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圖1. 示意圖顯示了實(shí)現(xiàn)靶向生物調(diào)節(jié)的工程分層水凝膠。工程化分層水凝膠可以提供適合成骨的機(jī)械環(huán)境，并通過(guò)調(diào)節(jié)炎癥和促進(jìn)細(xì)胞間線(xiàn)粒體轉(zhuǎn)移來(lái)調(diào)節(jié)BMSC的能量代謝。轉(zhuǎn)移的線(xiàn)粒體可以通過(guò)降低 BMSC 中的 ROS 水平并增加 ATP 和 OXPHOS 水平來(lái)增強(qiáng)成骨分化和骨修復(fù)

（1）隧道納米管介導(dǎo)巨噬細(xì)胞和 BMSC 之間的線(xiàn)粒體轉(zhuǎn)移

該段展示了巨噬細(xì)胞與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSC）之間的線(xiàn)粒體轉(zhuǎn)移機(jī)制，揭示了這一過(guò)程在骨缺損修復(fù)中的潛在作用。通過(guò)單細(xì)胞RNA測(cè)序分析（圖2a），研究人員發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞分泌的信號(hào)蛋白如SPP1、TGF-β和GDF對(duì)成骨細(xì)胞系細(xì)胞具有顯著的靶向作用，而圖2b和c的熱圖進(jìn)一步強(qiáng)調(diào)了巨噬細(xì)胞在骨修復(fù)過(guò)程中與其他細(xì)胞群體的密切相互作用。利用掃描電子顯微鏡（SEM）圖像（圖2d和e），觀察到巨噬細(xì)胞與BMSC之間通過(guò)隧道納米管（TNT）形成了物理連接，并且在巨噬細(xì)胞膜上形成了多個(gè)接觸點(diǎn)。免疫標(biāo)記實(shí)驗(yàn)（圖2f）證實(shí)了Sec3和Sec5蛋白在TNT募集的肌動(dòng)蛋白骨架處的共定位，以及Tom20-GFP標(biāo)記的線(xiàn)粒體在TNT中的共定位。圖2g的免疫熒光圖像顯示了Miro1與Tom20-GFP標(biāo)記的線(xiàn)粒體在TNT中的共定位，進(jìn)一步證實(shí)了Miro1在線(xiàn)粒體轉(zhuǎn)移中的作用。通過(guò)敲除Miro1的實(shí)驗(yàn)（圖2h和i），研究人員發(fā)現(xiàn)線(xiàn)粒體轉(zhuǎn)移效率顯著降低，這證實(shí)了Miro1介導(dǎo)的巨噬細(xì)胞向BMSC的線(xiàn)粒體轉(zhuǎn)移。這些發(fā)現(xiàn)表明，巨噬細(xì)胞與BMSC之間的線(xiàn)粒體轉(zhuǎn)移是通過(guò)TNT介導(dǎo)的，并且Miro1在這個(gè)過(guò)程中起著關(guān)鍵作用，對(duì)于維持細(xì)胞功能和促進(jìn)骨缺損修復(fù)具有重要意義。

（2）用于骨再生策略的工程分層水凝膠

這種水凝膠通過(guò)結(jié)合抗炎藥物二甲基異戊二烯酸（DMI）和靶向巨噬細(xì)胞的兩性離子納米凝膠（MDV），旨在調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)并促進(jìn)細(xì)胞間的線(xiàn)粒體轉(zhuǎn)移。圖3a的原理圖展示了植入式可注射水凝膠的基本生物學(xué)要求，突出了適宜的彈性模量對(duì)于組織工程的重要性。通過(guò)圖3b的楊氏模量測(cè)試，研究人員發(fā)現(xiàn)MDV納米凝膠的加入顯著增強(qiáng)了水凝膠的機(jī)械強(qiáng)度，為骨修復(fù)和再生提供了適宜的細(xì)胞外基質(zhì)環(huán)境。圖3c展示了水凝膠在模擬體內(nèi)條件下對(duì)羅丹明B的釋放行為，其中MDV納米凝膠顯示出較高的藥物釋放百分比，實(shí)現(xiàn)了高效的基因轉(zhuǎn)染和降低的細(xì)胞毒性。圖3d的流變學(xué)分析表明，水凝膠具有快速的溶膠-凝膠轉(zhuǎn)變能力，適合作為注射材料。圖3e的自我愈合測(cè)試證明了水凝膠通過(guò)可逆席夫堿鍵具有良好的自我修復(fù)能力。圖3f和圖3g的降解實(shí)驗(yàn)顯示了水凝膠在不同酶和pH值條件下的降解效率，以及隨時(shí)間變化的孔隙結(jié)構(gòu)，表明水凝膠具有良好的生物降解性。圖3h的釋放曲線(xiàn)顯示了水凝膠在不同pH值環(huán)境下對(duì)DMI和Miro1的控釋能力，這在炎癥環(huán)境中尤為關(guān)鍵。

