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牙周炎是一種以牙周組織炎癥為特征的破壞性疾病，炎癥環(huán)境顯著削弱了牙周膜干細(xì)胞（PDLSCs）的成骨分化能力，阻礙牙周組織再生。氧化應(yīng)激與線粒體功能障礙密切相關(guān)，是導(dǎo)致干細(xì)胞功能衰退的關(guān)鍵因素。線粒體作為細(xì)胞代謝和分化的核心器官，在炎癥條件下因活性氧（ROS）過度產(chǎn)生而加劇細(xì)胞損傷。因此，靶向線粒體功能障礙成為提升PDLSCs再生能力的重要策略。白藜蘆醇（RSV）因其抗氧化、調(diào)節(jié)線粒體功能及促成骨作用，被認(rèn)為是牙周再生的潛在藥物。然而，其短半衰期和低穩(wěn)定性限制了臨床應(yīng)用。通過生物材料構(gòu)建穩(wěn)定的RSV遞送系統(tǒng)可有效克服這一局限性。

基于上述問題，第四軍醫(yī)大學(xué)田北明（音譯）和何小濤（音譯）教授團(tuán)隊(duì)，為了改善炎癥環(huán)境下牙周膜干細(xì)胞（PDLSCs）的成骨分化能力，開發(fā)了一種基于胍基化乙二醇?xì)ぞ厶牵℅GC）與鋅離子配位的白藜蘆醇（RSV）納米遞送系統(tǒng)（GGC-Zn2?-RSV）。通過胍基修飾實(shí)現(xiàn)線粒體靶向，鋅離子提供抗氧化功能，配位交聯(lián)提升系統(tǒng)穩(wěn)定性。該研究系統(tǒng)評估了GGC-Zn2?-RSV的理化性質(zhì)、線粒體靶向能力及其對細(xì)胞行為和線粒體功能的影響，并通過體內(nèi)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證其促成骨效果。研究結(jié)果揭示了GGC-Zn2?-RSV在改善線粒體功能、緩解氧化應(yīng)激和促進(jìn)牙周組織再生中的機(jī)制，為牙周炎治療提供了新策略和理論依據(jù)。該文章于2024年12月04日以《Mitochondria-targeted delivery of zinc-coordinated resveratrol nanoparticles rescues the osteogenic potential of periodontal ligament stem cells compromised by inflammation for periodontal wound healing》為題發(fā)表于《Chemical Engineering Journal》（DOI：10.1016/j.cej.2024.158296）。

（1）GGC-Zn²⁺-RSV的制備和表征

該研究制備并表征了GGC-Zn2?-RSV納米顆粒，通過鋅離子與GGC絡(luò)合實(shí)現(xiàn)RSV的交聯(lián)，制備過程簡化且未使用有毒交聯(lián)劑（圖1A）。FTIR光譜顯示，GGC在1553 cm?1和1302 cm?1處出現(xiàn)了C= N和C-N的特征峰，證明了胍基的成功接枝（圖1B）。拉曼光譜進(jìn)一步確認(rèn)了該化學(xué)反應(yīng)，新增的特征峰在1156 cm?1和1512 cm?1，分別對應(yīng)胍基的C-N伸縮振動和N-H彎曲振動（圖1C）。DLS和TEM分析表明，GGC-Zn2?-RSV納米顆粒的平均粒徑為136.4 nm，分散性良好，TEM顯示其形態(tài)均勻，且溶液中表現(xiàn)出清晰的Tyndall效應(yīng)（圖1D–F, 1G–I）。XPS分析在1046.06 eV和1022.99 eV處檢測到鋅離子特征能量，證實(shí)了鋅的成功摻入（圖1K），UV吸收光譜顯示306 nm的RSV特征峰，進(jìn)一步驗(yàn)證了RSV的載入（圖1L）。XRD圖譜中觀察到16.25°、19.09°、22.44°和23.70°的衍射峰，與RSV的晶體特征一致，表明成功交聯(lián)形成了金屬-酚類納米顆粒（圖1M）。在穩(wěn)定性測試中，顆粒在尿素和Tween 20環(huán)境下表現(xiàn)出不同的響應(yīng)特性，同時在EDTA溶液中發(fā)生膨脹，驗(yàn)證了其金屬-酚類材料的穩(wěn)定性（圖1N）。pH響應(yīng)性測試表明，在酸性環(huán)境下，RSV的釋放速率顯著增加（圖1O）。DPPH抗氧化活性實(shí)驗(yàn)顯示，GGC-Zn2?-RSV的自由基清除能力具有持續(xù)性和穩(wěn)定性，相比RSV更加優(yōu)越（圖1P）。

