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慢性牙周炎是一種全球流行的口腔疾病，由多種致病因素協(xié)同作用引起。牙齦卟啉單胞菌等細菌是導(dǎo)致過度炎癥的主要因素之一，導(dǎo)致局部活性氧水平升高和M1巨噬細胞過度表達。因此，通過抗菌作用、清除活性氧和抑制M1巨噬細胞表達來調(diào)節(jié)牙周微環(huán)境可能是治療慢性牙周炎的有效方法。深共晶溶劑（DESs）由至少一個氫鍵受體（HBA）和一個氫鍵供體（HBD）組成，當(dāng)這些化合物按特定的摩爾比混合時，主要通過氫鍵形成共晶混合物。DES具有增強的生物降解性和生物相容性，以及加速藥物溶解性和滲透性的優(yōu)越能力，從而提高了許多藥物的生物利用度。DES的固有特性有可能解決傳統(tǒng)水凝膠在擴散性和滲透性方面的局限性，特別是對于低水溶性分子。因此，含有DES生物功能的共晶凝膠在炎癥性疾病中的應(yīng)用具有極大的研究潛力，但這一領(lǐng)域的研究尚未完全展開。

針對上述問題，四川大學(xué)李建樹和徐心源團隊利用氯化膽堿 ([Ch]Cl) 和甘露糖 (Mannose) 制備ChCl/M DES，然后引入溶菌酶纖維 (Fly) 和沒食子酸 (GA)，通過氫鍵和親水/疏水相互作用自組裝成可注射的共晶凝膠，將其應(yīng)用于慢性牙周炎的治療，并且從細胞膜滲透性的角度深入探究了小分子藥物生物利用度提高的根本原因。沒食子酸（GA）是一種具有良好抗氧化、清除自由基和抗炎特性的小分子；然而，它的親水性和強極性給其跨膜吸收帶來了巨大的障礙，而DES能夠顯著提升GA的細胞滲透性，從而克服這一障礙。甘露糖作為一種來源豐富且經(jīng)濟實用的糖類，近年來因其免疫調(diào)節(jié)功能被廣泛研究，可有效抑制炎癥并對自體免疫相關(guān)疾病產(chǎn)生積極作用，因此可被選作HBD。同時，選擇氯化膽堿ChCl作為HBA，其生物降解性、無毒性和成本效益會進一步提高DES的適用性。該文章于2024年11月19日以《Self-Assembled Eutectogel with Cell Permeation and Multiple Anti-Inflammatory Abilities for Treating Chronic Periodontitis》為題發(fā)表于《 Advanced Materials 》（DOI：10.1002/adma.202412866）。

研究示意圖 自組裝共晶水凝膠的示意圖及其在慢性牙周炎治療中的原理

(1) 共晶水凝膠的制備與表征

該研究團隊通過自組裝溶菌酶纖維（FLy）、沒食子酸（GA）和ChCl/M共溶劑（10 wt%水溶液）制備了自組裝共晶水凝膠（Eutectogel）（圖1a）。在低pH和高溫條件下，溶菌酶水解形成多肽，進一步組裝為纖維狀結(jié)構(gòu)。通過圓二色譜（CD）、原子力顯微鏡（AFM）和透射電子顯微鏡（TEM）確認了FLy的形成（圖1b,c）。CD光譜顯示，溶菌酶的α-螺旋比例從0.252降至0.172，β-折疊比例則由0.4增加至0.512，表明其發(fā)生了纖維化變化。FLy、GA和ChCl/M DES的混合物在40°C超聲處理后，冷卻至室溫形成不流動的共晶水凝膠（圖1d）。冷凍掃描電鏡圖像（圖1e）顯示，水凝膠呈均勻孔隙結(jié)構(gòu)，孔徑范圍為3至6μm。FT-IR光譜（圖1f）進一步證實了水凝膠中氫鍵的存在。CD光譜分析（圖1g）表明，DES10-FLy30-GA30水凝膠在217-218nm處呈現(xiàn)負峰，而在195-198nm處有強正峰，顯示出β-折疊構(gòu)象的增強。這表明共晶水凝膠的形成是通過FLy的自組裝和與ChCl/M DES的相互作用驅(qū)動的，其中氫鍵穩(wěn)定肽鏈的結(jié)構(gòu)。流變實驗（圖1i）表明，隨著FLy含量的增加，水凝膠的粘度和彈性模量（G'）增強，證實了FLy在水凝膠網(wǎng)絡(luò)中起到關(guān)鍵作用。注射力測試（圖1j）表明，所有樣品的注射力低于3N，適合臨床應(yīng)用。水凝膠與生物組織的附著力測試（圖1k）也顯示，F(xiàn)Ly含量的增加提升了其附著力，增強了藥效的發(fā)揮。

