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研究背景：

針對上述問題，中國科學(xué)院大學(xué)李俊柏教授團(tuán)隊開發(fā)了一種針對膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（GBM）術(shù)后治療的創(chuàng)新策略，構(gòu)建了一種原位可注射的肽水凝膠系統(tǒng)，負(fù)載谷氨酰胺酶抑制劑CB-839和銅離子-肽配位納米顆粒（Cu-His NPs）用于化學(xué)動力治療（CDT）。該系統(tǒng)通過抑制谷氨酰胺代謝，降低腫瘤細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽（GSH）水平，從而增強(qiáng)CDT的細(xì)胞毒性，同時誘導(dǎo)免疫原性細(xì)胞死亡（ICD）以激活免疫反應(yīng)對抗腫瘤微環(huán)境。研究中使用的短肽水凝膠由Fmoc-YYK和Fmoc-YD自組裝形成，具有優(yōu)異的生物相容性和低免疫原性，能夠填充術(shù)后空腔，物理限制腫瘤增殖，并通過調(diào)節(jié)降解實現(xiàn)藥物的可控釋放。實驗結(jié)果表明，這種基于代謝重編程的聯(lián)合治療策略能夠有效抑制GBM復(fù)發(fā)，并顯著延長小鼠的總生存期，為GBM術(shù)后治療提供了一種新的解決方案。該文章于2025年2月20日以《Immunostimulatory Hydrogel with Synergistic Blockage of Glutamine Metabolism and Chemodynamic Therapy for Postoperative Management of Glioblastoma》為題發(fā)表于《Advanced Science》（DOI：10.1002/advs.202412507）。

研究示意圖

（1）復(fù)合凝膠的合成與表征

本研究成功制備了負(fù)載Cu2?-肽納米粒子（Cu-His NPs）和谷氨酰胺酶抑制劑CB-839的可注射肽水凝膠（組合凝膠）（圖1A）。采用帶正電荷的Fmoc-YYK和帶負(fù)電荷的Fmoc-YD短肽分子，通過靜電和π-π相互作用構(gòu)建水凝膠支架。Cu-His NPs作為CDT發(fā)生器，通過組氨酸的咪唑基團(tuán)與Cu2?配位，實現(xiàn)Cu2?在腫瘤微環(huán)境中的靶向釋放。其SEM圖像（圖1B）和HRTEM圖像（圖1C）顯示，Cu-His NPs為直徑約40 nm的球形顆粒，且X射線光電子能譜（XPS）結(jié)果表明Cu2?與肽鏈內(nèi)氮或氧原子形成配位鍵（圖1D）。電子探針微分析（EPMA）進(jìn)一步證實Cu2?在樣品中的均勻分布（圖1E）。Cu-His NPs和CB-839被封裝于水凝膠中，掃描電子顯微鏡（SEM）圖像顯示其在纖維基質(zhì)中均勻分散（圖1F），且凝膠具有優(yōu)異的注射性（圖1G）。通過調(diào)整短肽分子組裝，制備了與腦組織機(jī)械性能（1–2 kPa）相匹配的凝膠支架（圖1H），并驗證其生物相容性（圖1I）。

圖1 可注射水凝膠Combo Gel的特性。（A）Combo Gel制備的示意圖；（B）Cu-His NPs的SEM圖像；（C）Cu-His NPs的HRTEM圖像；（D）Cu-His NPs和Fmoc-HH的XRD光譜，黑色箭頭指示衛(wèi)星峰的位置；（E）通過EPMA檢測的Cu-His NPs的COMPO圖像以及Cu、N元素分布圖像；（F）Combo Gel的SEM圖像；（G）通過22號針頭將Combo Gel注入水中時，立即形成穩(wěn)定的凝膠；（H）在37°C下，F(xiàn)moc-YD/YYK水凝膠在不同濃度下的幅度掃描曲線，實驗重復(fù)了三次；（I）與陽性對照組相比，不同濃度的Fmoc-YD/YYK水凝膠的生物相容性，F(xiàn)moc-YD/YYK是指Fmoc-YD和Fmoc-YYK的1:1混合物，n=3