特別是，載有Miro1的MDV納米凝膠能夠促進(jìn)從巨噬細(xì)胞到BMSC的線(xiàn)粒體轉(zhuǎn)移過(guò)程，調(diào)節(jié)BMSC中的ROS、ATP和OXPHOS水平，從而影響細(xì)胞內(nèi)線(xiàn)粒體功能和代謝狀態(tài)，促進(jìn)骨再生組織的形成和生長(zhǎng)。這些發(fā)現(xiàn)強(qiáng)調(diào)了細(xì)胞間線(xiàn)粒體轉(zhuǎn)移在骨缺損修復(fù)中的重要性，并突出了免疫和生物能量調(diào)節(jié)治療策略在組織再生中的潛力。

圖3. 用于骨再生策略的工程分層水凝膠。a) 示意圖闡明了組織工程中具有可逆交聯(lián)鍵合特征的植入可注射水凝膠的基本生物學(xué)先決條件。b) 不同分級(jí)水凝膠（CHMCB、CHMSB 和 CHMDV）以及不同 MDV 納米凝膠含量（0、25 和 50 mg/mL）的 CHMDV 的楊氏模量。插圖顯示了 CBMA、SBMA 和 DVBAPS (n = 3) 的化學(xué)結(jié)構(gòu)。c) 37°C 生理鹽水（0.9 wt%）中羅丹明 B 從分層水凝膠中的釋放曲線(xiàn)。d) 短時(shí)間尺度凝膠行為和 e) 分層水凝膠連續(xù)步進(jìn)應(yīng)變掃描的流變學(xué)分析 (n = 3)。f) 分級(jí)水凝膠在胰蛋白酶、透明質(zhì)酸酶和磷酸鹽緩沖鹽水（PBS，pH = 5.5 和 7.4）中的降解速率-時(shí)間曲線(xiàn) (n = 3)。g) 干燥分層水凝膠的時(shí)間依賴(lài)性 SEM 圖像和 h) DMI 和 Miro 1 在不同 pH 環(huán)境下的釋放曲線(xiàn) (n = 3)。比例尺為 20 μm（第 0 天）和 100 μm（第 3-15 天）

（3）裝載 Miro1-DNA 的 MDV 納米凝膠可以靶向巨噬細(xì)胞并調(diào)節(jié)線(xiàn)粒體轉(zhuǎn)移

研究人員深入探討了MDV納米凝膠在靶向巨噬細(xì)胞和調(diào)節(jié)線(xiàn)粒體轉(zhuǎn)移中的作用。通過(guò)圖4a的CCK-8細(xì)胞活性分析，研究人員證實(shí)了MDV納米凝膠在較高濃度下仍然保持低細(xì)胞毒性，表明其良好的生物相容性。圖4b的SEM圖像進(jìn)一步展示了MDV納米凝膠能夠特異性地被巨噬細(xì)胞攝取，而不是BMSC，揭示了其出色的巨噬細(xì)胞靶向能力。

研究人員還評(píng)估了MDV納米凝膠作為基因載體的潛力。圖4c的熒光圖像顯示，與常用的PEI和Lipo3000轉(zhuǎn)染試劑相比，MDV納米凝膠在轉(zhuǎn)染Miro1-DNA時(shí)展現(xiàn)出更高的效率。免疫熒光圖像（圖4d和e）以及共聚焦圖像（圖4f）共同證實(shí)了MDV納米凝膠能夠促進(jìn)Miro1的表達(dá)，并增強(qiáng)從巨噬細(xì)胞到BMSC的線(xiàn)粒體轉(zhuǎn)移。此外，流式細(xì)胞儀分析（圖4g和h）定量地證明了MDV納米凝膠處理后，巨噬細(xì)胞向BMSC的線(xiàn)粒體轉(zhuǎn)移效率顯著提高。這些結(jié)果表明，MDV納米凝膠不僅能有效靶向巨噬細(xì)胞，還能作為有效的基因載體提高M(jìn)iro1-DNA的轉(zhuǎn)染效率，并通過(guò)促進(jìn)線(xiàn)粒體轉(zhuǎn)移來(lái)增強(qiáng)受損細(xì)胞的修復(fù)能力。

