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口腔致病性細菌感染（如齲齒）引發(fā)的生物膜問題是當(dāng)前公共衛(wèi)生領(lǐng)域的重大挑戰(zhàn)。變異鏈球菌（S. mutans）通過形成酸性、缺氧的生物膜微環(huán)境，不僅導(dǎo)致牙齒礦化組織的破壞，還對抗生素治療產(chǎn)生顯著耐藥性。目前臨床常用的高劑量抗生素和手術(shù)切除方法因滲透性不足及對健康組織的損傷而存在局限性?？梢姽饨閷?dǎo)的光療（包括光熱療法和光動力療法）因其微創(chuàng)、可控等優(yōu)勢受到關(guān)注，但傳統(tǒng)光療方法在溫控精確性、缺氧環(huán)境適應(yīng)性和藥物選擇性方面仍存在不足。因此，開發(fā)一種結(jié)合光熱療法和光動力療法的雙模光療藥物遞送系統(tǒng)，具有自調(diào)節(jié)機制并適應(yīng)生物膜微環(huán)境，將為徹底清除細菌生物膜提供新的治療思路，同時最大限度減少對健康組織的損傷。

針對口腔細菌生物膜感染治療面臨的抗生素耐藥性、治療損傷及光療局限性等問題，南開大學(xué)張新歌和郭東升團隊設(shè)計了一種適應(yīng)性超分子納米制劑，由含氟烴鏈的胍基修飾杯狀芳烴（GC5AF₅）與四磺酸鋅酞菁（ZnPcS₄）構(gòu)成。該納米制劑（ZnPcS₄@GC5AF₅, GFZ）能夠在腺苷三磷酸（ATP）刺激下實現(xiàn)從光熱療法（PTT）到光動力療法（PDT）的可控切換。研究表明，ZnPcS₄的預(yù)裝載導(dǎo)致光動力效應(yīng)被抑制（關(guān)閉狀態(tài)），光熱活性增強（高狀態(tài)）；在光熱療法引發(fā)細菌膜破裂和ATP釋放后，ATP的競爭包合觸發(fā)ZnPcS₄釋放，恢復(fù)光動力活性（開啟狀態(tài)）并降低光熱活性（低狀態(tài)）。此外，GC5AF₅的含氟烴鏈具備攜氧能力，進一步提升了光動力療法中單線態(tài)氧（¹O₂）的生成效率，加速生物膜的清除。通過集成GC5AF₅的識別、組裝及攜氧特性，該制劑實現(xiàn)了PTT與PDT的動態(tài)切換，提高了治療的精準(zhǔn)性和效果，為難治性細菌生物膜感染提供了一種高效、低副作用的治療方案。相關(guān)研究在2024年9月24日以“A Supramolecular Nanoformulation with Adaptive Photothermal /Photodynamic Transformation for Preventing Dental Caries”為題發(fā)表于《ACS Nano》 （DOI：10.1021/acsnano.4c06051）上。

圖1.采用PTT和程序激活PDT來恢復(fù)口腔菌群并預(yù)防齲齒

（1）超分子納米載體及GFZ的設(shè)計與制備

研究人員設(shè)計了一種基于杯芳烴的適應(yīng)性納米制劑（GFZ），通過引入胍基修飾和氟碳鏈，構(gòu)建了具有強結(jié)合能力和氧氣攜帶功能的分子GC5AF5，并實現(xiàn)了與光敏劑ZnPcS₄和ATP的高效結(jié)合。GFZ通過自組裝形成穩(wěn)定的納米結(jié)構(gòu)，動態(tài)光散射（DLS）結(jié)果顯示粒徑分布一致（約174 nm），如圖 2b 所示。加載光敏劑ZnPcS4后，雖然粒徑變化不顯著，但表面電位和紫外-可見吸收光譜的變化驗證了ZnPcS4的成功加載（圖 2c 和 2d）。此外，GFZ在不同pH條件下表現(xiàn)出良好的穩(wěn)定性（圖 2e），透射電子顯微鏡（TEM）觀察到其粒徑約為130 nm的球形形貌（圖 2f）。含氟碳鏈顯著提升了GFZ的氧氣攜帶能力，氧氣溶解度測試表明GFZ溶液的氧氣含量比PBS高出25%（圖 2g），這有助于緩解生物膜的缺氧微環(huán)境。在ATP濃度梯度實驗中，GFZ展現(xiàn)出良好的響應(yīng)性，在高濃度ATP（>100 μM）條件下，ZnPcS4釋放后熒光顯著恢復(fù)（圖 2j），而在低濃度ATP（10 nM）條件下無明顯變化，表明該系統(tǒng)能夠在感染部位高選擇性激活光動力活性，從而實現(xiàn)治療模式的按需切換并增強治療效果。

