒體碎片化）。亞細胞定位分析顯示，12.2%的差異蛋白定位于線粒體（圖6c）。KEGG通路富集分析表明，BP-PC的成骨機制可能與溶酶體、自噬、氧化磷酸化及三羧酸循環(huán)（TCA）相關（圖6d）。進一步分析發(fā)現(xiàn)，Hippo和Wnt信號通路顯著富集（圖6e）?；虮倔w（GO）富集分析顯示，11.24%的差異蛋白與線粒體相關（圖6f）?；蚣患治觯℅SEA）證實，BP-PC處理的rOBs中Wnt信號通路上調，Hippo信號通路下調，氧化磷酸化相關通路活性增強，而ROS相關通路活性降低（圖6g）。

圖6. 定量蛋白質組學測序分析_{。（a）對照組和BP-PC組之間差異蛋白質組學分析的火山圖；（b）對照組和BP-PC組中差異蛋白質的熱圖；（c）對照組和BP-PC組中差異蛋白質的亞細胞定位結果的餅圖；（d，e）對照組和BP-PC組差異蛋白KEGG富集分析的條形圖和氣泡圖；（f）對照組和BP-PC組的差異蛋白GO富集分析條形圖；（g）Hippo、Wnt、氧化磷酸化和ROS富集狀態(tài)的GSEA分析}

（7）BP-PC@GelMA通過Hippo和Wnt/β-連環(huán)蛋白信號通路的串擾調控線粒體穩(wěn)態(tài)

基于KEGG定量蛋白質組學結果，評估不同BP和BP-PC處理下β-連環(huán)蛋白、YAP和TEAD的表達。BP-PC處理后，β-連環(huán)蛋白、YAP和TEAD表達顯著增加（圖7a）。為研究BP-PC@GelMA促進成骨機制，評估其對rOBs線粒體功能和形態(tài)影響。TEM觀察發(fā)現(xiàn)，成骨誘導結合BP-PC@GelMA處理后，短棒狀線粒體數(shù)量顯著增加（圖7d）。MitoTracker染色顯示，BP-PC@GelMA處理后，rOBs線粒體呈分散網狀，圓形線粒體比例增加（圖7b）。定量分析表明，該組單個線粒體數(shù)量和分裂增加，網絡數(shù)量減少（圖7c）。進一步評估線粒體功能，結果顯示BP-PC@GelMA組線粒體ATP輸出最高，表明其增強了rOBs線粒體ATP生成（圖7e）。此外，檢測BP-PC@GelMA清除細胞內ROS能力，使用DCFH-DA評估ROS清除情況（圖7f）。H?O?刺激模擬高ROS環(huán)境。使用JC-1和MitoSOX Deep Red評估線粒體膜電位和ROS生成。共定位結果顯示，ROS誘導下，JC-1聚集體/單體比例顯著降低（圖7g），表明線粒體去極化和功能受損。為研究Hippo和Wnt信號通路串擾對線粒體穩(wěn)態(tài)影響，使用拮抗劑LF3和IK-930。通過TMRM染色分析線粒體膜電位，發(fā)現(xiàn)LF3和IK-930處理后膜電位降低（圖7h）。MitoTracker染色顯示，處理后rOBs線粒體數(shù)量和熒光強度減少，形成稀疏網狀結構，遠離細胞核。Hoechst染色顯示核熒光增強，提示潛在凋亡（圖7i,j）。TEM觀察到線粒體數(shù)量減少，多融合為拉長形態(tài)（圖7k）。評估線粒體功能，結果顯示ATP輸出減少，降低rOBs中ATP生成（圖7l）。

圖7. BP-PC@GelMA對線粒體功能的影響_{。（a）β-連環(huán)蛋白、YAP、TEAD蛋白的表達及其定量分析；（b）通過激光共聚焦顯微鏡觀察rOBs線粒體網絡的形態(tài)學變化；（c）使用Kruskal-Wallis檢驗對個體線粒體計數(shù)、足跡和網絡數(shù)量進行統(tǒng)計分析；（d）通過透射電鏡觀察rOBs線粒體形態(tài)；（e）測定不同處理下rOBs線粒體ATP的產生；（f）不同處理組的ROS染色；（g）JC-1和mtSOX深紅色在不同處理組中的共定位染色；（h）不同組織的TMRM染色模式在各治療組中的表現(xiàn)；（i）通過激光共聚焦顯微鏡觀察線粒體動力學的變化；（j）使用Kruskal-Wallis檢驗對個體線粒體計數(shù)和網絡數(shù)量進行統(tǒng)計學分析；（k）用LF3和IK-980處理后，通過TEM檢查rOBs的線粒體形態(tài)；（l）測定不同處理下rOBs線粒體ATP的產生}

