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針對上述問題，香港城市大學徐臣杰教授和香港浸會大學Dr. Ka Loon Allen CHEUNG聚焦于微針（MN）裝置的設計優(yōu)化，特別是微針尖端微觀結構的改進。受木材木質部各向異性多孔結構啟發(fā)，采用單向冷凍鑄造技術開發(fā)了具有類似結構的各向異性多孔微針（APC-MNs）。通過調節(jié)聚合物濃度和冷凍溫度，可精確控制孔徑大小。這種微針能快速從尖端向基底吸收液體，用于淚液采樣，且在干眼癥和糖尿病大鼠模型中表現出色。同時，其從基底向尖端的快速吸收特性可實現無需設備的藥物加載，包括小分子、脂質納米顆粒和細胞。在黑色素瘤和胸膜間皮瘤小鼠模型中，通過APC-MNs遞送的γδ T細胞展現了顯著的抗腫瘤效果，為過繼細胞治療提供了新途徑。該文章于2025年03月06日以《Microneedles with an anisotropic porous microstructure facilitate the transdermal delivery of small molecules, lipid nanoparticles, and T cells》為題發(fā)表于《Matter》（DOI：10.1016/j.matt.2025.102038）。

圖1 具有各向異性多孔結構的 MN 示意圖

（1）APC-MNs的各向異性多孔結構

本研究采用冰模板法制造出類似木材木質部結構的微針，與傳統隨機孔隙多孔微針不同。研究者在PDMS微針模具中填充預聚物溶液，通過單向冷凍鑄造模擬木質部各向異性管道結構（圖2A）。具體操作是將模具鋁箔覆蓋后置于冷卻浴平臺，鋁箔朝下形成溫度梯度，使冰晶定向生長（圖2B）。后續(xù)經過冷凍凝膠化、冰晶融化和冷凍干燥，制成APC-MNs。同時，還制造了IPC-MNs、LH-MNs和SH-MNs作為對照。

通過SEM和冷凍切片成像觀察微針內部結構。APC-MNs和IPC-MNs因先冷凍，冰晶生長較大，形成相互連通的多孔結構（圖2C）；而LH-MNs因交聯在冷凍前進行，冰晶生長受限，孔隙相對孤立。APC-MNs尖端橫截面具有均勻多孔結構，而SH-MNs尖端實心（圖2D）。APC-MNs縱截面光學圖像顯示均勻垂直對齊通道，SEM圖像也證實其獨特的各向異性多孔結構，且與IPC-MNs相比，對齊通道更清晰，表明冰晶在尖端孔洞中垂直生長。這主要是因為PDMS模具和聚合物前驅體的熱導率相似。然而，當微針模具的熱導率低于或高于聚合物前驅體時，冰晶會分別向尖端壁或尖端中心生長。

圖2 APC-MN、IPC-MN、LH-MN 和 SH-MN 的結構特征。（A）木材（鳳凰木）圖像和代表性 SEM 圖像，顯示木材木質部組織的結構；（B）APC-MN 制造過程中溫度梯度下冰晶生長的圖示；（C）代表性 SEM 圖像，展示 APC-MN、IPC-MN、LH-MN 和 SH-MN 的橫截面視圖；（D）APC-MN 的縱向和橫向視圖；（E）代表性熒光圖像顯示 Cy3 染色的 APC-MN、IPC-MN 和 LH-MN 的縱向視圖

（2）APC-MN 孔徑的調節(jié)