（2）水凝膠的體外抗腫瘤研究

Cu2?可與谷胱甘肽（GSH）發(fā)生氧化還原反應(yīng)，生成Cu?和氧化型谷胱甘肽（GSSG）。SEM分析顯示，Cu-His NPs在與GSH反應(yīng)5分鐘后即失去球形完整性（圖2A），表明反應(yīng)動力學(xué)極快。這證實了Cu-His NPs在GSH存在下可降解并產(chǎn)生Cu?和GSSG。亞甲藍(lán)（MB）的紫外吸收峰可用于檢測羥基自由基（·OH）的生成。圖2B顯示，MB單獨與H?O?反應(yīng)或與Cu-His NPs和GSH混合時，4小時內(nèi)紫外吸收峰變化較小；而當(dāng)MB、H?O?、Cu-His NPs和GSH共同存在時，紫外吸收峰顯著變化。這表明在GSH存在下，Cu2?與H?O?的類芬頓反應(yīng)可高效產(chǎn)生·OH，從而靶向破壞腫瘤細(xì)胞。

圖2 銅-組氨酸納米顆粒的CDT機(jī)制，以及銅-組氨酸納米顆粒和CB-839在體外的協(xié)同細(xì)胞毒性作用，以及水凝膠延長藥物局部滯留和釋放的能力。（A）在不同時間間隔下，銅-組氨酸納米顆粒與GSH混合的SEM圖像；（B）4小時反應(yīng)后MB的降解證實了Cu?與H?O?之間的類芬頓反應(yīng)，產(chǎn)生·OH，；（C）水凝膠中銅-組氨酸納米顆粒和CB-839的累積釋放曲線；（D）定量分析了水凝膠在小鼠大腦中的降解；（E）使用IVIS系統(tǒng)在特定時間點捕獲老鼠大腦中水凝膠滯留的熒光圖像，水凝膠用Cy5標(biāo)記以進(jìn)行追蹤；（F）在24小時孵育后，評估了銅-組氨酸納米顆粒和CB-839對GL261細(xì)胞系的抑制作用；（G）GL261細(xì)胞在暴露于銅-組氨酸納米顆粒和CB-839 12小時后的活/死染色；（H）體外免疫串?dāng)_實驗，每個分級的上清液與巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)后，通過巨噬細(xì)胞檢測IL-10分泌

Cu-His NPs在水凝膠中釋放12小時后保持球形結(jié)構(gòu)。Cu-His凝膠和CB-839凝膠浸泡于37°C的PBS中，5天后Cu-His NPs和CB-839釋放量分別為57%和49%，20天后均達(dá)80%（圖2C）。兩種藥物遵循零級釋放動力學(xué)，表明水凝膠有效維持藥物釋放，延長滯留時間。藥物釋放速率與水凝膠體積損失同步，主要依賴于水凝膠降解。體內(nèi)實驗中，組合凝膠注入小鼠大腦后，通過IVIS系統(tǒng)監(jiān)測Cy5標(biāo)記的水凝膠信號（圖2D, E），表明水凝膠在小鼠顱腔內(nèi)迅速發(fā)生溶膠-凝膠轉(zhuǎn)變，有效防止藥物快速釋放。

使用CCK-8試劑盒檢測GL261膠質(zhì)瘤細(xì)胞系在Cu-His NPs、CB-839單獨或聯(lián)合處理24小時后的細(xì)胞抑制率（圖2F）。結(jié)果顯示，聯(lián)合治療的細(xì)胞抑制率顯著高于單藥處理，10 μg/mL聯(lián)合藥物濃度下抑制率達(dá)27%?；?死細(xì)胞染色實驗也證實了聯(lián)合治療的協(xié)同作用（圖2G）。通過ELISA檢測與GL261細(xì)胞系上清液共培養(yǎng)的RAW264.7巨噬細(xì)胞分泌的IL-10水平（圖2H）。GL261細(xì)胞系上清液使巨噬細(xì)胞IL-10分泌增加約7倍，而CB-839處理后的GL261細(xì)胞系上清液誘導(dǎo)的IL-10水平顯著降低，約為對照組的2倍（195.9 pg/mL），表明CB-839可重新編程腫瘤細(xì)胞中的谷氨酰胺代謝，減少巨噬細(xì)胞向M2表型的極化。

（3）細(xì)胞對Cu-His NPs的攝取以及通過協(xié)同治療增強(qiáng)ROS生成和ICD效應(yīng)

