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針對上述問題，四川醫(yī)學(xué)科學(xué)院張瑞帆團隊研究開發(fā)了一種針對SP/NK1R通路的新型靶向藥物，通過絲素蛋白（SF）負(fù)載NK1R拮抗劑（CP99,994）構(gòu)建納米顆粒藥物遞送系統(tǒng)，并結(jié)合水凝膠用于眼部給藥。結(jié)果表明，SF@CP@Gel是一種安全有效的抗炎修復(fù)藥物，可調(diào)節(jié)Th17/Treg平衡，修復(fù)角結(jié)膜損傷，并顯著緩解實驗性DED的癥狀和體征。盡管已有研究探索納米顆粒負(fù)載水凝膠在眼表給藥中的應(yīng)用，但本研究首次將SF納米顆粒與NK1R拮抗劑相結(jié)合，構(gòu)建長效藥物遞送系統(tǒng)，不僅調(diào)節(jié)Th17/Treg平衡，還促進眼表組織修復(fù)，為DED治療提供了新的解決方案。該文章于2025年02月22日以《A Silk Fibroin Nanoparticle Hydrogel Loaded With NK1R Antagonist Has Synergistic Anti-Inflammatory and Reparative Effects on Dry Eye Disease》為題發(fā)表于《Advanced Science》上。（DOI: org/10.1002/advs.202404835）。

圖1. SF@CP@Gel的研究示意圖

（1）載藥SF凝膠的制備和表征

首先，對SF@CP納米系統(tǒng)進行表征，以評估其穩(wěn)定的載藥和釋藥性能。動態(tài)光散射（DLS）測得SF@CP水合直徑為122 nm（圖2A），透射電子顯微鏡（TEM）觀察到其球形結(jié)構(gòu)，尺寸約120 nm（圖2B），與DLS結(jié)果一致。穩(wěn)定性測試表明SF@CP在7天內(nèi)保持145 nm，顯示良好的體內(nèi)循環(huán)與緩釋能力（圖2C）。電位滴定和紫外光譜（UV）分析證實CP成功負(fù)載（圖2D,E），載藥率和包封率分別為71.7%和15.2%（圖2F）。SF@CP@Gel的物理化學(xué)性質(zhì)進一步表征。掃描電鏡（SEM）顯示SF@CP@Gel呈現(xiàn)3D網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)（圖2G,H），表明水凝膠成功負(fù)載CP。物理圖像顯示其透明均勻，無明顯顆粒沉淀（圖2I）。核磁共振（NMR）分析表明SF@CP@Gel形成π–π相互作用（圖2J）。流變學(xué)測試（圖2K）表明凝膠主要呈液態(tài)，隨剪切應(yīng)變增加，儲能模量（G′）下降，且無“凝膠點”，說明其流動性較強。凝膠在PBS中快速吸水膨脹，最大膨脹率達(dá)800%（圖2M）。釋藥曲線（圖2N）顯示，6 h釋放60%，12 h達(dá)平衡（80%），并可維持25 h。結(jié)果表明，SF@CP@Gel具備穩(wěn)定載藥、控制釋放及良好流變特性，有望用于藥物遞送。

圖2. 載藥納米系統(tǒng)的特征及載藥SF水凝膠的物理化學(xué)性質(zhì)。（A）SF@CP的DLS直徑；（B）SF@CP的TEM圖像；（C）SF@CP在7天內(nèi)的尺寸穩(wěn)定性；（D）SF、CP和SF@CP的Zeta電位；（E）SF、CP和SF@CP的紫外光譜分析；（F）SF@CP的載藥效率及CP的包封效率；（G）凝膠的SEM圖像；（H）凝膠的SEM圖像；（I）SF@CP@Gel的實物圖像；（J）Gel、SF@Gel和SF@CP@Gel的質(zhì)子核磁共振（1H-NMR）譜圖；（K）凝膠、SF@Gel和SF@CP@Gel的流變性能測試；取15 mL樣品，使用微紅外流變儀進行振蕩速率掃描（25 °C ± 0.2 °C，γ = 0%–1000%，f = 1 Hz）；（L）凝膠、SF@Gel和SF@CP@Gel的粘度-時間關(guān)系曲線；固定溫度25 °C，應(yīng)變γ = 1%，頻率f = 1 Hz；（M）凝膠、SF@Gel和SF@CP@Gel的溶脹比；（N）藥物釋放行為

（2）載藥 SF 水凝膠的體外細(xì)胞毒性

新藥開發(fā)的首要條件是無害或低細(xì)胞毒性。該團隊使用CCK-8實驗評估了載藥材料的生物相容性，并檢測了人角膜上皮細(xì)胞（HCECs）的活性。如圖3A所示，空白組與SF組的光密度（OD）值幾乎相同，表明SF不會影響細(xì)胞活力。此外，進一步研究了凝膠材料對細(xì)胞活力的影響。結(jié)果顯示，空白組和凝膠組的細(xì)胞隨時間穩(wěn)步增殖，且不同濃度SF@CP@Gel浸提液處理的細(xì)胞活力均未顯著下降，與空白組相比無明顯差異。這表明納米載體和凝膠材料均具有良好的安全性。

