IF：18 《Bioact Mater》中國海洋大學(xué)韓璐：植物啟發(fā)的可見光驅(qū)動(dòng)生物能量水凝膠用于慢性傷口愈合
專欄：學(xué)術(shù)前沿
發(fā)布日期：2025-02-08
作者：
慢性生物能量失衡和高血糖引起的炎癥是延遲糖尿病傷口愈合的障礙。糖尿病創(chuàng)面愈合過程中，由于高血糖引起的病理微環(huán)境伴隨氧化應(yīng)激和生物能量失衡，導(dǎo)致炎癥延長，血管生成不足，最終導(dǎo)致愈合延遲。在高血糖狀態(tài)下，細(xì)胞的耗氧量和能量需求升高，傷口部位有缺陷的血管阻礙氧氣輸送，加劇了缺氧環(huán)境。缺氧和高血糖會(huì)誘導(dǎo)線粒體活性氧（ROS）的過量產(chǎn)生，從而超過細(xì)胞的自我抗氧化防御，導(dǎo)致氧化應(yīng)激狀態(tài)，從而引發(fā)炎癥并破壞線粒體氧化還原穩(wěn)態(tài)。
保護(hù)線粒體降低氧化應(yīng)激水平，調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝平衡，從而減少炎癥反應(yīng)，也可以調(diào)節(jié)病理微環(huán)境，在逆轉(zhuǎn)慢性糖尿病傷口中發(fā)揮重要作用。因此，探索一種保護(hù)線粒體免受損傷并糾正代謝紊亂的綜合治療模式，將從根本上加速慢性傷口的愈合進(jìn)程。然而，由于能量和代謝物的傳遞不理想，通過生物材料直接調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)代謝仍然具有挑戰(zhàn)性。
來自植物葉片的天然類囊體膜在光合作用過程中表現(xiàn)出良好的氧合和代謝物的生成，在治療糖尿病傷口方面具有很大的潛力。但基于類囊體的光合作用納米結(jié)構(gòu)的策略尚未得到深入研究，限制了它們在生物醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用。
針對上述問題，中國海洋大學(xué)韓璐教授團(tuán)隊(duì)將菠菜源性TKM包覆聚單寧酸納米顆粒（PTA NPs），然后將PTKM NPs加入氧化透明質(zhì)酸（OHA）和氨基修飾明膠（Gel-NH2）基質(zhì)中，形成光驅(qū)動(dòng)生物能釋氧水凝膠（命名為PTKM@HG）（方案1a）。在紅光照射下，PTKM NPs通過光合作用表現(xiàn)出產(chǎn)氧和H2O2消耗能力，以恢復(fù)缺氧誘導(dǎo)的線粒體功能障礙。同時(shí)，PTKM NPs通過調(diào)節(jié)亮氨酸激活的mTOR信號通路，產(chǎn)生外源性ATP和NADPH，增強(qiáng)線粒體功能，促進(jìn)細(xì)胞合成代謝。此外，PTKM NPs繼承了多酚的抗氧化和抗炎能力。最后，紅光照射PTKM@HG水凝膠增強(qiáng)了角質(zhì)形成細(xì)胞的存活和遷移，從而加速了糖尿病創(chuàng)面的血管生成和再上皮化。這是一種有希望加速慢性糖尿病患者傷口愈合過程的方法。該文章于2024年08月10日以《Plant-inspired visible-light-driven bioenergetic hydrogels for chronic wound healing》為題發(fā)表于《Bioactive Materials》（DOI：10.1016/j.bioactmat.2024.08.003）。
可見光驅(qū)動(dòng)的生物能量和氧釋放水凝膠在光照射下加速傷口愈合的示意圖
