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研究背景：

針對上述問題，四川大學華西口腔醫(yī)院李繼遙教授、梁坤能副教授、楊佼佼副研究員團隊研究開發(fā)了一種基于單寧酸 - 絲素蛋白 - 鹽酸米諾環(huán)素（TA-SF-MCH，TSM）的濕粘附抗菌水凝膠系統(tǒng)，通過動態(tài)席夫堿反應和氫鍵作用構(gòu)建穩(wěn)定網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)，實現(xiàn)了米諾環(huán)素的持續(xù)釋放（長達 28 天），同時利用多酚結(jié)構(gòu)的濕粘附特性增強在牙周組織的滯留能力。實驗證實 TSM 對牙齦卟啉單胞菌和具核梭桿菌等主要牙周致病菌具有高效抑制作用，顯著減少局部細菌負荷并抑制牙槽骨破壞，為牙周感染的局部治療提供了新型解決方案。相關(guān)研究以“A mussel-inspired wet-adhesive prolonged-acting antibacterial hydrogels for the treatment of periodontitis”為題于2025年3月5日發(fā)表在《Chemical Engineering Journal》上（DOI：10.1016/j.cej.2025.161262）。

研究示意圖

（1）TSM 的制備

為應對牙周組織動態(tài)液體微環(huán)境（DLM）并增強長效抗菌效果，我們基于單寧酸（TA）的多酚結(jié)構(gòu)構(gòu)建了一種濕粘附抗菌牙周局部藥物遞送系統(tǒng)（PLAP）TSM（圖 1A）。通過 SF 的酰胺鍵與 TA 的酚羥基形成的氫鍵，將絲素蛋白（SF）整合到 TA 平臺中，構(gòu)建了穩(wěn)定的 β- 折疊 TA-SF（TS）網(wǎng)絡。通過 MCH 的氨基與自然氧化 TA 的羰基之間的動態(tài)席夫堿反應，將鹽酸米諾環(huán)素（MCH）引入 TS 網(wǎng)絡。這兩種反應均可在非活化、溫和的水性條件下進行，便于 TSM 在口腔中的應用。TSM 通過溶脹和擴散實現(xiàn) MCH 的持續(xù)釋放（圖 1B），并通過濕粘附能力延長局部滯留時間，從而抑制牙周炎進展（圖 1C）。

圖1 用于牙周炎長效抗菌治療的TSM水凝膠示意圖。（A）TSM通過TA與SF之間的氫鍵以及TA與MCH之間的動態(tài)席夫堿反應構(gòu)建；（B）TSM通過溶脹和擴散實現(xiàn)MCH的持續(xù)釋放，發(fā)揮長期抗菌作用；（C）TSM通過濕粘附能力延長局部滯留時間并可持續(xù)釋放MCH，從而抑制牙周炎進展并減少牙周組織破壞

（2）TSM 的表征

TSM 具備柔韌可塑性水凝膠特質(zhì)（圖 2A）。鑒于 MCH 自發(fā)熒光特性，運用 CLSM 觀察新鮮 TSM 凝膠內(nèi) MCH 含量與分布，其三維重建圖像見圖 2B。熒光強度（FI）隨 MCH 含量上升而增強，且四種 TSM 水凝膠 FI 均勻，說明 MCH 在水凝膠中分散均勻。所有 TSM 水凝膠均呈多孔結(jié)構(gòu)：TS 疏松、孔徑大且不規(guī)則；MCH 含量增加時，TSM 水凝膠更致密，孔徑小、分布均勻且形狀規(guī)則（圖 2C）。SEM 與 Cryo-SEM 檢測結(jié)果與 CLSM 觀察一致，均顯示 TSM 水凝膠多孔結(jié)構(gòu)。EDS 顯示 TSM2 凝膠含 C、N、O、Cl 元素，均勻分布（圖 2D）。 BET 比表面積與孔徑分析結(jié)果（圖 2E）表明，TSM2 平均孔徑（4.8213 nm）小于 TS（5.3144 nm），比表面積略大于 TS，與 CLSM 觀察相符。 經(jīng) FTIR、XPS、XRD 分析 TSM 化學結(jié)構(gòu)。FTIR 結(jié)果（圖 2G）顯示，TSM 各組紅外吸收峰與 TS 組一致，表明 MCH 負載未顯著影響 TS 的 β - 折疊凝膠網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)。XPS C 1s 光譜（圖 2F）表明 MCH 成功負載及載藥量。XRD 結(jié)果（圖 2H）顯示 TSM 水凝膠體系呈無定形態(tài)。