圖3. 不同載藥生物材料的體外細(xì)胞毒性、抗氧化和細(xì)胞遷移測試。（A）細(xì)胞活力評價；（B）DCFH-DA標(biāo)記的細(xì)胞ROS圖像；（C）使用DCFH-DA監(jiān)測ROS生成的半定量分析；（D）使用流式細(xì)胞儀監(jiān)測ROS的生成；（E）使用流式細(xì)胞儀監(jiān)測ROS生成的半定量分析；（F）細(xì)胞劃痕實驗；（G）劃痕面積統(tǒng)計

（3）有效的抗氧化和促細(xì)胞遷移能力

該研究利用生長良好的原代HCECs評估了不同藥物亞組的抗氧化能力和遷移能力。首先，通過檢測活性氧（ROS）含量評估細(xì)胞氧化損傷程度（圖3B）。二氯熒光素（DCF）探針與ROS結(jié)合后，在共聚焦顯微鏡下呈現(xiàn)綠色熒光，熒光強度越高，ROS含量越高，細(xì)胞核則以DAPI標(biāo)記。從共聚焦圖像可見，CP、SF@CP和SF@CP@Gel（CP濃度5 μg/mL）處理組的ROS熒光水平較對照組顯著降低，統(tǒng)計結(jié)果見圖3C。其中，SF@CP@Gel組ROS含量顯著低于其他兩組（p < 0.001）。此外，流式細(xì)胞術(shù)通過FITC通道檢測綠色熒光，以定量評估細(xì)胞氧化損傷程度（圖3D），其半定量結(jié)果見圖3E。結(jié)果表明，三種處理組的ROS水平均顯著低于對照組，且雖無顯著性差異，但呈下降趨勢。通過劃痕實驗進一步探討SF凝膠載藥對細(xì)胞遷移能力的影響（圖3F），并在12 h和24 h時分別進行定量分析（圖3G,H）。結(jié)果顯示，12 h時各處理組細(xì)胞遷移率均有所增加，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義；24 h時，所有處理組細(xì)胞遷移率均顯著高于對照組，且三組間無顯著性差異。

（4）治療效果的體內(nèi)評估

實驗小鼠藥物給藥時間表見圖4A。通過臨床指標(biāo)（如淚液分泌量和角膜熒光素染色（CFS））評估CP組、SF@CP和SF@CP@Gel治療組在干眼癥小鼠模型中的療效。圖4B顯示，正常組和模型組的淚液分泌量分別為0.62 mm和0.25 mm，表明干眼癥模型成功構(gòu)建。治療14天后，SF@CP和SF@CP@Gel組的棉線長度接近0.39 mm。通過CFS評估角膜上皮損傷，圖4C顯示角膜上皮缺損為黃色綠色區(qū)域。14天后，SF@CP@Gel組CFS評分比DED組降低93.2%，優(yōu)于其他組。ELISA檢測Treg細(xì)胞功能，圖4D顯示DED模型組與正常組在IL-10、IL-35和TGF-β1水平上差異顯著（p < 0.0001）。SF@CP@Gel組的IL-10水平是DED組的5.01倍（p < 0.001），且IL-35和TGF-β1水平顯著上調(diào)。HE染色分析顯示藥物在體內(nèi)具有生物安全性。

圖4. 不同給藥系統(tǒng)的給藥時間線及體內(nèi)治療效果。（A）治療實驗時間線；（B）對照組、DED模型組、CP治療組、SF@CP治療組和SF@CP@Gel治療組的淚液分泌情況及統(tǒng)計分析；（C）不同組別的角膜熒光素染色評分（CFS）及統(tǒng)計分析：對照組、DED模型組、CP治療組、SF@CP治療組和SF@CP@Gel治療組；（D）用ELISA法測定結(jié)膜組織中IL-10、IL-35和TGF-β1的含量

（5）治療效果的組織學(xué)評估

為評估藥物治療后干眼小鼠的損傷組織恢復(fù)情況，收集眼球、角膜和結(jié)膜樣本進行組織學(xué)檢查。HE染色（圖5A）顯示，干眼模型組角膜上皮細(xì)胞排列紊亂、數(shù)量增多，基質(zhì)層膠原纖維腫脹且與上皮層交織，結(jié)膜嚴(yán)重?fù)p傷。治療后，各治療組角膜上皮細(xì)胞數(shù)量減少，膠原纖維排列逐漸整齊，結(jié)膜細(xì)胞排列恢復(fù)。SF@CP@Gel組角膜形態(tài)接近正常組，效果優(yōu)于CP和SF@CP組。Masson染色（圖5B）顯示，模型組角膜膠原纖維交織腫脹，治療組膠原纖維排列恢復(fù)，腫脹消失。TUNEL實驗（圖5C）顯示，模型組角膜上皮細(xì)胞凋亡顯著高于正常組（p < 0.0001）。治療后，CP、SF@CP和SF@CP@Gel組凋亡細(xì)胞百分比分別減少26.29%、63.98%和87.43%，表明SF@CP@Gel具有顯著的抗氧化和組織修復(fù)效果。