（1）PTKM NPs的制備與表征 通過差速離心從菠菜中收獲類囊體。經(jīng)超離心、洗滌、超聲處理得到TKM（2.45 mg/mL）。從透射電子顯微鏡（TEM）圖像中可以看出，提取的TKM呈現(xiàn)出完整的層狀結(jié)構(gòu)（圖1a）。PTA NPs顯示出單分散的球形結(jié)構(gòu)，直徑為245 nm，表面粗糙（圖1b）。TEM觀察發(fā)現(xiàn)PTKM NPs具有明顯的核殼結(jié)構(gòu)（圖1c和d）。PTKM NPs的zeta電位與原TKM相似（圖1e），證實(shí)了PTA NPs被TKM包封。圖1f為PTKM NPs的x射線光電子能譜。圖1g為PTKM NPs的高分辨率O1s峰普圖。在133.15 eV下檢測到P2p表明存在TKM（圖1h）。利用（BN-PAGE）分析了PTKM NPs的膜蛋白，證實(shí)了PTKM NPs上存在特定的光合活性相關(guān)膜蛋白，包括光合系統(tǒng)I （PS-I）、光合系統(tǒng)II （PS-II）和光收集復(fù)合物II (LHC-II)（圖1i）。此外，PTKM NPs的紫外-可見（UV-Vis）光譜中出現(xiàn)了665 nm左右的吸附峰，而PTA NPs中沒有（圖1j），這是TKM葉綠素的典型吸收?？傊?，這些結(jié)果證明了利用PS-I/PS-II系統(tǒng)成功制備了用于光合作用的PTKM NPs。 用溶解氧儀在陽光和660 nm LED照射下評估其氧化能力。PTKM NPs在陽光照射下可以持續(xù)產(chǎn)氧，在130s后氧濃度達(dá)到0.69 mg/L以上（圖1k）。LED照射12 min后，氧濃度超過1.0 mg/L（圖11）。此外，PTKM NPs具有過氧化氫酶活性，可以在660 nm LED照射下催化過氧化氫（H2O2）產(chǎn)生氧氣（O2），如圖1m所示，添加H2O2后的PTKM NPs溶液O2含量明顯升高，這在緩解糖尿病創(chuàng)面缺氧中起關(guān)鍵作用。使用WST-8法評估光照條件下PTKM NPs產(chǎn)生NADPH的能力（圖1n）。當(dāng)濃度為125 μg/mL時(shí)，PTKM NPs形成NADPH的倍數(shù)變化率為199.60%。相比之下，在黑暗條件下觀察到NADPH的低效產(chǎn)生。這些結(jié)果證實(shí)，PTKM NPs保留了TKM的天然結(jié)構(gòu)和光合性能，并作為能量供應(yīng)商促進(jìn)和調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長（圖1o）。此外，PTKM NPs具有繼承自PTA NPs的優(yōu)異的抗氧化能力。孵育90 min后，超過70%的DPPH自由基被PTA NPs消除（圖1p）。綜上所述，這些結(jié)果表明PTKM NPs可以作為一個(gè)具有光合氧/能量演化和自由基清除能力的一體化納米平臺，在光照下調(diào)節(jié)糖尿病傷口的代謝紊亂。
圖1 PTKM NPs的制備與表征。（a）類囊體膜（TKM），（b）PTA NPs，（c）和（d）PTKM NPs的TEM圖像。箭頭（藍(lán)色）表示類囊體膜。（e）TKM、PTA和PTKM NPs的Zeta電位。（f）PTKM NPs的XPS光譜。（g）PTKM NPs的O1s高分辨率XPS光譜。（h）PTKM NPs的P2p高分辨率XPS光譜。（i）TKM和PTKM NPs的藍(lán)色天然聚丙烯酰胺凝膠（BN-PAGE）電泳。（j）TKM、PTA和PTKM NPs的紫外-可見吸收光譜。（k）PTKM NPs在陽光下的光合作用能力。（l）660 nm LED照射下PTKM NPs的光合作用能力。（m）不同組在660 nm LED照射下的CAT-like活性。（n）在有和沒有LED照射的情況下PTKM NPs產(chǎn)生NADPH的能力。（o）PTKM參與光合作用的機(jī)理示意圖。（p）不同納米材料對DPPH的清除效率
（2）PTKM NPs的細(xì)胞相容性和溶血評價(jià)和高ROS、高葡萄糖和缺氧條件下的細(xì)胞保護(hù)能力