圖1. GGC-Zn²⁺-RSV的制備與表征。 (A) GGC-Zn²⁺-RSV的制備示意圖。首先將殼聚糖（GC）接枝胍基，得到GGC，然后通過鋅金屬離子配位將GGC與RSV交聯(lián)，合成GGC-Zn²⁺-RSV；(B) FTIR光譜顯示GC（–OH伸縮振動峰在3436 cm^?1，C-H伸縮振動峰在2940 cm^?1和2868 cm^?1，C-O伸縮振動峰在1057 cm^?1）和GGC（C?=?N伸縮振動峰在1553 cm^?1，C-N振動峰在1302 cm^?1）的特征吸收峰；(C) 拉曼光譜顯示GC（2920 cm^?1, 2879 cm^?1歸因于–CH₂）和GGC（C-N伸縮振動峰在1156 cm^?1，N-H彎曲振動峰在1512 cm^?1）的特征吸收峰；(D-F) 不同濃度的GGC（D）、Zn²⁺（E）和RSV（F）對合成的GGC-Zn²⁺-RSV顆粒直徑和多分散指數(shù)（PDI）的影響，通過動態(tài)光散射（DLS）分析測定（n = 3）；(G) 用0.2 mg/mL RSV、1 mg/mL GGC和3 mM Zn²⁺合成的GGC-Zn²⁺-RSV顆粒的粒徑分布；(H) 代表性TEM圖像及Tyndall效應(yīng)（左下角），顯示了在培養(yǎng)基中均勻分散的納米級GGC-Zn²⁺-RSV顆粒；(I) 單個納米顆粒的高倍TEM圖像；(J) GGC-Zn²⁺-RSV的EDX光譜，C、O、N和Zn的信號分別出現(xiàn)在0.277、0.392、0.525和8.630 keV；(K) GC、GGC、RSV和GGC-Zn²⁺-RSV的XPS光譜，在GGC-Zn²⁺-RSV的全譜中觀察到Zn的結(jié)合能分別為1046.06 eV（Zn 2p1/2）和1022.99 eV（Zn 2p3/2）；(L) GC、GGC、RSV和GGC-Zn2+-RSV的UV-Vis光譜，GGC-Zn²⁺-RSV的UV-Vis光譜中也觀察到了RSV的特征峰（約306 nm）（由黑箭頭標(biāo)出）；(M) GC、GGC、RSV和GGC-Zn²⁺-RSV的XRD圖譜，在GGC-Zn2+-RSV和RSV的XRD圖譜中觀察到16.25°、19.09°、22.44°和23.70°的衍射峰（由黑箭頭標(biāo)出）；(N) 與不同濃度的EDTA、尿素和Tween 20孵育后的GGC-Zn²⁺-RSV粒徑變化（n = 3）；(O) 在不同pH值的PBS中孵育后，GGC-Zn²⁺-RSV中RSV的體外累計(jì)釋放（n = 3）；(P) DPPH實(shí)驗(yàn)顯示在0.5、2、6、10和14小時孵育后的RSV和GGC-Zn²⁺-RSV的動態(tài)抗氧化活性（SA）（n = 5）。數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示

（2）GGC-Zn²⁺-RSV對PDLSCs的細(xì)胞毒性

如圖2A所示，當(dāng)RSV濃度超過10 μM時，顯著抑制了細(xì)胞活力。GC-Zn²⁺-RSV和GGC-Zn²⁺-RSV的安全濃度相同，且每種濃度為5 μM時未對細(xì)胞活力產(chǎn)生影響，表明胍基接枝未引起額外的細(xì)胞毒性。增殖曲線顯示，PDLSCs在不同培養(yǎng)條件下的生長情況良好，然而RSV或納米粒子濃度超過5 μM時，增殖速率顯著下降。CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，隨著藥物濃度的增加，細(xì)胞相容性逐漸下降，確認(rèn)了5 μM為最佳治療濃度。從活死細(xì)胞分析（圖2）中也可以得出一致的結(jié)論，觀察到的綠（活細(xì)胞）和紅（死細(xì)胞）染色表明相同的細(xì)胞活性結(jié)果。