圖1. （a）共聚物形成的示意圖。（b）溶菌酶蛋白（Ly）和溶菌酶纖維（FLy）的圓二色性圖像。（c）Ly 和 FLy 的 AFM（Height）和 TEM 圖像。（d）共聚物的光學(xué)照片。（e）孔徑約為 3 ~ 6 μm 的共析層（DES10-FLy30-GA30）的 Cyro-SEM 圖像。（f）ChCl/M DES、FLy、GA 和共析共酯（DES10-FLy30-GA30）的 FTIR 光譜。（g）圓二色圖像和（h）FLy、DES10-FLy30、DES10-GA30、FLy30-GA30、DES10-FLy30-GA30 的 CD pro 定量數(shù)據(jù)。（i）G′ 和 |η| 共凝膠隨速度變化的流變測試。（j）共凝膠注射力試驗。（k）共凝膠與豬皮膚的粘附試驗

(2) 共晶水凝膠的抗菌性能

該研究團隊通過平板涂布法評估了自組裝共晶水凝膠對大腸桿菌（E. coli）、金黃色葡萄球菌（S. aureus）和牙齦卟啉單胞菌（P. gingivalis）的抗菌效果。結(jié)果顯示，含沒食子酸（GA）的水凝膠表現(xiàn)出接近100%的抗菌效果，而不含GA的DES10-FLy30水凝膠對大腸桿菌的殺菌活性不到50%，對金黃色葡萄球菌和牙齦卟啉單胞菌的活性約為80%（圖2a）。盡管溶菌酶纖維（FLy）具有一定抗菌作用，但效果不足以滿足臨床需求。掃描電鏡（SEM）圖像（圖2b）顯示，GA處理后的細菌細胞膜出現(xiàn)裂紋和溶解，細胞破裂明顯。相比之下，DES10-FLy30組細菌細胞膜僅呈現(xiàn)褶皺形態(tài)，未見穿孔。這表明GA能有效破壞細菌膜的完整性，導(dǎo)致細胞死亡，而FLy則通過增強的疏水β-折疊結(jié)構(gòu)促進膜破裂。在為期三天的抗菌試驗中，含GA水凝膠組表現(xiàn)出持續(xù)的抗菌效果，未見細菌生長，顯示出優(yōu)異的長期抗菌性能（圖2d）。DES10-FLy30組則在第一天出現(xiàn)菌落，但隨后的兩天未再生長，表明FLy在短期內(nèi)也能有效抑制細菌繁殖。綜上所述，GA的釋放是共晶水凝膠長期抗菌效果的關(guān)鍵，而FLy則在短期內(nèi)通過膜破壞機制抑制細菌生長。

圖2. （a）共凝膠與 10? CFU mL?1 的菌液以 1:1 的體積比共培養(yǎng) 24 h 后的殺菌活性。（b）細菌與不同樣品共培養(yǎng)后的 SEM 圖像。（c）共凝膠與 10? CFU mL?1 牙齦假單胞菌（P. gingivalis）以 1:1 體積比共培養(yǎng) 72 h 的實驗示意圖。（d）瓊脂板在 24、48 和 72 h 的實驗照片

