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研究背景：

針對上述問題，浙江大學(xué)黃品同教授團(tuán)隊開發(fā)了一種負(fù)載碳點的微泡系統(tǒng)（MnCDs@O2MBs），通過超聲波觸發(fā)實現(xiàn)氧氣供應(yīng)增強及抗菌作用。該系統(tǒng)不僅能有效逆轉(zhuǎn)傷口區(qū)域的缺氧狀況，促進(jìn)細(xì)胞增殖和新血管生成，還能在超聲波的作用下產(chǎn)生ROS，以破壞細(xì)菌生物膜結(jié)構(gòu)并殺滅細(xì)菌。體內(nèi)實驗表明，這種新型治療方法顯著加速了小鼠全層皮膚傷口的愈合過程，并未對主要器官造成顯著炎癥或病理損傷，顯示出良好的生物安全性。這為克服復(fù)雜傷口愈合挑戰(zhàn)提供了一種創(chuàng)新且有效的策略。該文章以《Dual oxygen supply system of carbon dot-loaded microbubbles with acoustic cavitation for enhanced sonodynamic therapy in diabetic wound healing》為題于2025年1月25日發(fā)表于《Biomaterials》上（DOI: 10.1016/j.biomaterials.2025.123145）。

研究示意圖

（1）合成與表征 MnCDs 和 MnCDs@O2MBs

透射電子顯微鏡(TEM)圖像（Fig. 1a）顯示MnCDs為單分散納米顆粒，平均粒徑約為2.19 ± 0.6 nm；高分辨率透射電子顯微鏡(HRTEM)圖像（Fig. 1b）進(jìn)一步證實了其良好的結(jié)晶性。UV-Vis吸收光譜（Fig. 1c）表明MnCDs具有獨特的吸光特性，而傅里葉變換紅外光譜(FT-IR)（Fig. 1d）則確認(rèn)了生物素的成功結(jié)合。共聚焦激光掃描顯微鏡(CLSM)圖像（Fig. 1e）展示了MnCDs與藻酸鹽(ALG)的有效整合，標(biāo)尺為2 μm。動態(tài)光散射(DLS)測量（Fig. 1f）給出了MnCDs@O2MBs的水動力直徑，平均值為1581 ± 408.8 nm，證明了系統(tǒng)的穩(wěn)定性和均一性。最后，Zeta電位測量（Fig. 1g）顯示從自由O2MBs的-25.1 mV變?yōu)镸nCDs@O2MBs的-21.9 mV，表明MnCDs的成功加載及系統(tǒng)整體穩(wěn)定性增強。這些結(jié)果綜合說明了MnCDs及其復(fù)合材料MnCDs@O2MBs具備理想的物理化學(xué)特性和穩(wěn)定性，為其在聲動力療法(SDT)及糖尿病傷口愈合中的應(yīng)用提供了堅實的基礎(chǔ)。

圖1. MNCD和MNCD@O2MB的合成和表征。（a）MNCD的TEM圖像（插圖：MNCD的粒度分布），比例尺：5 nm；（b）MNCD的HRTEM圖像，比例尺：2 nm；（c）水培養(yǎng)基中游離CD和MNCD的UV-VIS吸收光譜；（d）MNCD、NHS-BIOTIN和MNCDSBIOTIN的FT-IR光譜；（e）MNCDS@O2MBS的CLSM圖像，比例尺：2 μm；（f）MNCDS@O2MBS的流體動力直徑；（g）MNCD、Free O2MB和MNCD@O2MB的ζ電位