圖2. RSV、GC-Zn²⁺-RSV和GGC-Zn²⁺-RSV的細(xì)胞相容性。(A) CCK-8實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示RSV、GC-Zn²⁺-RSV和GGC-Zn²⁺-RSV在1天、2天和3天后的PDLSCs活力影響（n = 5）；(B) 代表性的活/死染色圖像顯示不同濃度的RSV、GC-Zn²⁺-RSV和GGC-Zn²⁺-RSV孵育后，活細(xì)胞（用綠色熒光標(biāo)記）和死細(xì)胞（用紅色熒光標(biāo)記）的情況

（3）GGC-Zn2+-RSV促進(jìn)RSV在PDLSCs中的溶酶體逃逸和線粒體遞送

該研究評估了GGC-Zn²⁺-RSV對PDLSCs的細(xì)胞內(nèi)攝取和遞送行為。流式細(xì)胞術(shù)分析（圖3A）顯示，隨著時間的推移，納米粒子的細(xì)胞攝取逐漸增加，且GGC- Zn²⁺-RSV在前6小時相比GC-Zn²⁺-RSV有輕微增加，但在8小時后兩者幾乎無差異（圖3B）。GGC- Zn²⁺-RSV能夠通過其緩沖效應(yīng)促進(jìn)溶酶體逃逸，這一點(diǎn)通過滴定實(shí)驗(yàn)（圖3C）得到驗(yàn)證，GGC-Zn²⁺-RSV在酸堿滴定過程中pH變化較小。進(jìn)一步的Cl?流入曲線分析（圖3D）表明，GGC-Zn²⁺-RSV顯著增加了Cl?的流入，支持其溶酶體逃逸的能力。此外，胍基作為脂溶性陽離子，可以靶向線粒體。通過熒光共定位分析（圖3E、F和G、H），結(jié)果顯示，GGC-Zn²⁺-RSV在8小時時未定位于溶酶體，而是更強(qiáng)烈地定位于線粒體，表明GGC-Zn²⁺-RSV能夠高效逃逸溶酶體并轉(zhuǎn)運(yùn)至線粒體。這一現(xiàn)象與GGC-Zn²⁺-RSV較強(qiáng)的線粒體靶向性密切相關(guān)。

圖3. GC-Zn²⁺-RSV和GGC-Zn²⁺-RSV在PDLSCs中的細(xì)胞攝取和內(nèi)流運(yùn)輸。(A) 代表性的流式細(xì)胞術(shù)圖像顯示PDLSCs在2、4、6和8小時孵育后對FITC標(biāo)記的GC-Zn²⁺-RSV和GGC-Zn²⁺-RSV的攝取情況。PBS處理的細(xì)胞作為對照。(B) GC-Zn²⁺-RSV和GGC-Zn²⁺-RSV在2、4、6和8小時孵育后的FITC標(biāo)記平均熒光強(qiáng)度的定量。(C) NaCl、GC-Zn²⁺-RSV和GGC-Zn²⁺-RSV的滴定曲線，顯示添加0.1 M HCl后的pH變化。NaCl的滴定曲線作為對照。(D) PDLSCs在不同時間點(diǎn)（1、2、3、4、5、6分鐘）孵育MQAE探針后的熒光強(qiáng)度（n = 3）。PBS處理的細(xì)胞作為對照。(E) 代表性的免疫熒光圖像顯示LysoTracker（溶酶體）與FITC標(biāo)記的GC-Zn²⁺-RSV或GGC-Zn²⁺-RSV在8小時共孵育后的共定位情況。(F) GC-Zn²⁺-RSV、GGC-Zn²⁺-RSV和溶酶體在PDLSCs中熒光共定位的分析。(G) 代表性的免疫熒光圖像顯示MitoTracker（線粒體）與FITC標(biāo)記的GC-Zn²⁺-RSV或GGC-Zn²⁺-RSV在8小時共孵育后的共定位情況。(H) GC-Zn²⁺-RSV、GGC-Zn²⁺-RSV和線粒體在PDLSCs中的熒光共定位分析。數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。白色線條代表共定位分析的感興趣區(qū)域