Cu-His NPs與GSH相互作用時發(fā)出紫色-紅色熒光。為可視化Cu-His NPs的細(xì)胞內(nèi)釋放過程，使用Lysotracker Red標(biāo)記溶酶體，并與標(biāo)記有Cy5的Cu-His NPs（藍(lán)色熒光）共定位（圖3A）。孵育4小時后，Cu-His NPs的熒光幾乎完全與溶酶體熒光重疊，顯示黃色熒光，表明Cu-His NPs在胞吞后被隔離在溶酶體中，并部分逃逸到細(xì)胞質(zhì)中。這證實了Cu-His NPs在細(xì)胞內(nèi)可逃逸至溶酶體并釋放藥物，增強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)功效。其機(jī)制可能涉及組氨酸在溶酶體酸性環(huán)境中的質(zhì)子化及其電荷變化，促進(jìn)其與溶酶體膜的相互作用并實現(xiàn)逃逸。

過量的活性氧（ROS）會破壞腫瘤細(xì)胞的氧化還原平衡，誘導(dǎo)損傷或死亡，并觸發(fā)免疫原性細(xì)胞死亡（ICD），釋放損傷相關(guān)分子模式（DAMPs），激活抗原呈遞細(xì)胞（如樹突狀細(xì)胞），從而刺激免疫系統(tǒng)。谷胱甘肽（GSH）對抵抗ROS引起的氧化應(yīng)激至關(guān)重要，其水平與ROS呈負(fù)相關(guān)，GSH減少可能導(dǎo)致ROS積累和細(xì)胞死亡。該研究評估了不同配方對GL261細(xì)胞中GSH和GSSG水平的影響。結(jié)果顯示，CB-839和Cu-His NPs單獨處理可將GSH水平分別降低至19.0 μM和11.7 μM，而聯(lián)合使用時，GSH水平進(jìn)一步降低至8.2 μM（圖3B）。隨后，通過DCFH-DA染色監(jiān)測治療后腫瘤細(xì)胞的ROS產(chǎn)生，發(fā)現(xiàn)聯(lián)合治療組的ROS產(chǎn)生最高，熒光強(qiáng)度顯著增加（圖3D）。此外，與ICD相關(guān)的DAMPs，如表面鈣網(wǎng)蛋白（CRT）、高遷移率族蛋白1（HMGB1）和ATP，在細(xì)胞死亡過程中被釋放。其中，ATP發(fā)出“find-me”信號，促進(jìn)凋亡細(xì)胞的吞噬并觸發(fā)抗腫瘤免疫反應(yīng)；CRT作為“eat-me”信號，增強(qiáng)樹突狀細(xì)胞對凋亡細(xì)胞的吞噬，促進(jìn)其成熟和功能；HMGB1則激活免疫信號通路并放大免疫反應(yīng)。實驗結(jié)果表明，聯(lián)合治療組腫瘤細(xì)胞中CRT、HMGB1和ATP的表達(dá)顯著高于單藥治療組（圖3C、E、F）。這表明聯(lián)合治療不僅通過促進(jìn)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（GBM）細(xì)胞釋放DAMPs增強(qiáng)ICD，還顯著放大了免疫反應(yīng)，顯示出持久抗腫瘤免疫的潛力，為癌癥治療提供了一種有希望的方法。

圖3 細(xì)胞對Cu-His NPs的攝取以及通過協(xié)同治療增強(qiáng)ROS生成和ICD效應(yīng)。（A）2小時Cu-His NPs處理后GL261細(xì)胞的共聚焦顯微鏡圖像，細(xì)胞核用DAPI染成藍(lán)色，溶酶體用Lysotracker染成綠色，Cy5標(biāo)記的Cu-His NPs呈紅色熒光；（B）GBM細(xì)胞在24小時暴露于藥物后細(xì)胞內(nèi)GSH和GSSG水平的量化；（C）24小時治療后GBM細(xì)胞內(nèi)ATP水平的測量；（D）與藥物孵育4小時后GBM細(xì)胞中的ROS染色熒光，用DAPI染成藍(lán)色的細(xì)胞核和DCFH-DA染成綠色的ROS進(jìn)行可視化；（E）藥物處理后24小時GBM細(xì)胞釋放CRT和（F）HMGB1，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示