（8）BP-PC@GelMA通過增強線粒體動態(tài)依賴性成骨分化促進成骨

分析了rOBs中線粒體分裂和融合標志蛋白的表達模式，重點關注分裂相關Drp1、FIS1和MFF，以及融合相關Mfn1、Mfn2和OPA1。BP-PC@GelMA處理后，分裂相關基因Drp1和FIS1表達上調，F(xiàn)IS1表達量較NC組增加近四倍，MFF表達不變；融合標志物中Mfn2表達增加，OPA1減少，Mfn1無明顯變化（圖8a）。MitoTracker活細胞成像顯示rOBs中線粒體分裂活躍（圖8b）。推測BP-PC@GelMA可能通過調控線粒體動態(tài)影響分裂融合過程，發(fā)揮促成骨作用。

隨后，研究敲除FIS1對BP-PC@GelMA處理的rOBs線粒體動態(tài)和成骨分化的影響。設計三條靶向FIS1的siRNA序列，選敲除效率最高的siFIS1-3（圖8c）。FIS1干擾使線粒體形態(tài)從松散環(huán)形變緊密網狀，長度和表面積顯著增加（圖8d,e）。同時，BP-PC@GelMA處理后，成骨標志物RUNX2、ALP和COL-1表達水平較NC組顯著下降（圖8f）。ALP染色和活性檢測結果一致，表明FIS1下調減弱BP-PC@GelMA對rOBs成骨分化的促進作用（圖8g）。因此，BP-PC@GelMA通過調控線粒體動態(tài)促進rOBs成骨分化。

圖8. BP-PC@GelMA通過線粒體動力學促進成骨細胞分化_{。（a）處理7天后，通過PCR分析線粒體分裂（DRP1、FIS1、MFF）和融合標記（MFN1、MFN2、OPA1）的表達；（b）使用激光共聚焦顯微鏡，通過MitoTracker對rOB進行活細胞成像；（c）轉染后24小時，通過PCR證實最有效的FIS1敲除序列；（d）通過共聚焦顯微鏡評估線粒體網絡形態(tài)；（e）線粒體形態(tài)學的統(tǒng)計分析；（f）通過PCR評價各組間ALP、Runx2和Col-1的表達水平；（g）處理組（NC、siFIS1、siFIS1 + BP-PC）的相應ALP染色結果}

（9）BP-PC@GelMA作為線粒體質量控制（MQC）平臺增強rOBs的分化

為了研究BP-PC@GelMA處理后rOBs中線粒體自噬水平的變化，通過Western blot分析量化了rOBs中線粒體自噬標志物LC3的表達水平。結果顯示，BP-PC@GelMA處理組的LC3表達顯著增加，表明該處理可能通過線粒體動態(tài)的變化增強了線粒體自噬（圖9b,c）。LysoTracker Deep Red和MitoTracker Green FM的共定位為線粒體自噬的發(fā)生提供了有力證據(jù)，線粒體自噬是一種針對功能失調線粒體的重要細胞回收過程。在本研究中，這兩種熒光染料被用于有效監(jiān)測線粒體自噬的動態(tài)。值得注意的是，成骨細胞（OBs）中溶酶體活性顯著增強，表現(xiàn)為LysoTracker Red熒光增加，同時GFP和LysoTracker Red陽性（黃色）區(qū)域顯著增多，表明其積極參與線粒體自噬過程（圖9a）。為了研究線粒體生物發(fā)生是否在線粒體數(shù)量增加中起作用，檢測了rOBs中線粒體生物發(fā)生標志物的表達。結果顯示，BP-PC@GelMA處理顯著提高了NRF1的表達，而TFAM的表達顯著降低。PGC-1α和NRF2的表達無明顯變化。此外，BP@GelMA組的NRF1和PGC-1α水平顯著增加。因此，推測BP納米片可能是通過BP-PC@GelMA處理促進線粒體生物發(fā)生的關鍵成分（圖9d）。

圖9. BP-PC@GelMA通過MQC促進成骨細胞分化_{。（a）用LysoTracker}? _{Red和MitoTracker?綠色FM進行共定位染色；（b）自噬相關蛋白（LC3）的Western印跡分析；（c）LC3表達的定量分析；（d）線粒體生物發(fā)生相關基因（NRF1、PGC-1α、NRF2、TFAM）的PCR分析}