（4）GGC-Zn2?-RSV增強(qiáng)炎癥條件下PDLSCs的成骨能力

該研究評估了GGC-Zn2?-RSV是否能夠作為一種再生治療，恢復(fù)炎癥引起的成骨功能損傷。2周的成骨誘導(dǎo)后進(jìn)行ALP染色（圖4A），結(jié)果表明在TNF-α和IL-1β的存在下，ALP活性顯著降低，表明炎癥減弱了PDLSC的成骨分化能力。GGC-Zn2?-RSV組的ALP陽性面積最大，表明其具有優(yōu)越的成骨效果。此外，GC-Zn2?-RSV和GGC-Zn2?-RSV組的ALP活性均高于純RSV組，表明納米粒子提高了RSV的生物利用度，且具有更好的治療效果。進(jìn)一步的組間比較表明，GGC-Zn2?-RSV相比GC-Zn2?-RSV具有顯著的促成骨作用，說明通過胍基接枝修飾納米粒子直接影響了PDLSC的成骨分化并取得了更好的效果（圖4B）。此外，通過阿利新紅染色評估21天后的成骨表現(xiàn)（圖4C和D），進(jìn)一步確認(rèn)了GGC-Zn2?-RSV在促進(jìn)炎癥損傷PDLSC的成骨分化中的優(yōu)越性，該組中存在最大且最深的阿利新紅礦化結(jié)節(jié)。在正常組中，PDLSC被埋入礦化基質(zhì)中，形成更大的隆起，并伴隨著小針狀、片狀晶體的鈣分泌現(xiàn)象。相比之下，受到炎癥刺激后，鈣化晶體的結(jié)構(gòu)變?yōu)轭w粒狀沉積，且鈣化晶體的數(shù)量減少。值得注意的是，GGC-Zn2?-RSV組逆轉(zhuǎn)了炎癥并導(dǎo)致強(qiáng)勁的鈣分泌，這與染色結(jié)果一致。通過qRT-PCR檢測在2周成骨誘導(dǎo)后PDLSC的成骨相關(guān)基因表達(dá)（圖4E），結(jié)果顯示，炎癥因子的加入顯著降低了Runx2、ALP、Col-1和OCN的表達(dá)，而RSV、GC-Zn2?-RSV和GGC-Zn2?-RSV治療可在不同程度上逆轉(zhuǎn)這一趨勢。深入比較研究表明，GGC-Zn2?-RSV組的促成骨效果尤為顯著，因其ALP、Col-1和OCN的表達(dá)水平最高。該研究還通過免疫熒光分析檢測了ALP和Runx2的蛋白表達(dá)（圖4F-H），結(jié)果表明，RSV、GC-Zn2?-RSV和GGC-Zn2?-RSV顯著增加了這兩種蛋白的熒光強(qiáng)度。兩種納米粒子組中，ALP表達(dá)的改善更為明顯，而GGC-Zn2?-RSV在Runx2蛋白表達(dá)上的改善最為顯著，表明其在促進(jìn)成骨分化方面具有優(yōu)越性。通過WB檢測OCN帶的相對灰度值（圖4I和J）得出的結(jié)論一致，這些結(jié)果與ALP、阿利新紅染色及SEM分析結(jié)果一致。綜合來看，這些數(shù)據(jù)表明GGC-Zn2?-RSV在治療中的絕對優(yōu)勢，表明RSV載藥納米醫(yī)學(xué)與胍基修飾的結(jié)合是恢復(fù)炎癥損傷成骨的最佳選擇。這一結(jié)果可能是由于納米粒子的內(nèi)在穩(wěn)定性高于純RSV，且胍基接枝提高了納米粒子在PDLSC中的生物利用度。

圖4. 在炎癥條件下（Infla）培養(yǎng)的PDLSCs經(jīng)RSV、GC-Zn²⁺-RSV或GGC-Zn²⁺-RSV處理后的成骨分化。正常成骨培養(yǎng)基（Nor）處理的細(xì)胞作為對照。(A) PDLSCs在成骨誘導(dǎo)2周后的堿性磷酸酶（ALP）染色代表圖像。(B) PDLSCs在成骨誘導(dǎo)2周后的ALP活性的定量分析（n=3）。(C) PDLSCs在成骨誘導(dǎo)3周后的Alizarin紅染色代表圖像。(D) Alizarin染色的鈣沉積物定量（n=3）。(E) PDLSCs在成骨誘導(dǎo)2周后，qRT-PCR檢測的成骨相關(guān)基因（ALP、Runx2、Col-1和OCN）的相對表達(dá)（n=5）。(F) 代表性免疫熒光圖像顯示成骨相關(guān)蛋白（ALP和Runx2）在成骨誘導(dǎo)2周后的表達(dá)。(G和H) PDLSCs中ALP（G）和Runx2（H）熒光強(qiáng)度的定量分析（n=3）。(I) PDLSCs在成骨誘導(dǎo)2周后，Western blot檢測的OCN蛋白的相對表達(dá)。(J) OCN蛋白表達(dá)水平的半定量分析（標(biāo)準(zhǔn)化為GAPDH水平），以相對灰度密度表示（n=3）