(3) 共晶凝膠的活性氧清除和免疫調(diào)節(jié)作用

該團隊通過DCFH-DA和DHE探針標記細胞內(nèi)的·OH和O??，評估水凝膠的ROS清除能力。結(jié)果顯示，H?O?刺激后，·OH和O??的熒光強度顯著增加，表明ROS產(chǎn)生，而對照組幾乎沒有熒光信號。含沒食子酸（GA）的水凝膠顯著降低了ROS的熒光強度，DES10-FLy30-GA30組效果最為顯著，表明GA通過氫原子轉(zhuǎn)移（HAT）機制有效清除ROS。此外，使用ChCl/MDES作為溶劑的DES10-FLy30-GA30組比水溶液中的FLy30-GA30更強地清除ROS，可能與ChCl/M DES增強了細胞膜通透性和GA生物利用度有關(guān)。在免疫調(diào)節(jié)實驗中，LPS刺激后，巨噬細胞主要呈M1型（CD86標記），而M2型（CD206標記）幾乎沒有熒光。治療后，含GA水凝膠顯著降低了CD86的熒光強度，并提高了CD206的熒光強度。流式細胞術(shù)分析顯示，GA處理組CD86陽性細胞比例下降約65%，CD206陽性細胞比例上升，表明GA促進了M1向M2的轉(zhuǎn)化，有助于減輕慢性牙周炎的炎癥反應(yīng)。實時PCR檢測結(jié)果顯示，GA組中促炎因子（iNOS、TNF-α）表達顯著降低，抗炎因子（IL-10、Arg-1）表達顯著上升。與DES10-GA30組相比，DES10-FLy30-GA30組表現(xiàn)出更強的免疫調(diào)節(jié)效果，這可能與ChCl/M DES增強了GA在細胞內(nèi)的滲透性和作用。綜上所述，DES10-FLy30-GA30共晶水凝膠通過增強GA的細胞滲透性，顯著促進巨噬細胞的M1向M2轉(zhuǎn)化，抑制促炎因子的表達，增強抗炎因子的產(chǎn)生，為慢性牙周炎的治療提供了新的潛力。

圖3. （a）不同樣品共培養(yǎng)的 H?O? 刺激的 Raw 264.7 巨噬細胞的亮場和熒光圖像；DCFH-DA 染色的綠色熒光表示細胞中的 ·OH，DHE 染色的紅色熒光表示細胞中的 O??。（b）使用 ImageJ 計算不同樣品的清除細胞內(nèi) ROS 的定量數(shù)據(jù)。（c）LPS 刺激的 Raw 264.7 巨噬細胞與不同樣品共培養(yǎng)的熒光圖像；DAPI 染色藍色熒光指示細胞核，紅色熒光指示細胞內(nèi) CD86/CD206。（d）使用 ImageJ 計算不同樣品 CD86 和 CD206 的定量數(shù)據(jù)。（e）各組巨噬細胞處理后表達 CD86 和 CD206 的流式細胞術(shù)結(jié)果；利用 CD86（紅色，PE 通道）和 CD206（綠色，APC 通道）抗體分別特異性標記 M1 樣巨噬細胞和 M2 樣巨噬細胞。（f）不同處理組 Raw 264.7 細胞炎癥相關(guān)因子和抗炎癥相關(guān)因子的 qPCR 結(jié)果

(4) GA的細胞內(nèi)攝取與免疫調(diào)節(jié)

圖4a顯示，H?O-GA30組在培養(yǎng)1小時后，巨噬細胞內(nèi)的Cy5熒光強度明顯低于其他組。流式細胞術(shù)分析（圖4b）表明，H?O-GA30組中僅2.17%的細胞為Cy5-GA陽性，而DES10-GA30組增至36.9%。在FLy的作用下，Cy5-GA陽性細胞比例進一步提高至44.9%。隨著培養(yǎng)時間延長（圖4c），在6小時后，H?O-GA30組細胞內(nèi)GA的比例為10.5%，而DES10-GA30和DES10-FLy30-GA30組分別上升至72.9%和80.6%，顯示出ChCl/M DES和FLy的協(xié)同作用，顯著促進了GA的內(nèi)化。這一效果的提升可能與ChCl/M DES對細胞膜的滲透性增強有關(guān)。ChCl/M DES通過釋放陽離子、陰離子和甘露糖，與細胞膜結(jié)合，部分改變膜的結(jié)構(gòu)，促進GA的細胞內(nèi)吸收。與H?O-GA30組相比，使用ChCl/M DES的DES10-GA30和DES10-FLy30-GA30組表現(xiàn)出更高的GA內(nèi)化效率。FLy通過在細胞膜表面聚集并與膜蛋白結(jié)合，進一步促進GA的持續(xù)釋放和局部濃度增加，這通過滲透壓效應(yīng)進一步促進了GA的內(nèi)化。綜上所述，ChCl/M DES和FLy的聯(lián)合應(yīng)用顯著提高了GA的內(nèi)化效率，不僅增強了GA的抗炎作用，也為慢性炎癥相關(guān)疾病提供了新的治療策略。