圖2 TSM2水凝膠的表征。（A）新鮮制備的TSM2水凝膠的照片；（B）新鮮制備的TSM2水凝膠的共聚焦激光掃描顯微鏡（CLSM）圖像；（C）新鮮制備的TSM2水凝膠的冷凍電子顯微鏡（Cryo-EM）圖像；（D）凍干TSM2水凝膠的能譜分析（EDS）元素分布映射圖；（E）凍干TSM2水凝膠的比表面積及孔徑分析（BET）；（F）TSM2水凝膠的X射線光電子能譜（XPS）C 1s光譜；（G）TSM2水凝膠的傅里葉變換紅外光譜（FTIR）；（H）TSM2水凝膠的X射線衍射（XRD）圖譜

（3）TSM 的濕粘附相關(guān)性能

經(jīng)動態(tài)頻率掃描、動態(tài)應變掃描及交替階躍應變掃描研究 TSM 的粘彈性、機械強度與自修復能力（圖 3A），其為具粘彈性的高粘度液體水凝膠，有機械強度和自修復能力，能在牙周微環(huán)境保持穩(wěn)定網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)。搭接剪切試驗（圖 3B）顯示，TSM - 釉質(zhì)界面剪切強度高于TS（p<0.05），在去離子水和羊血中分別為 3.94±0.07 kPa、8.73±1.32 kPa；TSM - 豬皮界面在去離子水和羊血中的剪切強度分別為 2.32±0.25 kPa、1.25±0.19 kPa。拉伸試驗（圖 3C）表明，TSM - 釉質(zhì)界面拉伸強度隨 MCH 載藥量波動，在去離子水和羊血中分別達 50.08±3.22 kPa、103.27±5.94 kPa；TSM - 豬皮界面中 TSM2 最優(yōu)，拉伸強度分別為 10.84±1.87 kPa、13.55±2.50 kPa。爆破壓力測試（圖 3D）顯示，TSM - 釉質(zhì)界面爆破壓力高于 TS，TSM2 在豬皮界面的爆破壓力達 31.2±4.7 kPa。適量 MCH 能增強粘附性能，過量則破壞界面結(jié)合，TSM2 在模擬界面和液體環(huán)境有最優(yōu)濕粘附能力。 FTIR 結(jié)果（圖 3E）顯示，HAP 在多處呈現(xiàn)特征峰，TA 在特定波數(shù)處有特征吸收，TA 吸附后的 HAP 出現(xiàn)寬峰及新峰，表明去質(zhì)子化羧酸根與鈣離子配位作用是 TA 吸附 HAP 主要機制。拉曼光譜（圖 3F）顯示，HAP 呈現(xiàn)磷酸根特征峰，TA-HAP 在特定波數(shù)范圍出現(xiàn)新峰，進一步證實吸附作用。 因粘蛋白是唾液中最豐富的大分子，用粘蛋白溶液模擬牙周軟組織。TA - 粘蛋白混合液在 280 nm 處吸光度顯著增加（圖 3G），可能源于 TA 的共軛粘附作用。時間依賴性 UV-vis 分析（圖 3H）表明 TA 與粘蛋白快速結(jié)合并形成穩(wěn)定復合物。

圖3 TSM水凝膠的濕粘附相關(guān)性能。（A）TSM2水凝膠的流變行為；（B）不同TSM水凝膠的搭接剪切強度；（C）不同MCH負載量的TSM水凝膠在拉伸試驗中的最大分離力；（D）不同MCH負載量的TSM水凝膠的爆破壓力；（E）TA吸附羥基磷灰石（HAP）的傅里葉變換紅外光譜（FTIR）；（F）TA吸附HAP的拉曼光譜；（G）TA-粘蛋白混合物的紫外-可見光譜；（H）TA-粘蛋白混合物的紫外-可見吸光度隨時間變化曲線

（4）TSM 濕粘附性能的作用機制

通過分子模擬探究水凝膠與膠原相互作用，構(gòu)建五個模擬系統(tǒng)（N1~N5），經(jīng) 100 ns 全原子分子動力學模擬和 MM/PBSA 方法計算結(jié)合自由能（圖 4A）。氫鍵分析（圖 4B）顯示，N1、N2 系統(tǒng)中 TA 與 SF 通過大量氫鍵穩(wěn)定，氫鍵對維持水凝膠網(wǎng)絡、奠定濕粘附基礎至關(guān)重要，且 MCH 加載和溶劑變化對 TA、SF 與膠原間非特異性氫鍵無顯著影響，與 TSM 在體內(nèi)穩(wěn)定且粘附口腔軟組織的現(xiàn)象相符。為深入探究分子間相互作用，放大分子間界面，以棍狀模型展示形成相互作用的殘基細節(jié)（圖 4C~4E）。