（3）水凝膠的體內(nèi)抗腫瘤研究

膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（GBM）的浸潤性生長往往導(dǎo)致腫瘤邊界不清晰，使得完全手術(shù)切除變得困難，并導(dǎo)致術(shù)后頻繁復(fù)發(fā)。利用 Luc-GL261 細(xì)胞成功建立了原發(fā) GBM 模型（圖 4A,B；圖 S20，支持信息）。選擇腫瘤生長相似的鼠，并在接種 Luc-GL261 細(xì)胞后的第七天進(jìn)行切除（圖 4C）。小鼠分別接受 PBS、空白 Fmoc-YD/YYK 水凝膠（空白凝膠）、CB-839 水凝膠（CB-839 凝膠）、Cu-His NPs 水凝膠（Cu-His 凝膠）、自由 CB-839 和 Cu-His NPs（自由組合）或 CB-839 和 Cu-His NPs 水凝膠（組合凝膠）的治療。通過監(jiān)測生物發(fā)光信號追蹤腫瘤復(fù)發(fā)，并在整個研究過程中記錄小鼠的體重和存活率。接受 PBS 治療的小鼠由于缺乏藥物干預(yù)，經(jīng)歷了 GBM 的快速復(fù)發(fā)和隨后的體重下降。自由組合組最初體重下降，可能是由于高劑量藥物的快速釋放。 與對照相比，CB-839 凝膠、Cu-His 凝膠和組合凝膠組體重變化最小，表明藥物負(fù)載水凝膠能有效抑制 GBM 生長，且無明顯毒副作用（圖 4D）。選擇生物發(fā)光強(qiáng)度在 10 6 和 10 7 之間的術(shù)后小鼠進(jìn)行手術(shù)，并在第 8 天通過重新監(jiān)測生物發(fā)光來確認(rèn)手術(shù)的成功。 40 每隔 7 天監(jiān)測腫瘤生物發(fā)光，直到 PBS 組的小鼠數(shù)量降至三個以下。組合凝膠組對 GBM 生長的抑制作用最為顯著，在所有監(jiān)測點中具有最低的熒光素酶強(qiáng)度（圖 4E,G）。Kaplan-Meier 生存曲線顯示，組合凝膠處理組的平均生存時間顯著延長至 48 天，超過了 PBS 組的 27 天、空白凝膠組的 28 天、CB-839 凝膠組的 33 天、Cu-His 凝膠組的 35 天和自由組合組的 30 天（圖 4F）。圖 4H 顯示了術(shù)后兩周切除和原位給藥的各種治療方法的 H&E 染色腦組織切片。 與對照組相比，接受組合凝膠治療的鼠表現(xiàn)出最小的腫瘤面積，表明其在預(yù)防腫瘤復(fù)發(fā)方面的優(yōu)越療效?？傊瑢嶒灲Y(jié)果表明，結(jié)合谷氨酰胺代謝調(diào)節(jié)與 CDT 的組合凝膠治療提供了卓越的治療效果。它有效地抑制了 GBM 腫瘤的復(fù)發(fā)，延長了小鼠的中位生存期，并在體內(nèi)誘導(dǎo)了全身抗腫瘤免疫。

圖4 腫瘤切除后正位GBM模型中不同治療方法的抗腫瘤復(fù)發(fā)療效。（A）動物研究時間線示意圖；（B）不同時間點正位Luc-GL261 GBM小鼠的T2加權(quán)MRI圖像，實驗重復(fù)了三次，腫瘤區(qū)域用橙色勾勒；（C）在第7天腫瘤植入后對小鼠進(jìn)行正位Luc-GL261細(xì)胞的手術(shù)減瘤，腫瘤區(qū)域用橙色勾勒；（D）治療后小鼠體重變化；（E）隨時間變化的腫瘤生物發(fā)光，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示；（F）不同治療方法后小鼠的生存曲線；（G）治療組中Luc-GL261腫瘤生物發(fā)光信號的時序變化（部分?jǐn)?shù)據(jù)），數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示；（H）手術(shù)切除和原位藥物治療兩周后，獲取小鼠腦切片進(jìn)行H&E染色組織學(xué)分析，實驗重復(fù)了三次