（5）GGC-Zn2?-RSV緩解炎癥條件下PDLSCs的線粒體功能障礙

該研究進(jìn)一步驗(yàn)證了GGC-Zn2?-RSV在改善炎癥引起的線粒體功能障礙和氧化應(yīng)激中的作用。通過DCFH-DA檢測發(fā)現(xiàn)，炎癥環(huán)境中PDLSCs的ROS水平顯著升高，而GGC-Zn2?-RSV處理組的ROS和脂質(zhì)過氧化物（MDA）水平顯著下降，顯示其優(yōu)越的抗氧化效果（圖5A-C）。同時，GGC-Zn2?-RSV顯著提高了SOD、GPx和CAT等抗氧化酶的活性，其效果優(yōu)于RSV和GC-Zn2?-RSV組（圖5D-F），表明胍基修飾增強(qiáng)了抗氧化效能。Transwell實(shí)驗(yàn)顯示，GGC-Zn2?-RSV處理顯著促進(jìn)了PDLSCs的遷移能力。在觀察線粒體功能時，JC-1染色表明GGC-Zn2?-RSV能有效改善線粒體膜電位（MMP），減少線粒體去極化現(xiàn)象（圖5G-H）。此外，MitoSOX檢測顯示GGC-Zn2?-RSV處理組顯著降低了線粒體ROS水平，并通過TEM觀察發(fā)現(xiàn)其顯著減少了炎癥導(dǎo)致的線粒體腫脹，保持了線粒體結(jié)構(gòu)的完整性（圖5I-K）。ATP檢測結(jié)果進(jìn)一步表明，GGC-Zn2?-RSV組在線粒體功能恢復(fù)方面表現(xiàn)最佳，顯著提高了細(xì)胞的ATP水平（圖5L）。綜上，GGC-Zn2?-RSV通過促進(jìn)溶酶體逃逸和線粒體靶向遞送，優(yōu)化了RSV在線粒體中的利用，顯著緩解了炎癥環(huán)境中的氧化應(yīng)激，保護(hù)了線粒體功能，從而極大地促進(jìn)了PDLSCs的成骨分化能力。

圖5. GGC-Zn2?-RSV緩解炎癥條件下PDLSCs的氧化應(yīng)激和線粒體功能障礙。細(xì)胞在炎癥條件（Infla）下培養(yǎng)，并分別用RSV、GC-Zn2?-RSV或GGC-Zn2?-RSV處理3天。正常成骨培養(yǎng)基（Nor）培養(yǎng)的細(xì)胞作為對照。(A) 代表性熒光圖像顯示通過DCFH‐DA探針檢測的PDLSC誘導(dǎo)過程中細(xì)胞內(nèi)ROS水平。(B) DCFH-DA熒光強(qiáng)度的定量分析（n=3）。(C) 各組PDLSCs中MDA的含量（n=3）。(D-F) 各組PDLSCs中抗氧化酶SOD（D）、GPx（E）和CAT（F）的表達(dá)水平（n=3）。(G) 通過JC-1染色檢測PDLSCs的線粒體膜電位。紅色熒光表示健康線粒體內(nèi)JC-1聚集物的存在，而綠色熒光則表示膜電位受損線粒體內(nèi)的細(xì)胞質(zhì)JC-1單體。(H) PDLSCs線粒體膜電位的定量分析（n=3）。(I) 通過流式細(xì)胞術(shù)分析MitoSOX探針檢測PDLSCs中線粒體ROS水平。(J) 線粒體ROS水平的定量分析（通過MitoSOX相對熒光強(qiáng)度表示）。(K) 代表性TEM圖像顯示PDLSC線粒體形態(tài)。紅色箭頭表示健康線粒體，黃色箭頭表示腫脹的線粒體。(L) 各組PDLSCs的細(xì)胞內(nèi)ATP產(chǎn)量（n=3）