圖4. （a）Raw 264.7 巨噬細胞與不同樣品共培養(yǎng)的熒光圖像，DAPI 染色藍色熒光表示細胞核，紅色熒光表示細胞內(nèi) cy5-GA。（b）1 h 和（c）6 h 后含 cy5-GA 的巨噬細胞流式細胞術(shù)結(jié)果。（d）含有 FLy 和 ChCl/M DES 的共凝膠有效內(nèi)化 GA 免疫調(diào)節(jié)的示意圖

(5) 抑制牙槽骨吸收：DES10-FLy30-GA30共晶水凝膠的療效

該研究團隊采用微CT技術(shù)評估了治療慢性牙周炎的效果。對照組（未治療的結(jié)扎組）表現(xiàn)出明顯的牙槽骨吸收，特別是在第一和第二磨牙的唇側(cè)和腭側(cè)。兩周后的治療結(jié)果顯示，DES10-FLy30-GA30共晶水凝膠組表現(xiàn)出最佳療效，顯著改善了骨吸收，CEJ-ABC距離減少了75.5%，骨礦密度（BMD）和骨體積（BV/TV）分別提高了166.44%和743.20%。與市售牙周炎藥物Periocline相比，DES10-FLy30-GA30的效果更為突出。此外，DES10-FLy30組的治療效果較差，表明GA是治療牙周炎的關(guān)鍵成分。通過TRAP染色分析，DES10-FLy30-GA30組幾乎未見破骨細胞，進一步驗證了其抑制骨吸收的作用?？偟膩碚f，DES10-FLy30-GA30共晶水凝膠為慢性牙周炎提供了一個有效的治療新策略。

圖5. （a）SD 大鼠牙周組織治療綜合時間表示意圖。（b）從顯微 CT 結(jié)果評估牙槽骨丟失。治療 2 周后上頜牙槽骨頰側(cè)和腭側(cè)具有代表性的二維矢狀面 X 線圖像和三維構(gòu)造圖像。（c）CEJ-ABC 平均線距、骨密度（BMD）、骨量/總積（BV/TV）的統(tǒng)計分析。（d）采用抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色對上頜第一、第二磨牙周圍牙間區(qū)進行組織學(xué)檢查。黑色箭頭表示 TRAP 陽性（染紅）細胞

(6) 體內(nèi)抗炎作用

如圖6所示，H&E染色結(jié)果顯示，未治療的對照組出現(xiàn)嚴重的骨吸收和牙槽骨破壞，而DES10-FLy30-GA30共晶水凝膠組顯著縮短了CEJ-ABC距離，接近健康組，顯示出其治療牙周炎的潛力。健康組的牙齦組織結(jié)構(gòu)規(guī)則，膠原纖維有序，而對照組則表現(xiàn)出明顯的炎性細胞浸潤和上皮層增厚，提示嚴重牙周炎。相比之下，DES10-FLy30-GA30組炎性細胞浸潤減少，組織損傷較輕，牙槽突起侵蝕得到改善。Masson染色結(jié)果顯示，治療組膠原纖維排列整齊，提示促進牙周修復(fù)。雖然DES10-GA30和FLy30-GA30組也有所改善，但DES10-FLy30組效果最佳，表明GA與FLy的協(xié)同作用更強。免疫染色分析表明，對照組巨噬細胞主要呈促炎性M1表型，而DES10-FLy30-GA30組則促進巨噬細胞向抗炎性M2表型轉(zhuǎn)化，顯示出卓越的免疫調(diào)節(jié)作用。qPCR分析結(jié)果進一步證實，DES10-FLy30-GA30組顯著降低了M1促炎因子，增加了M2抗炎因子，顯示出更強的抗炎效果。綜上，DES10-FLy30-GA30共晶水凝膠在抗炎、修復(fù)和免疫調(diào)節(jié)方面具有顯著效果，展現(xiàn)出廣泛的臨床應(yīng)用潛力。