圖5.不同藥物遞送系統(tǒng)的組織學(xué)分析。（A）角膜的HE染色；（B）角膜的Masson染色；（C）角膜的TUNEL染色和定量

（6）SF@CP@Gel 調(diào)控 SP/NK1R 信號通路

為確認(rèn)SF@CP@Gel的療效，對治療前后角膜和結(jié)膜中的SP和NK1R進行DAPI復(fù)合染色（藍(lán)色為陰性，黃色為陽性），并用熒光顯微鏡觀察（圖6）。通過ImageJ定量SP（圖6A）和NK1R（圖6B）的綜合光密度（IOD）。正常組與模型組的SP和NK1R IOD差異顯著（均p < 0.0001），證實干眼模型成功構(gòu)建。圖6顯示，各治療組與模型組相比，SP和NK1R在角膜和結(jié)膜中的下調(diào)均顯著。SF@CP@Gel治療后，干眼小鼠角膜中SP的IOD減少43.74%（p < 0.0001），結(jié)膜中減少48.30%（p < 0.0001）。角膜中NK1R的IOD減少46.12%（p < 0.0001），結(jié)膜中減少44.00%（p < 0.0001）。CP和SF@CP治療也顯著降低了SP和NK1R水平，但SF@CP@Gel效果最佳，使其表達(dá)接近正常組水平。

圖6. 角膜和結(jié)膜中 SP 和 NK1R 表達(dá)的免疫組織化學(xué)分析。（A）角膜的SP免疫組化染色和定量統(tǒng)計；（B）角膜的NK1R免疫組化染色和定量統(tǒng)計

（7）SF@CP@Gel能有效調(diào)節(jié)Th17/Treg細(xì)胞平衡

通過流式細(xì)胞術(shù)分析了角膜、結(jié)膜和淋巴結(jié)中Th17和Treg細(xì)胞的百分比（圖7）。所有治療組中，角膜、結(jié)膜和淋巴結(jié)中CD4[+]IL-17[+] T細(xì)胞的頻率顯著低于干眼小鼠模型（p < 0.0001）。SF@CP@Gel在DED模型中的治療效果最佳，角膜、結(jié)膜和淋巴結(jié)中分別減少了73.56%、64.01%和55.94%。在角膜和結(jié)膜中（圖 7A，B），SF@CP@Gel組的CD4[+] IL-17[+] T細(xì)胞頻率顯著低于CP和SF@CP治療組（p < 0.001）。在淋巴結(jié)中（圖 7C），SF@CP@Gel組Th17細(xì)胞的減少也顯著高于CP組（p < 0.01）。Treg細(xì)胞分析顯示，SF@CP@Gel治療后，角膜、結(jié)膜和淋巴結(jié)中的CD25[+] Foxp3[+] T細(xì)胞頻率顯著增加。在結(jié)膜中，SF@CP@Gel組Treg細(xì)胞的上調(diào)顯著高于CP和SF@CP組（p < 0.0001）。盡管角膜和淋巴結(jié)中三組間無顯著差異，但仍顯示上調(diào)趨勢。通過實時PCR分析了IL-17A和Foxp3轉(zhuǎn)錄因子的mRNA表達(dá)（圖7D，E）。角膜中，SF@CP@Gel組IL-17A mRNA的表達(dá)顯著低于其他組（p < 0.0001）。結(jié)膜中，SF@CP@Gel治療組IL-17A mRNA表達(dá)比DED模型組低55.04%（p < 0.001）。在角膜和結(jié)膜中，SF@CP@Gel組Foxp3 mRNA的表達(dá)顯著高于其他組，表現(xiàn)出強烈的Treg細(xì)胞功能標(biāo)志Foxp3的上調(diào)。

圖7. 流式細(xì)胞術(shù)分析Th17和Treg細(xì)胞，以及PCR分析不同組織中的IL-17A和Foxp3。（A）在DED誘導(dǎo)后第14天，流式細(xì)胞術(shù)評估角膜中IL-17A?Th17和Foxp3?Treg細(xì)胞的頻率；（B）流式細(xì)胞術(shù)檢測小鼠結(jié)膜中IL-17A?Th17和Foxp3?Treg細(xì)胞的頻率；（C）流式細(xì)胞術(shù)檢測小鼠淋巴結(jié)中IL-17A?Th17和Foxp3?Treg細(xì)胞的頻率；（D）角膜中IL-17A和Foxp3的RNA水平；（E）結(jié)膜中IL-17A和Foxp3的RNA水平