（4）組合凝膠的體內(nèi)腫瘤免疫效應(yīng)研究

ROS誘導(dǎo)的細(xì)胞焦亡與DAMPs（如HMGB1和CRT）的產(chǎn)生密切相關(guān)。圖5A顯示，在手術(shù)切除后兩周，組合凝膠組在大腦中CRT和HMGB1的熒光信號最強(qiáng)，尤其是HMGB1表達(dá)顯著上調(diào)，促進(jìn)了體內(nèi)樹突狀細(xì)胞（DC）的成熟。相比之下，CB-839凝膠組DAMPs表達(dá)較低，表明Cu-His NPs在腫瘤細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的過量ROS是增強(qiáng)細(xì)胞焦亡的主要原因。腫瘤細(xì)胞與免疫細(xì)胞的代謝競爭影響抗腫瘤免疫治療。腫瘤細(xì)胞對谷氨酰胺的高需求（“谷氨酰胺成癮”）可通過GLS1抑制劑CB-839進(jìn)行調(diào)節(jié)，從而減少腫瘤細(xì)胞對谷氨酰胺的消耗，為免疫細(xì)胞提供營養(yǎng)，增強(qiáng)其抗腫瘤功能。代謝重編程不僅抑制腫瘤細(xì)胞增殖，還影響免疫細(xì)胞功能，打破代謝循環(huán)與免疫微環(huán)境之間的通信網(wǎng)絡(luò)。CB-839是一種GLS1抑制劑，可減少腫瘤細(xì)胞對谷氨酰胺的消耗，促進(jìn)T細(xì)胞增殖和細(xì)胞因子產(chǎn)生，并影響巨噬細(xì)胞極化。流式細(xì)胞術(shù)分析顯示，CB-839凝膠組和組合凝膠組的M1型腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（TAM）比例顯著增加，M1/M2 TAM比率分別達(dá)到23.6±1.0和23.1±1.5，是PBS組（5.0±0.4）的4.6倍（圖5B-H）。這表明CB-839可誘導(dǎo)M2型TAM向M1型極化，重塑腫瘤免疫微環(huán)境。盡管組合凝膠組中M2 TAM數(shù)量變化不大，但其向更具免疫活性的表型轉(zhuǎn)變是顯著的。

組合凝膠組的活化樹突狀細(xì)胞（DC）百分比顯著高于其他組，局部復(fù)發(fā)腫瘤組織中的DC細(xì)胞計數(shù)比PBS組增加了十二倍（圖5E, I），表明免疫抑制性微環(huán)境有所改善。此外，組合凝膠處理的腫瘤中CD8?T細(xì)胞浸潤顯著增加（圖5F, J），而Cu-His凝膠組也有類似效果（圖5K）。相比之下，缺乏凝膠支架的Free Combo組效果減弱，表明組合凝膠的持續(xù)藥物釋放促進(jìn)了T細(xì)胞浸潤，重塑了腫瘤免疫微環(huán)境。

通過ELISA分析小鼠腦組織勻漿中的細(xì)胞因子，組合凝膠組表現(xiàn)出促炎細(xì)胞因子（TNF-α、IFN-γ和IL-6）水平升高，而抗炎細(xì)胞因子IL-10水平降低（圖5L-O）。TNF-α和IFN-γ的表達(dá)分別比PBS組增加了1.4倍和2.4倍，而IL-6的表達(dá)是PBS組的2.4倍。這些結(jié)果表明，組合凝膠通過增加促炎細(xì)胞因子和抑制抗炎細(xì)胞因子，調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞功能，增強(qiáng)T細(xì)胞浸潤和TAM極化，引發(fā)免疫反應(yīng)。

圖5 激活治療后使用不同藥物的抗腫瘤免疫。（A）HMGB1和CRT的免疫熒光分析；（B）流式細(xì)胞術(shù)分析小鼠腦組織中切除后兩周及原位給藥的M1型TAMs；（C）M2型TAMs；（D）M1/M2 TAMs比例；（E）成熟DCs；（F）CD8 T細(xì)胞。流式細(xì)胞術(shù)量化各組腦組織中浸潤的（G）M1型TAMs；（H）M2型TAMs；（I）成熟DCs；（J）CD8 T細(xì)胞；（K）小鼠腫瘤組織中CD8 T細(xì)胞浸潤的免疫熒光分析；ELISA量化每組小鼠腦組織勻漿中的（L）TNF-α；（M）IFN-γ；（N）IL-6；（O）IL-10