圖6. （a）H&E 染色和（b）MASSON 染色對上第一和第二磨牙周圍的牙間區(qū)進行組織學(xué)檢查。（a）中的黑色箭頭表示 CEJ-ABC 的橫截面距離。（c）大鼠第一磨牙和第二磨牙之間牙齦組織的免疫熒光圖像，DAPI 染色的藍色熒光表示細胞核，紅色熒光表示細胞內(nèi) CD86/CD206。（d）共聚凝膠處理牙周組織炎癥相關(guān)細胞因子和抗炎癥相關(guān)細胞因子的 qPCR 結(jié)果

(7) 慢性牙周炎的口腔微生物群

圖7展示了不同組別（健康組、對照組、Periocline組、DES10-FLy30-GA30組）口腔微生物群的差異。通過16S rRNA基因測序和多種分析方法，我們揭示了不同組別間的顯著差異。熱圖結(jié)果顯示，對照組含有大量致病菌，如變形菌門（Proteobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）和擬桿菌門（Bacteroidota），這些致病菌導(dǎo)致了口腔微生態(tài)的嚴重失衡。而DES10-FLy30-GA30組的微生物群落結(jié)構(gòu)與健康組更為相似，顯示其對抗致病菌的能力。DES10-FLy30-GA30組的物種豐富度接近健康組，表明它在恢復(fù)口腔微生態(tài)方面具有顯著作用。Venn圖顯示，DES10-FLy30-GA30組與健康組共享998個ASVs，而Periocline組僅共享329個ASVs，說明DES10-FLy30-GA30在恢復(fù)健康口腔微生態(tài)方面更具優(yōu)勢。主成分分析和多維尺度分析也表明，DES10-FLy30-GA30組與健康組的微生物群相似性更高。進一步分析發(fā)現(xiàn)，DES10-FLy30-GA30組顯著降低了致病菌的含量，恢復(fù)了口腔健康?？偟膩碚f，DES10-FLy30-GA30共晶水凝膠不僅改善了口腔微生物群的平衡，還通過去除致病菌群，為牙周炎治療提供了新的有效方案。

圖7. （a）健康組、對照組（+）組、Periocline 組和 DES10-FLy30-GA30 組口腔微生物群熱圖。（b）健康組、對照組（+）組、Periocline 組和 DES10-FLy30-GA30 組口腔微生物群相對豐度條形圖。（c）健康組、對照組（+）組、Periocline 組和 DES10-FLy30-GA30 組口腔微生物群的維恩圖。（d、e）健康組、對照組（+）、Periocline 組和 DES10-FLy30-GA30 組口腔微生物群的 PCoA 和 NMDS 分析。（f）健康組、對照組（+）、Periocline 組和 DES10-FLy30-GA30 組口腔微生物群的 Shannon、Simpson、Pielou's 和 Chao_1 豐富度指數(shù)。（g）LEfSe 分析鑒定健康組、對照組（+）、Periocline 組和 DES10-FLy30-GA30 組的優(yōu)勢菌

研究小結(jié)：

該團隊利用ChCl/MDES的高生物相容性及其促進溶解和滲透的特性，成功通過一鍋法制備了注射型DES10-FLy30-GA30共晶水凝膠。這種共晶水凝膠的卓越性能得益于其核心成分--ChCl/M DES和大分子肽FLy，它們有效增強了小分子藥物GA的溶解度和細胞滲透性，從而顯著提高了GA的生物利用度。GA的獨特性質(zhì)使其能夠穿透細菌的周質(zhì)膜，清除ROS并誘導(dǎo)巨噬細胞從M1型向M2型極化，展現(xiàn)了出色的廣譜抗菌性能。動物實驗結(jié)果顯示，DES10-FLy30-GA30共晶凝膠在慢性牙周炎模型中顯著抑制了牙槽骨吸收，CEJ-ABC值從1298 ± 21.42 μm降低至980 ± 4.22 μm。同時，共晶凝膠還有效減弱了破骨細胞活性并減輕了炎癥反應(yīng)。此外，通過16S RNA檢測，該共晶凝膠在根除致病菌的同時，還成功恢復(fù)了口腔微生物群的平衡，維護了口腔微環(huán)境的穩(wěn)態(tài)。這一創(chuàng)新性的共晶水凝膠不僅提升了藥物的生物利用率，還為抗菌和抗炎治療提供了一種簡便且高效的平臺，具有廣泛的應(yīng)用前景，尤其在炎癥性疾病的管理中展示了巨大潛力。