（2）雙氧自供系統(tǒng)的體外ROS生成性能

示意圖（Fig. 2a）展示了超聲波觸發(fā)下通過物理和化學(xué)途徑實現(xiàn)的雙氧自供系統(tǒng)的工作原理。氧氣生成曲線（Fig. 2b）顯示，在10 mM H?O?反應(yīng)中，O?MBs迅速釋放儲存的氧氣，而MnCDs則通過類過氧化氫酶反應(yīng)持續(xù)產(chǎn)生氧氣，插圖展示了超聲波照射下產(chǎn)生的氧氣氣泡。不同濃度和時間條件下的單線態(tài)氧（1O?）生成情況（Fig. 2c-d）表明，隨著MnCDs濃度增加和超聲波照射時間延長，1O?生成量顯著提高，證明了MnCDs作為高效聲敏劑的作用。進(jìn)一步評估不同處理條件下的1O?生成（Fig. 2e-f），結(jié)果顯示即使在低氧環(huán)境下，有H?O?存在時也能生成1O?，證實了該系統(tǒng)在缺氧條件下增強SDT效果的能力。甲基藍(lán)（MB）降解實驗（Fig. 2g）驗證了羥基自由基（·OH）的生成，表明MnCDs和MnCDs@O?MBs在超聲波照射下均能顯著降解MB。熒光圖像（Fig. 2h）展示了不同處理條件下金黃色葡萄球菌（S. aureus）中的ROS生成情況，標(biāo)尺為50 μm，并且對應(yīng)的熒光強度統(tǒng)計數(shù)據(jù)（Fig. 2i）顯示，MnCDs@O?MBs組的熒光水平顯著高于單獨使用MnCDs，證實了由雙氧自供系統(tǒng)提供的氧氣顯著增強了SDT效應(yīng)，顯示出更優(yōu)越的殺菌效果。這些結(jié)果綜合表明，MnCDs@O?MBs能夠在富H?O?環(huán)境中快速且持續(xù)地供應(yīng)氧氣，并在超聲波作用下高效生成ROS，從而在對抗生物膜感染和促進(jìn)糖尿病傷口愈合方面展現(xiàn)出巨大潛力。

圖2. 雙氧供應(yīng)系統(tǒng)的體外ROS產(chǎn)生性能。（a）超聲通過MNCD@O2MBS通過物理和化學(xué)途徑觸發(fā)雙氧供應(yīng)系統(tǒng)的示意圖；（b）在不同處理下與10 mmol/L H?O?反應(yīng)10分鐘的O?生產(chǎn)曲線（插圖：在超聲照射下MNCDS@O2MBS和H?O?混合物中產(chǎn)生的O?氣泡）；（c）濃度；（d）時間；（e，f）不同處理依賴的1O?產(chǎn)生，通過記錄525 nm的SOSG探針強度檢測；（g）不同處理下產(chǎn)生的MB降解；（h）不同處理下金黃色葡萄球菌的熒光圖像，顯示ROS產(chǎn)生，比例尺：50 μm；（i）ROS產(chǎn)生熒光強度的相應(yīng)統(tǒng)計數(shù)據(jù)

（3）MnCDs@O?MBs的體外抗菌活性

瓊脂平板上的菌落圖像（Fig. 3a）顯示，在對照組和僅超聲波(US)處理組中存在大量菌落生長，而MnCDs+US和MnCDs@O?MBs+US組顯著減少了菌落數(shù)量，特別是在MnCDs@O?MBs+US組顯示出最強的殺菌能力。統(tǒng)計數(shù)據(jù)（Fig. 3b）進(jìn)一步表明，每毫升S. aureus懸浮液中的菌落形成單位(CFU)數(shù)量在MnCDs+US和MnCDs@O?MBs+US處理后顯著減少，再次證實了其高效的抗菌性能。使用XTT法評估細(xì)菌活力（Fig. 3c），結(jié)果顯示這些處理顯著降低了細(xì)菌活力。共聚焦激光掃描顯微鏡(CLSM)圖像（Fig. 3d）展示了不同處理條件下S. aureus懸液的活/死細(xì)菌染色情況，標(biāo)尺為200 μm，綠色熒光代表活細(xì)胞，紅色熒光代表死細(xì)胞；對照組和僅US處理組顯示大量的綠色熒光，而在MnCDs+US和MnCDs@O?MBs+US組中紅色熒光顯著增加，表明大量細(xì)菌被殺死。相對熒光強度統(tǒng)計數(shù)據(jù)（Fig. 3e）進(jìn)一步量化了活/死細(xì)菌的比例，結(jié)果顯示MnCDs@O?MBs+US組的紅色熒光強度顯著高于其他組別，證明該處理方式能夠更有效地殺死細(xì)菌。

圖3. MNCD@O2MBS的體外抗菌活性。（a）不同處理后瓊脂板上金黃色葡萄球菌菌落的圖像；（b）金黃色葡萄球菌懸浮液的每毫升CFU菌落的相應(yīng)統(tǒng)計數(shù)據(jù)；（c）通過XTT分析評估的細(xì)菌存活率；（d）不同處理下金黃色葡萄球菌懸浮液的活/死細(xì)菌染色的代表性CLSM圖像，比例尺：200 μm；（e）金黃色葡萄球菌懸浮液的活/死細(xì)菌染色法的相對熒光強度的相應(yīng)統(tǒng)計數(shù)據(jù)