本研究采用冰模板法制造出類似木材木質部結構的微針，通過調節(jié)聚合物濃度和冷凍溫度來控制孔徑大小。實驗中使用了不同濃度的聚合物（2.5 wt%、5 wt% 和 7.5 wt%）和不同的冷凍溫度（-196°C、-80°C和-20°C），發(fā)現孔徑隨著聚合物濃度的增加而減小，隨著冷凍溫度的降低而減小。當液體從尖端向基底被吸收時，APC-MNs可以作為生物流體采樣工具，其中APC7.5-MNs在液體提取方面表現最佳（圖3A、3B、3C）。當液體從基底向尖端被吸收時，這些微針可用于藥物加載和遞送，且在-20°C下制備的APC-MNs更適合用于治療劑的遞送（圖3D、3E、3F）。為了增強APC-MNs的機械性能，研究者在加載藥物溶液后對APC-MNs進行冷凍處理，得到APC-冷凍微針（APC-cryoMNs），其展現出足夠的壓縮力以穿透皮膚（圖3G、3H和圖3I）。這些結果表明，APC-MNs在液體吸收方面表現出雙向能力，適用于液體提取和藥物加載。

圖3 APC-MN 的體外表征。（A）示意圖顯示了 APC-MN 尖端的液體吸收情況；（B）染料 Cy3 溶液流過 APC7.5-MNs、IPC7.5-MNs、LH7.5-MNs 和 SH7.5-MNs，比例尺為 500 μm；（C）APC7.5-MNs、IPC7.5-MNs、LH7.5-MNs 和 SH7.5-MNs 的液體吸收率的量化；（D）示意圖顯示了藥物從背襯中裝入 APC-MN；（E）APC5-MN 和 IPC5-MN 尖端細胞滲透的代表性圖像，包括 hMSC、3T3 細胞、C2C12 細胞、B16 細胞、DC 和 γδT 細胞，比例尺為 300 μm；（F）量化 APC5-MN 和 IPC5-MN 尖端的細胞穿透深度；（G）APC-cryoMN 制造過程；（H）帶有手柄的脫模 APC-cryoMN 的形態(tài)；（I）cryoMN（純低溫介質）、APC2.5-cryoMN、APC5-cryoMN、APC7.5-cryoMN 以 0.5 mm/s 的速度進行壓縮試驗，虛線表示壓縮力為 5.8 N，可以穿透皮層；（J）APC5-cryoMN 處理和未處理的豬皮膚的組織學 H&E 染色圖像

（3）APC-MN 用于淚液生物標志物的提取和分析

本研究中，研究者驗證了APC-MNs在液體提取和藥物加載方面的潛力。在液體提取方面，APC5-MNs在液體吸收效率和FITC-葡聚糖回收率之間達到了平衡。研究者從APC5-MNs中提取了包括葡萄糖和干擾素-γ在內的淚液生物標志物，并與淚液試紙、人造纖維拭子和棉拭子的生物標志物回收率進行了比較。結果表明，除了棉拭子外，所有裝置回收的葡萄糖量均接近100%（圖4A）。在IFN-γ的回收中，只有APC-MNs實現了89.7% ± 13.8%的回收率，而其他工具仍有部分IFN-γ殘留（圖4B）。為了評估APC5-MNs用于眼部應用的安全性，研究者測試了其機械性能，并選擇實心水凝膠微針（SH-MNs）作為對照組。在剪切力測試中，APC5-MNs所需的剪切力顯著小于SH-MNs，表明APC5-MNs更柔軟（圖4C）。當APC5-MNs的上加載表面濕潤時，其柔軟度進一步增加。在壓縮測試中，小于2毫牛（mN）的力就足以使?jié)駶櫟腁PC5-MN尖端彎曲（圖4D）。在相同的力下，APC5-MNs被按壓在離體豬角膜上時，并未對角膜造成物理損傷，與未經處理的角膜相似，而SH-MNs則對角膜層造成了明顯的損傷（圖4E）。這些數據表明，APC5-MNs在淚液提取過程中對眼睛的風險顯著降低。接下來，研究者使用APC5-MNs從干眼癥和糖尿病大鼠模型中提取淚液（圖4F）。結果顯示，在3分鐘內，APC5-MNs從大鼠中提取的淚液量比商業(yè)淚液試紙更多，且提取相同體積淚液的速度是淚液試紙的兩倍（圖4G）。此外，從APC5-MNs提取的淚液中檢測到的IFN-γ含量高于商業(yè)淚液試紙?zhí)崛〉臏I液（圖4H）。當APC5-MNs用于從正常和糖尿病大鼠中收集淚液時，檢測到的葡萄糖水平存在顯著差異，糖尿病大鼠淚液中的葡萄糖含量顯著高于正常大鼠（圖4I）。這些結果表明，APC5-MNs能夠比商業(yè)淚液試紙?zhí)崛「嗟臏I液，并且保留更少的提取生物標志物。

