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針對(duì)上述問(wèn)題，空軍軍醫(yī)大學(xué)焦凱、牛麗娜、Niu Wen研發(fā)出一種水凝膠，用于清除細(xì)胞外RNA并釋放貝伐單抗，阻斷骨軟骨界面處的神經(jīng)血管化，從而減輕TMJ（顳下頜關(guān)節(jié)）OA疼痛和疾病進(jìn)展。這種水凝膠通過(guò)交聯(lián)醛基-苯硼酸修飾的海藻酸鈉/聚乙烯亞胺接枝的原兒茶酸（OSAP/PPCA）和貝伐單抗持續(xù)釋放納米顆粒（BGN@Be）形成，命名為OSPPB。動(dòng)態(tài)的席夫堿鍵和苯硼酸酯鍵使其具有可注射性、自愈性和pH/活性氧種雙重響應(yīng)性。OSPPB水凝膠能夠顯著抑制體外的血管生成和神經(jīng)生成。在體內(nèi)OA模型中，關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射OSPPB加速髁突的愈合過(guò)程，并通過(guò)抑制骨軟骨界面處的神經(jīng)血管化來(lái)緩解慢性疼痛。這種可注射水凝膠代表了一種治療OA及相關(guān)疼痛的有前景的技術(shù)。該文章于2025年2月6日以《Neurovascularization inhibiting dual responsive hydrogel for alleviating the progression of osteoarthritis》為題發(fā)表于《Nature communications》（DOI：10.1038/s41467-025-56727-8）。

圖1. 可注射的、自愈的、pH/ROS雙響應(yīng)的聚陽(yáng)離子水凝膠通過(guò)抑制骨軟骨界面的神經(jīng)血管形成逆轉(zhuǎn)TMJOA并緩解慢性疼痛

(1) OSAP、PPCA和BGN@Be的制備和表征

OSP-PB水凝膠的制備過(guò)程如圖2a所示。為構(gòu)建OSP-PB水凝膠，研究者通過(guò)形成動(dòng)態(tài)的硼酸酯鍵和席夫堿鍵，將醛基苯硼酸修飾的海藻酸鈉（OSAP）與聚乙烯亞胺接枝的原兒茶酸（PPCA）分子骨架交聯(lián)，同時(shí)通過(guò)配位相互作用加入BGN@Be。硼酸酯鍵是通過(guò)OSAP的硼酸基團(tuán)與PPCA的兒茶酚基團(tuán)交聯(lián)形成的。同時(shí)，PPCA的氨基與OSAP的醛基交聯(lián)形成席夫堿鍵。3-氨基苯硼酸被接枝到海藻酸鈉上，得到SAP聚合物（圖2a）。隨后，使用二氧化鈉氧化SAP的羥基，得到含有硼酸基團(tuán)和醛基的OSAP聚合物。PPCA聚合物通過(guò)酰胺化反應(yīng)合成，該反應(yīng)涉及原兒茶酸的羧基與聚乙烯亞胺中的氨基結(jié)合（圖2a）。

（2）OSPPB水凝膠的制備和表征

為了獲得OSPPB水凝膠，將BGN@Be分散的OSAP溶液和PPCA溶液通過(guò)渦旋混合，水凝膠在3秒內(nèi)形成，主要通過(guò)動(dòng)態(tài)的硼酸酯鍵和席夫堿鍵（圖2b）。ATR-FTIR光譜確認(rèn)了水凝膠的化學(xué)結(jié)構(gòu)，1431 cm-1的新峰值歸因于硼酸酯鍵，1735 cm-1的特征峰消失表明醛基參與了席夫堿反應(yīng)（圖2c）。掃描電子顯微鏡和能譜分析顯示，OSPP和OSPPB水凝膠均呈現(xiàn)均勻的多孔三維結(jié)構(gòu)，約200 μm的微孔（圖2d）。OSPPB水凝膠的表面具有BGN分散分布（圖2d中的紅色圓圈），元素分析確認(rèn)了BGN@Be的加入（圖2e）。動(dòng)態(tài)的席夫堿鍵和硼酸酯鍵賦予OSPPB水凝膠可重塑性、可注射性、自愈性和pH/ROS雙響應(yīng)性。如圖2b 1–2所示，水凝膠可通過(guò)26G針頭注射并寫(xiě)出字母“J”。如圖2b 3–6所示，水凝膠在37 °C下自愈，兩個(gè)部分合并為一個(gè)整體，無(wú)斷裂。流變測(cè)試顯示，OSPPB水凝膠的G’（354.42 ± 3.97 Pa）明顯高于OSPP水凝膠（129.46 ± 3.09 Pa），表明其更強(qiáng)的凝膠特性（圖2f）。兩種水凝膠均表現(xiàn)出非牛頓剪切變稀特性（圖2g）。這些特性使水凝膠適用于關(guān)節(jié)內(nèi)注射，且不影響其結(jié)構(gòu)。