用人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）評估PTKM NPs的細(xì)胞相容性。如圖2a所示，CCK-8檢測顯示，即使高濃度的PTKM NPs（200 μg/ mL）也不影響HUVECs的細(xì)胞增殖和存活率。此外，與不同納米材料（TKM、PTA和PTKM NPs）共培養(yǎng)6小時(shí)后，各組細(xì)胞活力無差異（圖2b），LED照射的毒性可忽略不計(jì)。此外，PTKM NPs顯示出低溶血率（5%），表明具有良好的血液相容性（圖2c）。接下來，使用異硫氰酸熒光素（FITC）標(biāo)記的PTKM NPs （PTKMFITC）監(jiān)測HUVECs的攝取效率和細(xì)胞內(nèi)分布。如圖2d-e所示，將孵育時(shí)間從1小時(shí)增加到4小時(shí)，熒光強(qiáng)度顯著增加，表明PTKM NPs可以被HUVECs內(nèi)吞，在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮其功能。
為了探究PTKM NPs在體內(nèi)病理環(huán)境的高ROS、高葡萄糖和低氧條件下對細(xì)胞的保護(hù)作用，用HUVECs進(jìn)行了體外實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)中，HUVECs先與125 μg/mL的PTKM NPs共孵育，隨后用50μM H2O2處理，通過CLSM和流式細(xì)胞術(shù)檢測DCFH-DA探針的熒光信號來評估PTKM NPs清除ROS的能力（圖2f）。結(jié)果顯示，與H2O2處理組相比，經(jīng)TKM和LED處理的組別中細(xì)胞內(nèi)ROS水平有所下降，這歸因于TKM在光照射下的類CAT活性。PTA和PTKM NPs通過其還原性酚基團(tuán)有效降低了細(xì)胞內(nèi)ROS水平（圖2g）。此外，利用RDPP探針評估HUVECs中的缺氧情況（圖2h和圖i），發(fā)現(xiàn)TKM和PTKM NPs在LED照射下能顯著緩解缺氧。在糖尿病傷口中，過量的ROS由高血糖引發(fā)，導(dǎo)致線粒體功能障礙，進(jìn)而阻礙傷口愈合。為了探究PTKM NPs在高糖和氧化應(yīng)激下對HUVECs線粒體動(dòng)力學(xué)的影響，用H2O2（50μM）和30 mM葡萄糖處理HUVECs 12小時(shí)，然后加入PTKM NPs。利用MitoTracker Red CMXRos紅色熒光染料檢測線粒體膜電位（圖2j）。結(jié)果顯示，在高糖和H2O2環(huán)境下，HUVECs的線粒體膜電位降低，而經(jīng)TKM + LED和PTKM NPs + LED處理后，線粒體膜電位有所恢復(fù)。這表明PTKM NPs能有效產(chǎn)生氧氣和清除ROS，維持線粒體功能。因此，即使在高葡萄糖、高ROS和缺氧條件下，PTKM NPs也能保護(hù)HUVECs并維持其生存能力（圖2k）。
圖2 PTKM NPs對高ROS、低氧和高糖條件下培養(yǎng)的HUVECs的保護(hù)能力，以模擬體內(nèi)微環(huán)境。（a）和（b）不同濃度PTKM NPs和不同納米材料共孵育6 h后HUVECs的活力。LED照射時(shí)間為30 min。（c）TKM、PTA和PTKM NPs的溶血率（37℃，孵育時(shí)間：4 h）。（d）HUVECs用FITC標(biāo)記的PTKM NPs的細(xì)胞攝取。（e）不同時(shí)間PTKM NPs攝取的平均熒光強(qiáng)度（MFI）分析。（f）不同納米顆粒在660 nm（20 W）照射30 min的條件下，50 μM H2O2刺激HUVECs細(xì)胞內(nèi)ROS的熒光圖像和流式細(xì)胞術(shù)。（g）ROS的平均熒光強(qiáng)度（MFI）分析。（h）用RDPP檢測不同納米顆粒培養(yǎng)HUVECs在高ROS和低氧條件下的胞內(nèi)產(chǎn)氧量。（i）(h)中熒光信號的MFI分析。（j）在高糖和ROS條件下，不同納米顆粒孵育的HUVECs中線粒體電位的Mito-Tracker Red CMXRos圖像。（k）不同納米顆粒在高葡萄糖、高活性氧和缺氧條件下培養(yǎng)HUVECs的活/死染