圖4 TA（單寧酸）、SF（絲素蛋白）和MCH（甲殼素）在磷酸鈣溶劑中的相互作用。（A）N1-N5系統(tǒng)的結(jié)合自由能；（B）N2、N4和N5系統(tǒng)的氫鍵總數(shù)；（C-E）N2、N4和N5系統(tǒng)中氫鍵的代表性快照

圖5 標記形成的水橋，以展現(xiàn)水分子在濕粘附中的貢獻。 綜上，氫鍵在維持水凝膠網(wǎng)絡中起關(guān)鍵作用，為濕粘附奠定基礎。MCH 引入和不同溶劑對 TA、SF 和膠原蛋白間非特異性氫鍵無顯著影響，與 TSM 水凝膠在體內(nèi)保持穩(wěn)定結(jié)構(gòu)并牢固粘附于口腔軟組織的現(xiàn)象一致。

圖5 TS-膠原蛋白和TSM-膠原蛋白相互作用中形成的水橋代表性快照。（A）在N3系統(tǒng)中，水橋形成于TA的氧原子與膠原蛋白中HYP的羥基氧原子之間（左）；以及TA的氧原子與HYP的羰基氧原子之間（右）；（B）在N4系統(tǒng)中，水橋形成于TA的氧原子與膠原蛋白中HYP的羥基氧原子之間（左）；SF中ASN殘基的氧原子與膠原蛋白中GLY的氧原子之間（右上）；SF中ASP殘基氨基的氫原子與膠原蛋白中HYP殘基的氧原子之間（右下）；（C）在N5系統(tǒng)中，水橋形成于SF中ARG殘基的氫原子與膠原蛋白中GLY殘基的氧原子之間，以及SF中ARG殘基氨基的氫原子與膠原蛋白中HYP殘基的氧原子之間（左）；TA的氧原子與膠原蛋白中PRO殘基的氫原子之間（右上）；TA的氧原子與膠原蛋白中PRO殘基的氫原子之間（右下）

（5）TSM 的長效抗菌性能

與水凝膠共培養(yǎng) 48 小時后，P. gingivalis 和 F. nucleatum 菌懸液照片（圖 6 ）顯示，TS 組菌懸液渾濁，TSM 組保持澄清，與菌懸液光密度值（OD）一致（圖 6B、6D），表明 TSM 具有優(yōu)異抗菌活性，而 TS 無明顯抑菌作用。P. gingivalis 生長曲線（圖 6F）顯示，對照組在 20 小時左右進入對數(shù)生長期，40 小時達平臺期，而 TSM 各組均未觀察到對數(shù)生長期。TS 組的 CFU 值略低于對照組，TSM1 和 TSM2 組的 CFU 值顯著降低（p<0.05），TSM3 和 TSM4 組未檢測到菌落（圖 6C、6E）。抑菌圈實驗（圖 6A）顯示，TS 周圍無明顯抑菌圈，TSM 組抑菌圈直徑隨 MCH 載藥量增加而增大（TSM1:54.10±4.74 mm；TSM4:73.11±3.54 mm）。掃描電鏡結(jié)果（圖 6G）顯示，TS 表面可見大量球形細菌聚集，而 TSM 組細菌數(shù)量顯著減少，出現(xiàn)大量破裂菌體。 TS 本身無法抑制細菌增殖，甚至可能因 SF 提供的蛋白質(zhì)營養(yǎng)和多孔網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)而促進生長，且 TA 的鄰苯三酚基團可能促進細菌粘附。而 TSM 通過 MCH 的抗菌作用和 TA 酚羥基被部分占據(jù)減少細菌粘附，從而增強抗菌效果?；谏鲜鼋Y(jié)果，初步篩選 TSM2 進行后續(xù)實驗。

圖6 TSM水凝膠對牙齦卟啉單胞菌（P. gingivalis）的體外抗菌活性。（A）共培養(yǎng)48小時后TSM水凝膠的抑菌圈（白色虛線圓圈標記）；（B）與TSM水凝膠共培養(yǎng)48小時后菌懸液的照片；（C）與TSM水凝膠共培養(yǎng)48小時后牙齦卟啉單胞菌的菌落圖像；（D）牙齦卟啉單胞菌與TSM水凝膠共培養(yǎng)48小時后菌懸液的最終光密度值（OD）；（E）48小時后牙齦卟啉單胞菌的菌落形成單位計數(shù)（CFU）；（F）牙齦卟啉單胞菌的生長曲線；（G）牙齦卟啉單胞菌形態(tài)與數(shù)量的掃描電子顯微鏡（SEM）圖像