（4）MNCDS@O2_MBS的空化效應(yīng)和體外抗菌活性

首先，實驗裝置圖（Fig. 4a）展示了用于測量慣性空化（IC）閾值的設(shè)置。結(jié)果顯示，在不同處理條件下（Fig. 4b），MnCDs@O?MBs在較低功率密度下即可產(chǎn)生顯著的空化效應(yīng)，并且隨著超聲波功率密度增加，空化現(xiàn)象更加明顯。生物膜覆蓋面積統(tǒng)計（Fig. 4c）表明，僅使用MnCDs@O?MBs處理時，生物膜結(jié)構(gòu)相對完整；而在結(jié)合超聲波處理后，生物膜顯著減少。共聚焦激光掃描顯微鏡(CLSM)圖像（Fig. 4d）顯示對照組具有完整的生物膜結(jié)構(gòu)，而MnCDs+US和MnCDs@O?MBs+US組中，生物膜被破壞，細(xì)菌表面出現(xiàn)皺縮和變形，標(biāo)尺為100 μm。進(jìn)一步通過結(jié)晶紫染色（CV）定量分析（Fig. 4e-g），發(fā)現(xiàn)MnCDs@O?MBs+US組的CV吸收最低，表明其對生物膜有最強的破壞效果，并且缺氧信號顯著降低，證實了有效的氧氣供應(yīng)。

圖4. MNCD@O2MBS超聲檢查的空化信號和滲透效應(yīng)。（a）超聲暴露和檢測系統(tǒng)的示意圖；（b）針對MNCD@O2MB和PBS計算的IC劑量作為聲壓函數(shù)的結(jié)果；（c）超聲觸發(fā)穿透生物膜的示意圖；（d）CLSM圖像顯示不同藥物在金黃色葡萄球菌生物膜中的分布，其中綠色熒光代表細(xì)菌生物膜，紅色熒光代表不同處理，比例尺：100 μm；（e）CLSM圖像橫向的相對強度分析；（f）生物膜的熒光強度的相應(yīng)統(tǒng)計數(shù)據(jù)；（g）生物膜下層藥物的熒光強度的相應(yīng)統(tǒng)計數(shù)據(jù)；（h）MNCD的滲透率與距離的相應(yīng)統(tǒng)計數(shù)據(jù)

掃描電鏡(SEM)圖像（Fig. 5a）揭示了不同處理條件下S. aureus生物膜的結(jié)構(gòu)變化，對照組和單獨使用MnCDs或O?MBs處理組顯示出完整的生物膜結(jié)構(gòu)，而MnCDs@O?MBs+US組則顯示出生物膜完全解體的現(xiàn)象。統(tǒng)計數(shù)據(jù)（Fig. 5b）進(jìn)一步確認(rèn)了SEM觀察到的結(jié)果，表明MnCDs@O?MBs+US組的生物膜質(zhì)量顯著減少。結(jié)晶紫染色（CV）吸光度測量（Fig. 5c）再次證明了MnCDs@O?MBs+US組對生物膜的顯著破壞效果。最后，使用缺氧探針進(jìn)行免疫熒光染色（Fig. 5d-e），評估了不同處理條件下生物膜內(nèi)的氧合狀態(tài)，結(jié)果顯示僅使用US或O?MBs處理的生物膜仍呈現(xiàn)高缺氧信號，而MnCDs@O?MBs+US組的缺氧信號顯著降低，表明該系統(tǒng)能夠有效逆轉(zhuǎn)生物膜內(nèi)的缺氧環(huán)境。

圖5. MNCD@O2MBS的體外抗菌活性。（a）不同處理下金黃色葡萄球菌生物膜的活/死細(xì)菌染色的3D-CLSM圖像，比例尺：200 μm；（b）不同處理下金黃色葡萄球菌的SEM圖像。紅色箭頭表示細(xì)菌形態(tài)的典型變形，綠色箭頭表示生物膜骨架的典型分散和塌陷，比例尺：2 μm；（c）不同處理后金黃色葡萄球菌生物膜的結(jié)晶紫染色圖像及其相應(yīng)的OD值；（d）不同處理下金黃色葡萄球菌的代表性免疫熒光圖像，隨后進(jìn)行低氧刺激染色；（e）熒光強度的相應(yīng)統(tǒng)計數(shù)據(jù)