(3) PTKM NPs調(diào)節(jié)體外細(xì)胞代謝
除了氧氣生成外，PTKM NPs還可以通過提供足夠的ATP和NADPH來增強(qiáng)細(xì)胞代謝。如圖3a和b所示，在LED照射（660 nm, 20 W, 1 h）下，PTKM NPs存在時(shí)，huvec細(xì)胞內(nèi)ATP和NADPH濃度升高，且產(chǎn)量水平隨著PTKM NPs濃度的增加而增加。然而，在沒有LED照射的黑暗條件下，PTKM NPs對NADPH和ATP水平?jīng)]有明顯影響。這一結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了PTKM NPs在LED照射下可以通過光合作用提供外源能量（ATP和NADPH）來保護(hù)線粒體，促進(jìn)細(xì)胞高效合成代謝（圖3c）。為了全面了解PTKM NPs對細(xì)胞代謝的調(diào)節(jié)作用，我們比較了不同處理組HUVECs中代謝物的變化。在高糖、低氧和高ROS條件下，將HUVECs與PTKM NPs共孵育為PTKM NPs處理組。以高糖條件下培養(yǎng)的HUVECs為陽性對照。以正常葡萄糖條件下培養(yǎng)的HUVECs為陰性對照。篩選PTKM與對照組之間的差異代謝物，共鑒定出2236種代謝物，其中上調(diào)191種，下調(diào)194種（圖3d-f）。差異代謝物主要集中在氨基酸、核苷酸及其衍生物和有機(jī)酸領(lǐng)域。通過構(gòu)建差異代謝物相關(guān)網(wǎng)絡(luò)，發(fā)現(xiàn)50種差異代謝物形成了復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)，顯示出PTKM NPs處理后細(xì)胞內(nèi)代謝物的顯著變化（圖3g）。L-亮氨酸（Lleucine）在網(wǎng)絡(luò)中扮演著關(guān)鍵角色，可能在調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝中起核心作用。特別是在PTKM組中，氨基酸及其代謝物（如谷胱甘肽和L-亮氨酸）和核苷酸及其代謝物的表達(dá)顯著上調(diào)（圖3h）。此外，PTKM NPs處理組中L-亮氨酸和谷胱甘肽的增加得到了小提琴圖的證實(shí)（圖3i和j）。根據(jù)KEGG數(shù)據(jù)庫的分析，L-亮氨酸與mTOR信號通路有直接聯(lián)系（圖3k）。L-亮氨酸是激活mTORC1信號通路的關(guān)鍵氨基酸，能夠促進(jìn)線粒體的生成和氧化代謝，維持細(xì)胞的正常生理活動(dòng)。綜合來看，PTKM NPs能在高糖、低氧和高ROS條件下保護(hù)HUVECs的線粒體功能，主要得益于：一是在光照下，PTKM NPs能持續(xù)釋放氧氣，改善缺氧環(huán)境，減少線粒體ROS的產(chǎn)生；二是PTKM NPs含有的多酚基團(tuán)能夠清除過量的ROS，防止ROS引起的質(zhì)子泄漏和線粒體膜電位（MMP）的變化，保護(hù)線粒體功能；三是光照后的PTKM NPs提供外源能量，促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的合成代謝，激活mTOR信號通路，增強(qiáng)線粒體的生物合成和功能。