（6）TSM 的藥物緩釋與長效抗菌性能

MCH 釋放曲線顯示（圖 7A），無論介質(zhì)更換頻率如何，TSM 均可實現(xiàn) MCH 持續(xù)釋放 28 天，且累積釋放量隨更換頻率增加而顯著提高。降解實驗顯示（圖 7B-D），在蛋白酶 XIV 溶液中 TSM2 完全降解，而在 PBS 和 I 型膠原酶溶液中質(zhì)量保持穩(wěn)定，表明其結(jié)構(gòu)可抵抗牙周水性環(huán)境和致病菌酶的干擾。綜上，TSM 通過穩(wěn)定的網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)抵抗液體沖刷，結(jié)合擴散 - 溶脹協(xié)同釋藥機制，實現(xiàn)了 MCH 的緩慢均勻釋放，在復雜牙周環(huán)境中保持有效藥物濃度，顯著抑制細菌增殖并減少牙槽骨破壞，為牙周炎的長期治療提供了新策略。

圖7 TSM2水凝膠的藥物釋放與降解行為。（A）TSM2水凝膠的累積MCH釋放曲線及其非線性擬合方程（FMR1/1：每天更換介質(zhì)；FMR1/2：每2天更換介質(zhì)；FMR1/4：每4天更換介質(zhì)；FMR1/7：每7天更換介質(zhì)）；（B）TSM2水凝膠在不同溶液中的降解動力學曲線（蛋白酶XIV組、Ⅰ型膠原酶組、PBS對照組）；（C）TSM2水凝膠在不同水環(huán)境下（PBS、蛋白酶XIV、Ⅰ型膠原酶）的宏觀形態(tài)變化（D0-D30）；（D）TSM2水凝膠在不同溶液中降解過程的掃描電子顯微鏡（SEM）圖像

（7）TSM 治療牙周炎的體內(nèi)療效

采用絲線結(jié)扎聯(lián)合牙齦卟啉單胞菌（P. gingivalis）接種的方法建立大鼠牙周炎模型（圖 8A）。通過 Micro CT 三維重建（圖 8D）和組織學染色（圖 9A-B）評估 TSM 的治療效果。結(jié)果顯示，TSM 組的牙齦卟啉單胞菌負荷顯著低于生理鹽水組（圖 8E），牙槽骨吸收（CEJ-ABC）減少至 0.618±0.058 mm，骨體積分數(shù)（BV/TV）維持在 40.90±6.43%，優(yōu)于 Periocline 組（圖 8F-G）。

圖8 TSM治療牙周炎的體內(nèi)療效。（A）模型構(gòu)建與治療流程示意圖；（B）絲線結(jié)扎前后手術(shù)區(qū)域的照片；（C）TSM2水凝膠在48小時內(nèi)的體內(nèi)牙周粘附情況；（D）第28天大鼠上頜牙槽骨的Micro CT三維重建及二維圖像；（E）牙周組織中牙齦卟啉單胞菌負荷的qPCR結(jié)果；（F）CEJ-ABC（釉牙骨質(zhì)界至牙槽嵴頂距離）的定量分析；（G）BV/TV（骨體積分數(shù)）的定量分析（均值±標準差，n=5）

H&E 染色顯示 TSM 組牙槽嵴高度明顯高于對照組，炎癥細胞浸潤減少；Masson 染色顯示 TSM 組牙周膜纖維排列更致密，膠原沉積更完整（圖 9）。免疫組化結(jié)果表明 TSM 顯著降低 IL-1β、IL-6 和 TNF-α 的表達，證實其抗炎效果。TSM 通過長效抗菌和濕粘附特性，有效抑制細菌增殖和炎癥反應，減少牙槽骨破壞，治療效果優(yōu)于臨床藥物 Periocline。

圖9 大鼠上頜牙槽骨切片的組織學染色結(jié)果。（A）H&E染色顯示各組牙槽骨高度及牙齦炎癥程度（黑色虛線框示炎癥區(qū)域）；（B）Masson染色顯示牙周膜纖維排列和膠原沉積情況（紅色：膠原纖維；藍色：細胞核）