（5）MnCDs@O?MBs的傷口消毒和愈合效果

示意圖（Fig. 6a）描繪了全層皮膚傷口生物膜感染模型的構(gòu)建及治療過程。代表性S. aureus感染小鼠的照片及其LB瓊脂平板菌落圖像（Fig. 6b）顯示，在第16天時，MnCDs@O?MBs+US組的傷口明顯縮小且?guī)缀鯖]有可見的感染區(qū)域，而其他組別則顯示出不同程度的感染和未愈合現(xiàn)象。模擬傷口變化圖（Fig. 6c）展示了不同處理條件下傷口隨時間的變化趨勢，并通過統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示了傷口縮小率（Fig. 6d），表明MnCDs@O?MBs+US組在所有時間點上的傷口縮小率最高，顯著加速了傷口愈合過程?？咕试u估（Fig. 6e）通過細(xì)菌菌落計數(shù)顯示，MnCDs@O?MBs+US組的細(xì)菌菌落數(shù)量最少，證明其最強的抗菌效果。進(jìn)一步的組織學(xué)分析包括H&E和Masson染色圖像（Fig. 6f），展示了第16天從不同處理組收集的皮膚組織結(jié)構(gòu)。黃色箭頭表示炎癥細(xì)胞（如淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞），黑色箭頭表示毛囊，綠色箭頭表示成纖維細(xì)胞，紅色箭頭表示新生血管。結(jié)果顯示，MnCDs@O?MBs+US組表現(xiàn)出良好的上皮層形成和規(guī)則排列的膠原纖維，同時再生了毛囊和新生血管，表明其優(yōu)異的傷口愈合能力?；贛asson三色染色定量分析膠原體積分?jǐn)?shù)（Fig. 6g），結(jié)果顯示MnCDs@O?MBs+US組的膠原沉積量最高，進(jìn)一步證實了其促進(jìn)傷口愈合的效果。

圖6. MNCD@O2MB的糖尿病傷口愈合作用。（a）全厚性傷口生物膜感染模型及治療程序的示意圖；（b）各種處理后觀察期間定期拍攝的金黃色葡萄球菌感染小鼠的代表性照片，以及相應(yīng)的LB瓊脂平板圖像，顯示第16天從感染小鼠病變組織中計數(shù)的細(xì)菌菌落，比例尺：5 mm；（c）不同治療方法處理的模擬傷口在第0、8和16天的圖像，以及（d）相應(yīng)的統(tǒng)計傷口收縮率；（e）通過細(xì)菌菌落數(shù)確定的不同治療的抗菌效率；（f）治療后第16天，不同治療組收集的皮膚組織的H&E和Masson染色圖像。黃色箭頭表示炎性細(xì)胞（包括淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞）；黑色箭頭表示毛囊；綠色箭頭表示成纖維細(xì)胞；紅色箭頭表示新生血管；（g）第16天不同組的膠原蛋白體積分?jǐn)?shù)的定量分析

（6）雙氧自助式SDT放大后傷口修復(fù)的機制與氣膜劑療法結(jié)合

示意圖（Fig. 7a）展示了蛋白質(zhì)組學(xué)測量的工作流程，確保實驗設(shè)計的系統(tǒng)性和可重復(fù)性?；鹕綀D（Fig. 7b）顯示了治療后糖尿病傷口組織中顯著上調(diào)和下調(diào)的差異表達(dá)蛋白（DEPs），表明該治療方法對蛋白質(zhì)表達(dá)有顯著影響（fold change > 1.20 或 < 0.83, p-value < 0.05）。正交偏最小二乘判別分析（OPLS-DA）得分圖（Fig. 7c）進(jìn)一步證實了對照組和MnCDs@O?MBs+US組之間明顯的蛋白質(zhì)表達(dá)差異。熱圖（Fig. 7d）展示了與傷口愈合相關(guān)的DEPs的相對表達(dá)水平，標(biāo)尺表示表達(dá)強度，有助于識別潛在的生物標(biāo)志物和治療靶點。GO注釋分類（Fig. 7e）顯示了DEPs在細(xì)胞成分、分子功能和生物過程中的分布情況，揭示了主要涉及的生物學(xué)通路。KEGG富集分析散點圖（Fig. 7f）則展示了顯著富集的代謝通路，進(jìn)一步闡明了治療對細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)路徑的影響?；贕O注釋和KEGG通路的基因集富集分析（GSEA）結(jié)果（Fig. 7g-l）提供了更詳細(xì)的分子機制信息，突出了特定生物過程和通路的富集情況。最后，蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)（Fig. 7m）使用STRING數(shù)據(jù)庫和Cytoscape插件Cytohubba構(gòu)建，并確定了前10個樞紐基因（Hub-genes），包括Tlr2、Cybb和Mmp8等，這些基因參與了TLR、TNF和NF-κB信號通路，調(diào)控炎癥反應(yīng)和皮膚發(fā)育。這表明該治療方案通過調(diào)節(jié)這些關(guān)鍵信號通路，促進(jìn)了傷口從炎癥期向增殖期的轉(zhuǎn)變，從而加速了皮膚再生和角質(zhì)形成細(xì)胞分化。