圖4 用于淚液提取和后續(xù)分析的 APC5-MN。（A）從棉簽、人造絲拭子、市售撕條和 APC5-MN 中回收葡萄糖；（B）從棉簽、人造絲拭子、市售撕條和 APC5-MN 中回收 IFN-γ；（C）具有濕式稱重傳感器表面的 SH-MN、APC-MN 的剪切試驗；（D）具有濕式稱重傳感器表面的 SH-MN、APC-MN 的壓縮試驗；（E）用 APC-MN 和 SH-MN 在每針 0.05 N 的力下處理的小鼠眼的 H&E 染色圖像；（F）大鼠淚液采樣圖；（G）用 APC-MN 和淚條從干眼癥大鼠身上提取的淚液量；（H）用 APC-MN 提取的干眼癥大鼠淚液和淚條中的 IFN-γ 水平；（I）用 APC-MN 從正常和糖尿病大鼠的眼睛中收集的淚液中的葡萄糖水平

（4）APC-MNs用于γδ T細胞加載

本研究中，研究者探索了在-20°C下制備的APC5-MNs在經皮遞送γδ T細胞方面的應用潛力。通過將細胞懸液添加到APC5-MNs的基底上并進行冷凍處理，制備了加載γδ T細胞的APC5-冷凍微針（APC5-cryoMNs）。具體步驟包括將懸浮在冷凍介質中的γδ T細胞添加到APC5-MNs的基底上，冷凍介質配方為含有2.5%（體積比）DMSO和100 mM蔗糖的PBS。細胞懸液被吸收進APC5-MNs的尖端后，在裝有APC5-MNs的PDMS模具的基底上額外添加含10 wt%透明質酸（HA）或10 wt%聚乙烯醇（PVA）的PBS溶液，以解決脫模問題（圖5A）。經過在-80°C下冷凍24小時并脫模后，得到APC5-cryoMNs。當APC5-cryoMNs被置于PBS中時，微針尖端會立即從微針支架上脫離，其各向異性多孔結構清晰可見（圖5B）。經過染色后可以觀察到尖端內的γδ T細胞（圖5C），這表明在APC5-cryoMNs融化后，γδ T細胞可以保留在尖端內。

研究者使用活/死細胞染色法比較了在兩種冷凍配方中保存的γδ T細胞的活性。與傳統的含有10% DMSO和90%胎牛血清（FBS）的冷凍配方相比，含有2.5% DMSO和100 mM蔗糖的PBS配方中的細胞活性較低（49.3% ± 0.8%），但這種配方解決了與FBS相關的潛在問題，并確保了冷凍微針的機械強度（圖5D和5E）。測試結果顯示，從APC5-cryoMNs中回收的細胞活性（48.4%）與在冷凍管中使用相同配方的細胞活性相似，表明APC-MNs對細胞活性沒有負面影響（圖5F）。此外，在液氮中冷凍保存1個月后，從APC-MNs中解凍的γδ T細胞中仍有98.8% ± 1.1%表達Vδ2 T細胞受體（TCR），與原代細胞相似（圖5G）。

含有γδ T細胞的APC5-cryoMNs被儲存在液氮（-196°C）中。取出并在室溫下放置時，霜會立即形成，冰到水的相變在1分鐘內發(fā)生。使用熱成像記錄了從-40°C到40°C的溫度變化，發(fā)現當放置在支架上或貼在人手指上時，APC5-cryoMNs的尖端溫度在短時間內迅速升高。為了盡量減少冰晶對加載細胞造成的損傷，應在溫度低于-30°C時（即在29秒內）使用APC5-cryoMNs，這可以最大限度地減少細胞損傷并保持尖端的強度。