（6）GGC-Zn2?-RSV促進(jìn)實(shí)驗(yàn)性牙周炎的創(chuàng)面愈合

該研究進(jìn)一步驗(yàn)證了GGC-Zn2?-RSV在緩解牙周炎引起的炎癥損傷及抑制牙周組織破壞方面的治療潛力。通過建立牙周炎大鼠模型，并局部注射納米粒子（圖6A）。micro-CT結(jié)果顯示，結(jié)扎和LPS注射導(dǎo)致牙槽骨吸收加劇，牙齒周圍骨高度降低，成功建立了牙周炎模型（圖6B）。與牙周炎組相比，RSV、GC-Zn2?-RSV和GGC-Zn2?-RSV均顯著減輕了牙周骨吸收，其中GGC-Zn2?-RSV治療效果最佳。牙槽骨相關(guān)參數(shù)（BV/TV、Tb.Th及牙槽骨損失）進(jìn)一步證實(shí)了這一結(jié)果（圖6C）。牙周炎組顯示BV/TV和Tb.Th顯著降低，骨損失程度增加。RSV和GC-Zn2?-RSV組對骨參數(shù)和骨高度的影響有限，而GGC-Zn2?-RSV組顯著改善了骨參數(shù)和骨高度，展現(xiàn)出在炎癥條件下的顯著優(yōu)勢。H&E和Masson染色（圖6D和E）結(jié)果表明，正常組的牙周膜纖維密集、完整且排列有序，而牙周炎組的牙周組織中膠原纖維斷裂、降解，并伴隨大量炎癥細(xì)胞浸潤。三種治療組均表現(xiàn)出一定的保護(hù)作用，顯著減少了結(jié)締組織的退化程度。由于純RSV半衰期較短，其保護(hù)效果不夠持久，牙周纖維稀疏且排列較亂，而GGC-Zn2?-RSV組的牙周膜纖維排列更加有序，與micro-CT結(jié)果一致。TRAP染色進(jìn)一步驗(yàn)證了GGC-Zn2?-RSV對牙周組織的保護(hù)作用（圖6F）。牙周炎組在牙槽骨邊緣分布了大量紅色沉淀物，表明炎癥引起的破骨細(xì)胞生成活躍。而GGC-Zn2?-RSV組的染色細(xì)胞數(shù)量最少，破骨細(xì)胞活性顯著受到抑制。這些結(jié)果表明，GGC-Zn2?-RSV在抑制牙周組織破壞和促進(jìn)牙周炎創(chuàng)面愈合方面具有顯著優(yōu)勢。

圖6. GGC-Zn2?-RSV對牙周炎引起的骨破壞的治療效果。RSV、GC-Zn2?-RSV和GGC-Zn2?-RSV分別在第2至第6周每兩天注射一次到上頜第二磨牙的牙齦溝中。未添加任何試劑的PBS作為負(fù)對照（牙周炎）。(A) 示意圖展示通過結(jié)扎和Porphyromonas gingivalis來源的脂多糖（P.g.-LPS）注射建立大鼠牙周炎模型，然后局部注射RSV、GC-Zn2?-RSV或GGC-Zn2?-RSV進(jìn)行治療。(B) 上頜骨的三維（上）和切面微CT圖像（下）。黃色曲線表示牙槽骨嵴（ABC），藍(lán)色曲線表示牙釉質(zhì)-牙本質(zhì)交界（CEJ）。紅線表示第二磨牙在近中和遠(yuǎn)中位置的CEJ-ABC距離。(C) 通過微CT掃描定量分析BV/TV、Tb.Th以及上頜第二磨牙ABC與CEJ之間的距離（n=5）。 (D-F) 代表性H&E（D）、Masson（E）和TRAP（F）染色的牙周組織。黃色箭頭表示炎癥細(xì)胞，紅色箭頭表示TRAP陽性多核細(xì)胞。PDL代表牙周膜，root代表牙根，AB代表牙槽骨