圖7. 雙氧自供應(yīng)SDT放大抗生素治療時傷口修復(fù)的蛋白質(zhì)變化。（a）蛋白質(zhì)組學(xué)測量的示意圖及工作流程；（b）雙氧自供應(yīng)SDT放大空化效應(yīng)與對照組（未經(jīng)治療的糖尿病傷口組織）中蛋白質(zhì)豐度的差異，以火山圖表示；（c）基于蛋白質(zhì)表達(dá)水平的所有樣本的正交偏最小二乘判別分析（OPLS-DA）；（d）MNCD@O2MB介導(dǎo)的SDT和對照組治療的糖尿病傷口組織的熱圖，與未經(jīng)治療的糖尿病傷口組織相關(guān)；（e）差異表達(dá)蛋白（DEP）的生物學(xué)過程注釋；（f）KEGG富集分析散點圖；（g–l）基于GO注釋和KEGG通路的GSEA分析；（m）通過Cytoscape插件CytoHubba測量的前10個中心基因的PPI網(wǎng)絡(luò)，顏色深淺表示由MCC算法排名的指數(shù)

（7）體內(nèi)巨噬細(xì)胞極化和炎癥調(diào)節(jié)

超聲圖像（Fig. 8a）展示了不同處理組在第4天、第8天和第16天的B模式和多普勒模式下的肉芽組織血流情況，顯示出MnCDs@O?MBs+US組在早期即表現(xiàn)出顯著的血管生成，并在整個實驗過程中保持較高的血流面積比例（Fig. 8b）。免疫組化染色圖像（Fig. 8c）顯示了各組別在第4天、第8天和第16天肉芽組織中CD31表達(dá)情況，標(biāo)尺為100 μm，對照組和僅US處理組顯示出較少的CD31陽性細(xì)胞，而在MnCDs@O?MBs+US組中，CD31陽性細(xì)胞顯著增加，表明其促進(jìn)了血管生成，對應(yīng)的統(tǒng)計數(shù)據(jù)（Fig. 8d）進(jìn)一步證實了這一點。此外，酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）檢測結(jié)果顯示，MnCDs@O?MBs+US組中促炎因子TNF-α（Fig. 8e）、IL-1β（Fig. 8f）和抗炎因子IL-6的濃度變化。具體來說，MnCDs@O?MBs+US組中TNF-α和IL-1β的水平顯著低于對照組和其他處理組，而IL-6水平則顯著升高（Fig. 8g），這表明該處理方式有效地抑制了系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)，同時增強了抗炎反應(yīng)，有助于創(chuàng)建一個更有利的傷口愈合微環(huán)境。

圖8. MNCD@O₂MB介導(dǎo)的傷口愈合的血管重建和抗炎功效。（a）第4天的B模式超聲圖像和第4、8、16天肉芽組織的多普勒成像圖；（b）超聲圖像的血流面積比的相應(yīng)統(tǒng)計數(shù)據(jù)；（c）第4、8、16天肉芽組織中CD31免疫組織化學(xué)染色的顯微照片，比例尺：100 μm；（d）CD31陽性細(xì)胞百分比的相應(yīng)統(tǒng)計數(shù)據(jù)；（e）通過ELISA測定的TNF-α血清濃度；（f）通過ELISA測定的IL-1β血清濃度；（g）通過ELISA測定的IL-6血清濃度