圖3 PTKM NPs促進(jìn)細(xì)胞代謝。（a）和（b）分別用NADPH和ATP測定試劑盒測定HUVECs細(xì)胞內(nèi)NADPH和ATP水平。（c）660 nm LED照射下PTKM調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝的機(jī)制示意圖。（d）、(e)、(f)不同對照組差異代謝物火山圖。（g）PTKM NPs與對照比較的差異代謝物相關(guān)網(wǎng)絡(luò)圖。（h）KEGG通路差異代謝物聚類熱圖。（i）和（j）三組L-亮氨酸和谷胱甘肽的差異代謝物小提琴圖。（k）PTKM NPs與對照比較中差異代謝物調(diào)控網(wǎng)絡(luò)示意圖
（4）PTKM NPs調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng) 為研究了PTKM NPs的抗炎能力，用脂多糖（LPS）誘導(dǎo)M1巨噬細(xì)胞活化，然后與TKM、PTA和PTKM NPs共培養(yǎng)4小時(shí)。通過顯微鏡染色評估巨噬細(xì)胞形態(tài)，如圖4a所示，PTA和PTKM nps處理組巨噬細(xì)胞保持圓形和致密的形態(tài)，而lps誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞呈扁平狀，有多個(gè)偽足。RAW264.7細(xì)胞面積的定量也證實(shí)了這一點(diǎn)（圖4b）。進(jìn)一步用免疫熒光染色CD86 （M1標(biāo)記物）和CD206 （M2標(biāo)記物）觀察巨噬細(xì)胞的極化狀態(tài)。如圖4c和d所示，PTA和PTKM nps處理組的CD86+信號水平最低。而PTKM nps處理組CD206標(biāo)記的M2巨噬細(xì)胞數(shù)量高于對照組（圖4e）。定量數(shù)據(jù)顯示，PTKM NPs組CD206標(biāo)記的M2巨噬細(xì)胞百分比高于空白組（圖4f）。這些結(jié)果表明，PTKM NPs可以抑制M1極化并誘導(dǎo)M2極化，而PTA NPs只能抑制M1極化。我們還注意到，PTKM NPs將促炎M1巨噬細(xì)胞重編程為抗炎M2巨噬細(xì)胞與LED暴露無關(guān)，流式細(xì)胞術(shù)數(shù)據(jù)進(jìn)一步證實(shí)了熒光趨勢（圖4g）。PTKM NPs光合作用提供的O2可以阻止巨噬細(xì)胞M1表型轉(zhuǎn)換，阻止其過度表達(dá)缺氧誘導(dǎo)因子-1α (HIF-1α)，從而促進(jìn)巨噬細(xì)胞重編程為促再生的M2表型。由此可見，PTKM NPs通過抑制M1巨噬細(xì)胞極化、促進(jìn)M2巨噬細(xì)胞活化發(fā)揮抗炎作用，有利于慢性糖尿病創(chuàng)面修復(fù)。
圖4 體外評價(jià)PTKM NPs的免疫調(diào)節(jié)作用。（a）熒光顯微圖像和（b）細(xì)胞骨架染色的RAW 264.7細(xì)胞經(jīng)LPS處理并與不同納米顆粒共培養(yǎng)4小時(shí)的定量。（c）炎癥刺激12小時(shí)后RAW 264.7細(xì)胞中CD86的免疫熒光染色和（d）定量。（e）炎癥刺激12小時(shí)后RAW 264.7細(xì)胞中CD206的免疫熒光染色和（f）定量。（g）代表性流式細(xì)胞術(shù)圖顯示炎癥刺激12小時(shí)后CD86+ M1和CD206+ M2巨噬細(xì)胞的存在
（5）PTKM-水凝膠的制備與表征 高倍掃描電鏡圖像顯示，PTKM NPs分散在PTKM@HG水凝膠內(nèi)部（圖5a）。此外PTKM@HG水凝膠的CLSM 3D顯微照片表明，PTKM NPs均勻分布在HG水凝膠中（圖5b）。通過流變試驗(yàn)對含有3wt % PTKM NPs的PTKM@HG水凝膠的力學(xué)行為進(jìn)行了評價(jià)。應(yīng)變振幅掃描試驗(yàn)表明，在屈服應(yīng)變?yōu)閪 200%時(shí)，G′和G″均出現(xiàn)急劇下降（圖5c）。頻率掃描顯示PTKM@HG水凝膠具有粘彈性，其儲(chǔ)存模量（G′）為1 kPa（圖5d），低于人體皮膚組織的模量[75]。