圖5 載有γδT 細胞的APC-cryoMN 的表征。（A）APC-cryoMN 的形態(tài)，其 MN 尖端由含有 2.5% DMSO + 100 mM 蔗糖的 PBS 組成，其底部由含有 10 wt% PVA 的 PBS 組成；（B）APC-cryoMN 在 PBS 中解凍后呈現各向異性多孔結構；（C）解凍后分離的載細胞 APC-cryoMN 尖端；（D）在含有 10% (v/v) DMSO 和 90% (v/v) FBS 的低溫培養(yǎng)基中冷凍保存的 γδT 細胞的活力；（E）在含有 2.5% (v/v) DMSO 和 100 mM 蔗糖的 PBS 的低溫培養(yǎng)基中冷凍保存的 γδT 細胞的活力；（F）在 APC-cryoMN 中冷凍保存的 γδT 細胞的活力；（G）在液氮中儲存 1 個月后從 APC-cryoMN 中回收的 Vδ2? 細胞的百分比

（5）Vδ2 T細胞從皮膚向胸膜腫瘤的遷移測試

本研究測試了通過APC5-cryoMNs遞送Vδ2 T細胞治療胸膜腫瘤的效果，并與靜脈注射進行了對比。在MSTO-luc荷瘤小鼠模型中，研究者在腫瘤注射后的第3天使用加載了Vδ2 T細胞的APC5-cryoMNs進行治療，并設置PBS靜脈注射和Vδ2 T細胞靜脈注射作為對照組。結果發(fā)現，APC5-cryoMN處理組在皮膚中顯示出與Vδ2 TCR信號對應的綠色熒光信號，表明Vδ2 T細胞能夠進入皮膚（圖6B）。進一步分析顯示，在靜脈注射組和APC5-cryoMN組中，注射后第1天在脾臟和肺中均檢測到CD3?Vδ2?細胞，但APC5-cryoMN組在肺和肝臟中的CD3?Vδ2?細胞數量變化趨勢與靜脈注射組不同，且在腫瘤中，兩組的CD3?Vδ2?細胞數量從第1天到第4天均增加（圖6C）。這些結果表明，通過APC5-cryoMNs遞送的Vδ2 T細胞能夠從皮膚遷移到內臟器官腫瘤。

在治療效果方面，研究者比較了通過靜脈注射和APC5-cryoMNs遞送Vδ2 T細胞的療效。在第3天和/或第6天給予一劑或兩劑Vδ2 T細胞后，通過檢測腫瘤中熒光素酶活性的成像結果顯示，單劑量的Vδ2 T細胞通過靜脈注射或APC5-cryoMNs遞送后，腫瘤生長分別減少了約16.4%和14.7%（圖6D）。兩劑Vδ2 T細胞通過靜脈注射或APC5-cryoMNs遞送后，腫瘤生長分別減少了約58.6%和62%，而PBS對照組未觀察到類似的減少。此外，通過APC5-cryoMNs遞送Vδ2 T細胞時，小鼠的生存期略有增加（2天）（圖6E）。這些結果表明，通過皮膚遞送的Vδ2 T細胞能夠有效抑制內臟器官腫瘤的生長，且APC5-cryoMNs遞送的療效與全身遞送Vδ2 T細胞治療間皮瘤的效果相似。

圖6 APC5-cryoMN 介導的遞送增強間皮瘤小鼠的 γδT 細胞浸潤。（A）APC5-cryoMN 應用于小鼠后部皮膚；（B）皮膚中 CD3?Vδ2? 細胞的代表性免疫染色圖像，比例尺為 200 μm；（C）流式細胞術分析脾臟、肺臟、腫瘤和肝臟中 CD3?Vδ2? 細胞的頻率；（D）通過比較不同治療組中隨時間推移的熒光素酶活性與 MSTO-luc 腫瘤注射后第 2 天的活性來測量腫瘤生長情況，每組包含 3-4 只小鼠；（E）Kaplan-Meier 圖顯示不同治療組 MSTO-luc 小鼠隨時間的生存情況