（7）GGC-Zn2?-RSV通過緩解氧化應(yīng)激和干細(xì)胞募集促進(jìn)牙周健康

該研究評估了3-硝基酪氨酸（3-Nitrotyrosine）的表達(dá)以表征牙周組織中的氧化損傷。結(jié)果顯示，牙周炎組中3-硝基酪氨酸表達(dá)顯著升高，提示氧化應(yīng)激水平較高（圖7A和B）。GGC-Zn2?-RSV治療顯著降低了3-硝基酪氨酸的表達(dá)，優(yōu)于GC-Zn2?-RSV，展現(xiàn)出最強(qiáng)的抗氧化效果。氧化應(yīng)激會削弱干細(xì)胞的遷移能力，而增強(qiáng)干細(xì)胞遷移可能促進(jìn)干細(xì)胞療法。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步評估了不同治療對干細(xì)胞募集的影響，通過標(biāo)記間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)志物CD73和CD90（圖7C-F），結(jié)果表明，健康牙周組織中CD73和CD90表達(dá)豐富，而牙周炎組織中表達(dá)減少。GGC-Zn2?-RSV組的CD73和CD90表達(dá)恢復(fù)程度最大，定量分析結(jié)果進(jìn)一步證明其在干細(xì)胞募集中的顯著優(yōu)勢。在成骨方面，ALP作為典型的成骨分化標(biāo)志物，其免疫組化結(jié)果顯示，ALP的表達(dá)趨勢與CD73和CD90一致（圖7G）。定量分析表明，GGC-Zn2?-RSV組與牙周炎組之間存在顯著差異，GGC-Zn2?-RSV能夠通過刺激ALP表達(dá)彌補(bǔ)炎癥環(huán)境下成骨分化效率低下的問題（圖7H）。綜合來看，GGC-Zn2?-RSV通過動員干細(xì)胞和緩解氧化應(yīng)激，在促進(jìn)牙周健康再生方面展現(xiàn)出優(yōu)異功能，其基于線粒體靶向能力的RSV納米載體系統(tǒng)為治療牙周炎提供了一種有效手段。

圖7. GGC-Zn2?-RSV促進(jìn)實(shí)驗(yàn)性牙周炎大鼠的抗氧化應(yīng)激、干細(xì)胞招募和成骨作用。RSV、GC-Zn2?-RSV和GGC-Zn2?-RSV分別在第2至第6周每兩天注射一次到上頜第二磨牙的牙齦溝中。未添加任何試劑的PBS作為負(fù)對照（牙周炎）。(A 和 B) 代表性免疫熒光圖像（A）及定量分析（B）顯示牙周組織中3-硝基酪氨酸的表達(dá)（n=5）。(C 和 D) 代表性免疫組化圖像（C）及定量分析（D）顯示牙周組織中CD73的表達(dá)（n=5）。(E 和 F) 代表性免疫熒光圖像（E）及定量分析（F）顯示牙周組織中CD90的表達(dá)（n=5）。(G 和 H) 代表性免疫組化圖像（G）及定量分析（H）顯示牙周組織中ALP的表達(dá)（n=5）。root表示牙根，AB代表牙槽骨。紅箭頭表示免疫組化染色陽性區(qū)域

【研究小結(jié)】

該研究設(shè)計(jì)了一種基于RSV的納米載體系統(tǒng)，通過調(diào)節(jié)線粒體功能和激活修復(fù)機(jī)制，驗(yàn)證了GGC-Zn2?-RSV在促進(jìn)PDLSCs分化和遷移中的作用，并證實(shí)其局部注射對實(shí)驗(yàn)性牙周炎的治療是安全有效的。此設(shè)計(jì)實(shí)現(xiàn)了靶向治療的目標(biāo)，顯著改善線粒體功能和RSV的利用率，同時降低了高劑量用藥的副作用風(fēng)險。然而，研究也存在一定局限性。該研究選擇Zn2?驅(qū)動納米粒子的組裝，但其生物學(xué)效應(yīng)尚未完全明確。此外，牙周微環(huán)境復(fù)雜，干細(xì)胞和免疫細(xì)胞在組織再生中均具有重要作用，但該研究僅關(guān)注PDLSCs，GGC-Zn2?-RSV對免疫細(xì)胞的影響尚待進(jìn)一步探索。未來的研究方向?qū)ㄡ槍ρ芯烤窒扌缘纳钊胩接懀貏e是細(xì)胞與生物材料相互作用機(jī)制的進(jìn)一步研究。