由于水凝膠中希夫堿共價(jià)鍵的動(dòng)態(tài)性質(zhì)，PTKM@HG水凝膠表現(xiàn)出優(yōu)異的自愈能力。如圖5e所示。為了進(jìn)一步評估PTKM@HG水凝膠的自愈能力，進(jìn)行了階梯應(yīng)變掃描。在5 rad/s的固定角頻率下，連續(xù)剪切應(yīng)變在500%和0.1%之間交替。當(dāng)PTKM@HG水凝膠受到500%的高應(yīng)變時(shí)，PTKM@HG水凝膠的G”大于G’而破裂（圖5f）。隨后，當(dāng)PTKM@HG水凝膠以0.01%的低應(yīng)變施加時(shí)，G”和G’值也能立即完全恢復(fù)到原始值，表明PTKM@HG水凝膠的自愈行為。PTKM@HG水凝膠展現(xiàn)出卓越的附著力，即使在經(jīng)過拉伸和扭曲后，依然能牢固地粘附在豬皮上而不脫落（圖5g）。同時(shí)，該水凝膠還具有出色的柔韌性，能夠隨著手指關(guān)節(jié)的彎曲而靈活變形（圖5h）。將PTKM@HG水凝膠置于不同pH值（5.5、6.5、7.4、8.0）的緩沖液中，以探究PTKM NPs的釋放行為。如圖5i所示，在模擬酸性環(huán)境（pH 5.5和6.5）中，72小時(shí)內(nèi)近90%的PTKM NPs從水凝膠中釋放，這歸因于酸性條件下席夫堿鍵的水解，使得PTKM NPs能從水凝膠中有效釋放。此外，體外劃痕實(shí)驗(yàn)表明，在LED照射下，PTKM@HG水凝膠顯著加速了HaCaTs細(xì)胞的遷移（圖5j）。經(jīng)過48小時(shí)孵育，PTKM@HG + LED組的HaCaTs遷移率顯著高于對照組及未照射LED的PTKM@HG組（圖5k和圖1）。同時(shí)，在高糖、低氧和高ROS條件下，PTKM@HG水凝膠上的HUVECs表現(xiàn)出增強(qiáng)的血管生成能力，管長和分支點(diǎn)增加，表明PTKM@HG水凝膠能有效促進(jìn)血管生成（圖5m）。這些結(jié)果表明PTKM@HG水凝膠具有良好的細(xì)胞相容性，可以在LED照射下有效釋放PTKM NPs，促進(jìn)細(xì)胞增殖、遷移和血管生成，這對于表皮和真皮的再生，加速傷口愈合至關(guān)重要。
圖5 PTKM@HG水凝膠的表征。（a）PTKM@HG水凝膠的SEM圖像。（b）CLSM圖像顯示fitc標(biāo)記的PTKM NPs在水凝膠中的均勻分布。（c）和（d）PTKM@HG水凝膠的流變性能。（e）PTKM@HG水凝膠的宏觀自愈能力。（f）PTKM@HG水凝膠應(yīng)變測量。（g）PTKM@HG水凝膠在拉伸、彎曲、扭轉(zhuǎn)作用下對豬皮的粘附能力。（h）顯示水凝膠粘附于手指關(guān)節(jié)的照片。（i）水凝膠在不同緩沖液中PTKM NPs的釋放曲線。（j）用LED照射PTKM@HG評估HaCaTs遷移的transwell系統(tǒng)示意圖。（k）在沒有或有LED照射的情況下，HG和PTKM@HG水凝膠處理在0和48小時(shí)時(shí)間間隔下HaCaTs遷移的代表性相襯圖。（l）培養(yǎng)48小時(shí)后細(xì)胞覆蓋面積的定量。（m）不同水凝膠處理6小時(shí)HUVECs血管形成的表示圖像
（6）體內(nèi)促進(jìn)糖尿病慢性傷口愈合 使用體內(nèi)熒光成像系統(tǒng)獲得PTKM@HG水凝膠在傷口部位的熒光圖像。在植入后24和72 h， PTKM NPs和HG水凝膠的熒光強(qiáng)度都很高（圖6a）。此外，在表皮區(qū)和定殖皮膚表皮處觀察到綠色熒光，表明PTKM NPs能夠穿透角質(zhì)層。圖6c為糖尿病大鼠全層創(chuàng)面模型傷口愈合過程。傷口部位的LED照射時(shí)間（660 nm, 20 W）為每天30分鐘（圖6b）。傷口的代表性圖像顯示，未經(jīng)任何處理的空白糖尿病傷口即使在21天后也難以完全愈合（圖6d）。水凝膠（TKM@HG、PTA@HG、PTKM@HG）處理組創(chuàng)面愈合速度明顯快于空白組。此外，LED照射有利于傷口愈合。與未LED照射組相比，所有LED照射組的創(chuàng)面尺寸均減小（圖6e）。定量結(jié)果顯示，PTKM@HG水凝膠+ LED治療的愈合效果最好，第21天傷口愈合率為91.4%（圖6f）。H&E結(jié)果顯示，在PTKM@HG水凝膠+LED處理的傷口中，皮膚表皮和真皮相對完整，高度有序，炎癥細(xì)胞浸潤較少（圖6g）。