圖2 OSPPB水凝膠的制備和表征。（a）OSPPB水凝膠的簡(jiǎn)易制備路線；（b）OSPPB水凝膠的凝膠化、可注射性和自愈特性；（c）PPCA、OSAP、OSPP和OSPPB的ATR-FTIR，顯示了導(dǎo)致凝膠化的席夫堿鍵和苯硼酸酯鍵；（d）OSPP和OSPPB的SEM，顯示了BGN@Be均勻分布在OSPPB水凝膠表面，紅圈表示BGN，比例尺=200 μm（左）和5 μm（右）；（e）OSPPB水凝膠的SEM-EDS（BGN分布區(qū)域），顯示了OSPPB水凝膠中的鈣（Ca）、磷（P）和硅（Si）元素；（f）OSPP和OSPPB水凝膠的頻率掃描和時(shí)間掃描序列，以及（g）剪切稀釋測(cè)試，G'表示儲(chǔ)能模量，G''表示損耗模量

（3）OSPPB水凝膠的pH/ROS雙重響應(yīng)性、抗氧化性和核酸清除特性

為了測(cè)試OSPPB水凝膠的pH/ROS雙重響應(yīng)性，研究者模擬了低pH（HCl）和高ROS（H₂O₂）環(huán)境（圖3a-d）。低pH或高ROS刺激使水凝膠迅速崩解為液態(tài)，且在同時(shí)刺激下，水凝膠的G’降至17.133 Pa（圖3b）。SEM顯示，單獨(dú)的ROS或pH刺激下孔隙可見(jiàn)，而在ROS + pH組合刺激下，孔隙崩塌，表明網(wǎng)絡(luò)解體（圖3c、d）。水凝膠在6天內(nèi)完全解體（圖3e），并實(shí)現(xiàn)了貝伐單抗的控制性釋放（圖3f）。席夫堿鍵和硼酸酯鍵的解離導(dǎo)致其pH/ROS雙重響應(yīng)性。抗氧化性能通過(guò)DPPH清除試驗(yàn)驗(yàn)證，低濃度提取物的清除率與維生素C相當(dāng)（圖3g）。雖然50 μg/mL組出現(xiàn)變色，但無(wú)法確定其原因，因此該實(shí)驗(yàn)僅定性確認(rèn)了抗氧化特性。水凝膠的正電荷和核酸清除特性通過(guò)電荷分析和結(jié)合實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證（圖3h、i-k）。分子動(dòng)力學(xué)模擬表明，PEI比VEGF更容易與RNA結(jié)合（圖3l）。這一特性使水凝膠能捕捉骨關(guān)節(jié)炎中的外源RNA，抑制異常神經(jīng)血管化。

圖3 OSPPB水凝膠的pH/ROS雙重響應(yīng)性、降解性、抗氧化性能及正電性能。（a-d）圖像、頻率掃描和經(jīng)PBS（pH = 5）和/或H?O?孵育后的OSPPB水凝膠的SEM（比例尺 = 200 μm）；（e）OSPP和OSPPB水凝膠在PBS中的降解；（f）S濃度變化的特征，持續(xù)14天；（g）OSPPB與DPPH共同培養(yǎng)30分鐘后的照片及相應(yīng)的統(tǒng)計(jì)結(jié)果；（h）OSPP和OSPPB水凝膠的zeta電位；（i-k）結(jié)合測(cè)試特征，顯示OSPPB與RNA的結(jié)合；（l）分子動(dòng)力學(xué)調(diào)節(jié)及其對(duì)RNA（淺藍(lán)色）、VEGF（紅色）和PEI（聚乙烯亞胺，紫色）的量化