（4）Gel@MDI通過(guò)調(diào)節(jié)BMSC的能量代謝來(lái)調(diào)節(jié)其成骨分化能力

研究人員深入分析了Gel@MDI水凝膠對(duì)BMSC成骨分化能力的影響，特別關(guān)注了其在調(diào)節(jié)BMSC能量代謝方面的作用。圖5a和b的結(jié)果揭示了Gel@MDI水凝膠能夠降低BMSC中的活性氧（ROS）水平，這是通過(guò)MitoSox染色來(lái)評(píng)估的，并且通過(guò)熒光強(qiáng)度的量化進(jìn)一步證實(shí)了這一點(diǎn)。圖5c和d中的共聚焦圖像和分析顯示，與M1型巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)的BMSC表現(xiàn)出較低的線(xiàn)粒體膜電位（MMP），反映了線(xiàn)粒體功能的損害，而Gel@MDI水凝膠的應(yīng)用則有助于恢復(fù)BMSC的MMP水平。

通過(guò)海馬XF分析平臺(tái)進(jìn)行的代謝分析（圖5e）表明，Gel@MDI水凝膠上的BMSC展現(xiàn)出更高的基礎(chǔ)呼吸率、備用呼吸能力和ATP產(chǎn)量，這表明Gel@MDI通過(guò)調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的極化和促進(jìn)線(xiàn)粒體轉(zhuǎn)移，增強(qiáng)了BMSC的代謝狀態(tài)。此外，圖5f至i的結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了Gel@MDI水凝膠能夠提高BMSC的線(xiàn)粒體呼吸和能量產(chǎn)生，這對(duì)于BMSC的成骨分化至關(guān)重要。

圖5j至m展示了Gel@MDI水凝膠顯著提高了BMSC的成骨能力，包括增加的ALP水平、更多的礦化結(jié)節(jié)以及成骨相關(guān)基因的表達(dá)。這些結(jié)果直接證明了Gel@MDI水凝膠通過(guò)改善BMSC的能量代謝和調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的極化，顯著促進(jìn)了BMSC的成骨潛力。Gel@MDI水凝膠作為一種新型的骨再生材料，通過(guò)精細(xì)調(diào)控免疫微環(huán)境和細(xì)胞代謝，展現(xiàn)出了在促進(jìn)骨缺損修復(fù)方面的巨大潛力。

圖5. 線(xiàn)粒體轉(zhuǎn)移的代謝效應(yīng)。a) 熒光圖像顯示分層 Gel@MDI 水凝膠上 BMSC 的 ROS 水平。MitoSox 染色（黃色）表示 BMSC 中的 ROS 水平。MitoTracker Deep Red 在共培養(yǎng)前標(biāo)記巨噬細(xì)胞線(xiàn)粒體（紅色）。b) 用于定量 ROS 產(chǎn)生的熒光標(biāo)記強(qiáng)度的平均值 (n = 6)。c, d) 代表性共焦圖像和相應(yīng)的分析，以量化 Gel@MDI 上 BMSC 中的 MMP 水平。TMRM 染色反映 MMP 水平 (n = 6)。e) 示意圖顯示海馬平臺(tái)的代謝分析，以研究線(xiàn)粒體轉(zhuǎn)移對(duì) BMSC 的影響。在 Gel@MDI 水凝膠上共培養(yǎng) 24 h 后，通過(guò) FACS 分離巨噬細(xì)胞和 BMSC，并進(jìn)一步利用 seahorse xfe96 平臺(tái)測(cè)量 BMSC 的代謝狀態(tài)。f) Seahorse XF Mito 應(yīng)激測(cè)試中 BMSC 的耗氧率 (OCR) 顯示線(xiàn)粒體呼吸增加 (n = 8)。g) 基礎(chǔ)呼吸，h) 備用呼吸能力，i) BMSC 中的 ATP 產(chǎn)生 (n = 8)。j) 成骨分化后 7 天和 14 天在 CH（純凝膠）或分級(jí)水凝膠（Gel@MDI）上培養(yǎng)的 BMSC 的 ALP 染色和茜素紅 S 染色。k–m) 成骨分化后 7 天成骨相關(guān)基因 Col1a1、Alp、Runx2 和 Sp7 的表達(dá) (n = 3)。*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001