圖6 PTKM@HG水凝膠對糖尿病創(chuàng)面無或有LED照射修復(fù)的療效觀察。（a）PTKM@HG水凝膠在不同時(shí)間點(diǎn)的體內(nèi)熒光成像。（b）LED照射下測試PTKM@HG水凝膠對糖尿病大鼠模型治療效果的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)示意圖。（c）PTKM@HG水凝膠治療動(dòng)物的示意圖。（d）660 nm LED照射和不照射第21天不同處理組創(chuàng)面的代表性圖像。（e）各治療組小鼠傷口愈合的面積跡圖。（f）愈合后21天創(chuàng)面大小變化。（g）不同處理組第21天傷口組織的代表性蘇木精和伊紅染色圖像
（7）PTKM@HG水凝膠的體內(nèi)抗氧化和免疫調(diào)節(jié)能力 在第3天，利用4-羥基-2-壬烯醛（4-HNE）和8-羥基脫氧鳥苷（8-OHdG）的免疫熒光染色來評估水凝膠對細(xì)胞成分（如脂質(zhì)和DNA）的抗氧化保護(hù)作用。如圖7a-d所示，PTKM@HG + LED組的4-HNE和8-OHdG水平在所有組中最低，這表明PTKM@HG水凝膠能有效減輕糖尿病創(chuàng)面愈合初期的氧化應(yīng)激。進(jìn)一步地，通過檢查第3天傷口部位巨噬細(xì)胞的浸潤和極化來探究水凝膠的抗炎效果。如圖7e-f所示，CD86標(biāo)記的免疫熒光染色顯示，空白組和HG組中M1型巨噬細(xì)胞數(shù)量眾多，暗示了強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng)。相比之下，PTKM@HG水凝膠處理組中CD86陽性的M1型巨噬細(xì)胞表達(dá)減少，而CD206陽性的M2型巨噬細(xì)胞表達(dá)增加（圖7g）。定量分析進(jìn)一步證實(shí)，PTKM@HG水凝膠能顯著降低炎癥反應(yīng)，并增強(qiáng)M2型巨噬細(xì)胞在創(chuàng)面部位的浸潤和分布（圖7h）。綜合體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，PTKM@HG水凝膠能有效降低M1型巨噬細(xì)胞的活化，促進(jìn)M2型巨噬細(xì)胞的極化，有利于構(gòu)建促進(jìn)糖尿病創(chuàng)面愈合的再生微環(huán)境。
圖7 PTKM@HG水凝膠在創(chuàng)面3天的體內(nèi)免疫調(diào)節(jié)作用。（a）4-HNE和（c）8-OHdG在創(chuàng)面組織中的免疫熒光染色。（e）CD86和（g）CD206在創(chuàng)面組織中的免疫熒光染色。（i）創(chuàng)面組織HIF-1α免疫熒光染色。（b）、（d）、（f）、（h）、（j）創(chuàng)面組織切片4-HNE、8-OHdG、CD86、CD206、HIF-1α的熒光定量（f /F0）。（k）PTKM@HG水凝膠在糖尿病創(chuàng)面愈合早期調(diào)節(jié)創(chuàng)面微環(huán)境的示意圖，包括（1）向創(chuàng)面微環(huán)境釋放PTKM NPs；（2）供氧緩解缺氧；（3）減少炎癥和氧化應(yīng)激