（4）OSPPB水凝膠對(duì)體外神經(jīng)血管形成的抑制作用

OSP-PB水凝膠通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)測(cè)試了其對(duì)三叉神經(jīng)節(jié)（TG）細(xì)胞和內(nèi)皮祖細(xì)胞（EPCs）的影響。EPCs的LIVE-DEAD染色和CCK-8實(shí)驗(yàn)顯示細(xì)胞活性未受影響。EPC遷移和管腔形成實(shí)驗(yàn)表明，OSP-PB水凝膠比PPCA和BGN@Be表現(xiàn)出更強(qiáng)的抑制作用（圖4a，c，d）。TG細(xì)胞的形態(tài)和軸突生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)顯示，水凝膠處理顯著減少了樹(shù)突長(zhǎng)度和細(xì)胞相互作用（圖4b，e，f）。實(shí)驗(yàn)還表明，OSAP缺乏抑制作用，而PPCA和BGN@Be是主要的抑制成分?？傮w來(lái)看，OSP-PB水凝膠在體外有效抑制血管生成和神經(jīng)生成。

圖4 OSPPB水凝膠抑制血管生成和神經(jīng)生成。（a，b）EPCs和TG細(xì)胞的代表性顯微鏡圖像，顯示了細(xì)胞遷移、管狀形成和形態(tài)變化，處理24小時(shí)后的結(jié)果；（c，d）處理后EPCs遷移細(xì)胞數(shù)和遷移距離的定量結(jié)果；（e，f）處理后TG細(xì)胞相互作用和樹(shù)突長(zhǎng)度的定量結(jié)果

（5）OSPPB水凝膠對(duì)體內(nèi)TMJOA進(jìn)展的影響

研究者構(gòu)建了單側(cè)交叉咬合（UAC）小鼠模型，評(píng)估水凝膠對(duì)顳下頜關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎（TMJOA）的作用（圖5a）。立體顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，OSPPB組未見(jiàn)新血管生成（圖5b）。H&E和薩法蘭O/綠色染色結(jié)果顯示，OSPPB處理組髁突愈合效果較好，OARSI評(píng)分低，軟骨層厚，蛋白聚糖增多（圖5c1、c2、d-g）。銀染色顯示神經(jīng)纖維減少（圖5c3、h）。微裂紋總長(zhǎng)度在OSPPB組明顯減少（圖5c4、i）。三維重建顯示，OSPPB組關(guān)節(jié)面光滑，無(wú)侵蝕（圖5c5）。定量分析確認(rèn)OSPPB增加了骨礦密度，塞來(lái)昔布效果較輕（圖5j、k）。定量PCR結(jié)果證明OSPPB改變了骨關(guān)節(jié)炎髁突中的微環(huán)境（圖5l）。

圖5 OSPPB水凝膠可緩解小鼠的TMJOA。（a）簡(jiǎn)易制備路線，描述了設(shè)計(jì)和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果；（b）在關(guān)節(jié)注射后3周，顯示對(duì)照組（CON）和實(shí)驗(yàn)組（單側(cè)前交叉咬合，UAC）在髁突上的比較形態(tài)的示意性宏觀視圖；（c）H&E染色、SF染色、銀染色、SEM（箭頭指示微裂紋）和微CT的代表性圖像；（d-k）OARSI評(píng)分和（c）中圖像的半定量統(tǒng)計(jì)分析；（l）qRT-PCR分析髁突中神經(jīng)血管因子（Vegf、Pdgfb、Ngf、Ntn1、Ntn3、Ntn4）基因表達(dá)

（6）水凝膠的成骨潛力評(píng)估

骨軟骨界面（約50 μm厚）確保髁突軟骨與下軟骨-骨的平滑過(guò)渡，但在骨關(guān)節(jié)炎（OA）中發(fā)生顯著變化。研究者通過(guò)原子力顯微鏡和掃描電子顯微鏡-能量色散X射線光譜（SEM-EDS）檢查了其重塑（圖6）。結(jié)果顯示，控制組髁突的楊氏模量逐漸增加，而UAC組的模量不規(guī)則增大（達(dá)到17.04 MPa），OSPPB治療后恢復(fù)正常，塞來(lái)昔布組未恢復(fù)（圖6a）。UAC組和UAC + 塞來(lái)昔布組的Ca和P分布擴(kuò)展到軟骨，而OSPPB組顯示與控制組相似的分布（圖6b）?？傊?，OSPPB水凝膠能緩解TMJOA引起的微結(jié)構(gòu)和微機(jī)械變化。