（5）具有免疫調(diào)節(jié)和靶向線(xiàn)粒體轉(zhuǎn)移的分層水凝膠促進(jìn)臨界尺寸顱骨缺損的再生

研究人員通過(guò)在小鼠模型中植入Gel@MDI水凝膠，評(píng)估了其在體內(nèi)促進(jìn)臨界尺寸顱骨缺損修復(fù)的能力。結(jié)果顯示，與對(duì)照組和純CH水凝膠組相比，Gel@MDI處理組在8周后顯示出顯著的骨再生，其特點(diǎn)是更多的鈣化和復(fù)雜的組織形成。通過(guò)micro-CT掃描圖像（圖6a和b），觀察到Gel@MDI組的骨體積/總組織體積（BV/TV）和小梁厚度（Tb.Th）顯著高于其他組，而小梁分離/間隙（Tb.Sp）則顯著更低（圖6c-e）。此外，H&E染色和Masson三色染色（圖6h）揭示了Gel@MDI組新形成的骨骼分布均勻且結(jié)構(gòu)緊密。免疫熒光分析進(jìn)一步表明，Gel@MDI促進(jìn)了M2型巨噬細(xì)胞標(biāo)記物CD206的表達(dá)，并降低了M1型巨噬細(xì)胞標(biāo)記物iNOS的表達(dá)（圖6f-j），這表明Gel@MDI通過(guò)調(diào)節(jié)免疫微環(huán)境，促進(jìn)了骨缺損的修復(fù)。

圖6. Gel@MDI 移植促進(jìn)臨界尺寸骨缺損的再生。a) 顱骨缺損手術(shù)后水凝膠植入的圖示。b–e) 分別在術(shù)后 2 周對(duì)僅手術(shù)組 (Con)、CH（純凝膠）和分級(jí)水凝膠 (Gel@MDI) 組的骨再生進(jìn)行顯微 CT 評(píng)估。新再生骨組織的定量分析，包括 c) BV/TV、d) Tb.Th 和 e) Tb.Sp (n = 3)。f) CD206 陽(yáng)性染色區(qū)域和 g) iNOS 陽(yáng)性染色區(qū)域的定量分析 (n = 4)。h) 顱骨缺損后 8 周，Con、Gel 或 Gel@MDI 組石蠟切片的 H&E 染色和 Masson 三色染色。i, j) iNOS 陽(yáng)性染色區(qū)域和 CD206 陽(yáng)性染色區(qū)域的共免疫熒光染色圖像 (n = 4)。*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001

研究人員還深入探討了Gel@MDI水凝膠調(diào)節(jié)的生物學(xué)過(guò)程。通過(guò)比較手術(shù)對(duì)照組和Gel@MDI組之間的差異表達(dá)基因，研究人員鑒定了449個(gè)差異表達(dá)基因，涉及神經(jīng)再生、成骨分化和代謝相關(guān)途徑的富集（圖7a-c）?；蚣患治觯℅SEA）確認(rèn)了Gel@MDI在“骨成熟”和“骨吸收”中的顯著作用。熱圖和箱線(xiàn)圖分析顯示，與對(duì)照組和Gel組相比，Gel@MDI組中成骨、抗炎和代謝基因的表達(dá)增加（圖7d），突出了其在骨免疫調(diào)節(jié)中的作用。這些結(jié)果表明，Gel@MDI水凝膠通過(guò)精細(xì)調(diào)控免疫反應(yīng)和促進(jìn)線(xiàn)粒體轉(zhuǎn)移，顯著提高了BMSC的能量代謝和成骨潛力，從而在體內(nèi)對(duì)骨缺損修復(fù)具有顯著的促進(jìn)作用，展現(xiàn)出在骨再生和修復(fù)方面的巨大潛力和應(yīng)用前景。