(8)PTKM@HG水凝膠促進(jìn)糖尿病創(chuàng)面新生血管和再上皮形成的供氧和供能能力 通過HIF-1α的免疫熒光染色，進(jìn)一步評估了PTKM@HG水凝膠在傷口處的氧氣供應(yīng)能力。結(jié)果顯示，在所有組別中，PTKM@HG + LED組的HIF-1α免疫熒光強(qiáng)度最低，證實(shí)了該水凝膠能在LED照射下釋放氧氣，從而緩解傷口局部的缺氧狀況（圖7i和j）?？傮w來看，PTKM@HG水凝膠顯著降低了傷口的氧化應(yīng)激，促進(jìn)了巨噬細(xì)胞向M2型的極化，平衡了M1/M2的比例，并在傷口愈合的早期階段緩解了局部缺氧，為傷口愈合創(chuàng)造了一個(gè)有利的微環(huán)境（圖7k）。在第3天和第21天，通過PGC-1α的免疫熒光染色檢測了傷口處的細(xì)胞代謝（圖8a-d）。與空白組相比，PTKM@HG水凝膠聯(lián)合LED處理顯著增加了PGC-1α陽性細(xì)胞的數(shù)量，表明該水凝膠在創(chuàng)面愈合早期和后期都能夠保護(hù)線粒體功能并增強(qiáng)細(xì)胞代謝。為了評估新生血管的形成，通過CD31和α-SMA的免疫熒光染色檢測了內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞。結(jié)果顯示，PTKM@HG水凝膠聯(lián)合LED處理增強(qiáng)了傷口區(qū)域的新血管生成，為傷口修復(fù)提供了必需的氧氣和營養(yǎng)（圖8e-h）。在愈合后期，再上皮化是皮膚修復(fù)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。我們通過CK14和CK10的免疫熒光染色評估了表皮標(biāo)志物的表達(dá)。在PTKM@HG水凝膠聯(lián)合LED處理的組別中，傷口幾乎完全閉合，被成熟的CK10陽性角質(zhì)形成細(xì)胞覆蓋，而空白組的細(xì)胞遷移速度明顯較慢（圖8i和j）。此外，CK14的染色還揭示了PTKM@HG水凝膠聯(lián)合LED處理顯著增加了表皮基底層毛囊的密度（圖8k，l和m），表明該水凝膠能有效促進(jìn)再上皮化，通過誘導(dǎo)角質(zhì)形成細(xì)胞遷移和毛囊形成。
圖8 PTKM@HG水凝膠促進(jìn)糖尿病大鼠傷口愈合。（a）和（c）第3天和第21天PGC-1α的免疫熒光染色。（e）損傷區(qū)CD31、（g）α-SMA、（i）細(xì)胞角蛋白10和（k）細(xì)胞角蛋白14的免疫熒光染色。（m）(k)中白框的放大圖像，黃色箭頭表示毛囊。（b-l）免疫熒光相對定量分析
研究小結(jié)：
在本研究中，開發(fā)了一種光驅(qū)動(dòng)的生物能量和氧氣釋放水凝膠，通過將多酚納米顆粒包裹在類囊體膜上制成人工光合納米顆粒（PTKM NPs），并將其整合到生物聚合物基的可生物降解水凝膠（PTKM@HG）中。這些PTKM NPs在自然光或溫和紅光照射下展現(xiàn)出顯著的光合作用，釋放氧氣并產(chǎn)生ATP和NADPH，避免了傳統(tǒng)光療中的皮膚損傷。持續(xù)的氧氣釋放改善了缺氧環(huán)境，降低了HIF-1α的表達(dá)，并保護(hù)線粒體免受氧化應(yīng)激的影響。PTKM NPs提供的外源能量和氧氣調(diào)節(jié)氨基酸代謝，可能激活mTOR信號通路，促進(jìn)線粒體生物合成，增強(qiáng)糖尿病傷口中細(xì)胞的線粒體功能。
此外，PTKM NPs還能減少高糖環(huán)境下的過量ROS產(chǎn)生，并誘導(dǎo)M2型巨噬細(xì)胞極化。因此，PTKM@HG水凝膠能夠全面促進(jìn)糖尿病傷口的修復(fù)，有效釋放PTKM NPs，糾正高血糖引起的炎癥、高ROS水平和代謝紊亂等微環(huán)境問題，并在紅光照射下加速表皮和真皮的再生。這項(xiàng)工作不僅為糖尿病傷口愈合提供了新策略，也為其他退行性疾病的治療提供了新思路，通過這種水凝膠實(shí)現(xiàn)關(guān)鍵代謝物和能量的有效傳遞。
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