圖6 OSPPB水凝膠改善了TMJOA引起的骨軟骨界面的變化。（a）AFM表征TMJ骨軟骨界面的機(jī)械性質(zhì)，分析了在CON和UAC組不同處理后3周的骨軟骨界面的力學(xué)特性；（b）骨軟骨界面的SEM-EDS顯微圖

（7）OSPPB水凝膠對(duì)體內(nèi)骨關(guān)節(jié)炎疼痛的影響

通過(guò)組織學(xué)和微結(jié)構(gòu)表征，確認(rèn)了OSPPB對(duì)TMJOA的修復(fù)作用，但其是否緩解疼痛仍未明確。由于無(wú)法直接測(cè)量小鼠疼痛，通過(guò)“類似疼痛的行為”進(jìn)行測(cè)試。EPM和OFT結(jié)果顯示，塞來(lái)昔布和OSPPB水凝膠緩解了類似焦慮的行為（圖7a，b）。機(jī)械性痛覺(jué)過(guò)敏測(cè)試顯示，塞來(lái)昔布和OSPPB水凝膠治療后撤回閾值恢復(fù)正常（圖7i）。腦電圖結(jié)果也顯示治療后低頻譜能量降低，類似控制組（圖7j）。這些結(jié)果表明，塞來(lái)昔布和OSPPB水凝膠顯著緩解了面部疼痛。

圖7 塞來(lái)昔布和OSPPB水凝膠表現(xiàn)出顯著的緩解疼痛功能。（a）CON組和UAC組小鼠在EPM測(cè)試中的代表性軌跡，以及相應(yīng)的統(tǒng)計(jì)結(jié)果（c-e）；（b）OFT中小鼠的代表性軌跡，以及相應(yīng)的統(tǒng)計(jì)結(jié)果（f-h）；（i）von Frey測(cè)試結(jié)果顯示不同處理后的鎮(zhèn)痛效果；（j）小刷子刺激前后的EEG頻譜圖

（8）OSPPB水凝膠可有效減弱骨軟骨界面的神經(jīng)血管形成

為了進(jìn)一步驗(yàn)證疼痛緩解相關(guān)的解剖變化，進(jìn)行了SYTO RNASelect綠熒光染料和E-cadherin共染色實(shí)驗(yàn)，用于識(shí)別骨軟骨界面的外源性RNA（exRNA）。圖8a、d顯示，OSPPB水凝膠處理后exRNA減少，而Celecoxib無(wú)明顯變化。前向追蹤顯示，UAC + OSPPB組三叉神經(jīng)節(jié)衍生軸突末端分布減少（圖8b、e）。免疫共聚焦顯微鏡下，PGP 9.5和CGRP結(jié)果一致（圖8b、f、g）。與UAC + Celecoxib組相比，OSPPB水凝膠處理后PECAM1陽(yáng)性血管和VEGF水平降低（圖8c、h）。此外，環(huán)氧合酶2、DCC和物質(zhì)P等疼痛介質(zhì)在OSPPB水凝膠處理后減少（圖8c、i-k）?？偟膩?lái)說(shuō)，Celecoxib在緩解疼痛方面有效，但對(duì)再生微環(huán)境的影響有限，而OSPPB水凝膠則有效緩解骨關(guān)節(jié)炎疼痛。

圖8 OSPPB水凝膠有效減弱了骨軟骨界面處的神經(jīng)血管化。（a）CON組和UAC組在不同處理后的3周，髁突骨軟骨界面上exRNA分布的代表性圖像；（b）三叉神經(jīng)節(jié)前向追蹤及神經(jīng)（PGP9.5和CGRP）、血管（CD31）和VEGF的免疫熒光染色的代表性圖像；（c）痛覺(jué)相關(guān)因子（COX2、DCC和SP）分布的代表性圖像；（d）（a）的半定量統(tǒng)計(jì)分析；（e-h）（b）的半定量統(tǒng)計(jì)分析；（i-k）（c）的半定量統(tǒng)計(jì)分析