圖2.GC5AF₅和 GFZ的合成與表征。 (a) GC5AF₅合成。(b) GC5AF₅和 GFZ的動態(tài)光散射。 (c) GC5AF₅和 GFZ的 Zeta 電位圖。 (d) HEPES 緩沖液（10 μM，pH 7.4）中 GC5AF₅、ZnPcS₄和 GFZ的紫外可見吸收光譜。(e) 不同 pH 水平下 GFZ 的水動力學(xué)尺寸隨時間的變化。(f) GFZ 的 TEM 圖像。 (g) PBS、GYZ 和 GFZ 的氧解離。(h) HEPES 緩沖液（10 mM，pH 7.4）中 fluorescein@GC5AF₅ (0.5/0.7 μM) 與 ZnPcS₄的競爭熒光滴定符合 1:1 競爭結(jié)合模型（λex = 512 nm）。 （i）基于 1:1 競爭結(jié)合模型（λex = 512 nm），分析了使用熒光素@GC5AF₅ （0.5/0.7 μM）對 HEPES 緩沖液（10 mM，pH 7.4）中的 ATP 進行競爭性熒光滴定。（j）在添加 10 nM 和 100 μM 濃度的 ATP 后，在沒有和存在 GC5AF₅（2.0 μM）的情況下記錄了 ZnPcS₄ （2.0 μM）的熒光光譜

(2) GFZ的光熱和光動力功效

本研究評估了GFZ的光熱和光動力性能。光熱性能測試表明，不同濃度的GFZ溶液在660 nm激光照射下顯著升溫，100 μM GFZ溶液3分鐘內(nèi)升至約60 °C并保持穩(wěn)定，足以引發(fā)蛋白質(zhì)變性和細菌死亡（圖 3a 和圖3b），在五次光照開關(guān)循環(huán)中表現(xiàn)出優(yōu)異的穩(wěn)定性（圖 3c）。GFZ的光熱轉(zhuǎn)換效率達到24.4%，是游離ZnPcS₄的3倍（圖 3d），歸因于杯芳烴的絡(luò)合誘導(dǎo)猝滅效應(yīng)。光動力性能測試顯示，在ATP加入前，GFZ的光動力活性幾乎完全被猝滅，而ATP置換后熒光強度顯著恢復(fù)，表明光動力活性成功恢復(fù)（圖 3e）。此外，GFZ較對照組GYZ產(chǎn)生了更多的活性氧（ROS）（圖 3f），這得益于氟碳鏈的攜氧能力，顯著提升了光動力療效。GFZ的工作原理如圖 3g 所示，在ATP競爭結(jié)合前，ZnPcS₄的激發(fā)單線態(tài)通過光誘導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移回到基態(tài)，表現(xiàn)為熒光猝滅和增強的光熱效應(yīng)；在ATP加入后，ZnPcS₄被釋放，模式切換至光動力療法（PDT），ZnPcS₄通過系統(tǒng)內(nèi)交叉（ISC）激發(fā)分子氧生成單線態(tài)氧（^1O₂），伴隨熒光恢復(fù)和少量熱效應(yīng)。此外，氟碳鏈的攜氧功能進一步增強了ROS的生成。綜上，GFZ兼容PTT和PDT兩種模式，可按需切換并提升療效，為難治性生物膜感染的智能光療提供了有力工具。

圖3. GFZ 的受控光熱和光動力活性。（a）偽彩色圖像和（b）不同 GFZ 濃度下隨照射時間的溫度變化。（c）六次激光照射期間 GFZ 的溫度曲線。（d）660 nm 下 GFZ 的光熱轉(zhuǎn)換效率。使用 2′,7'-二氯熒光素二乙酸酯法，PBS、GFZ (+，添加 ATP)、GYZ (+，添加 ATP) 和 GFZ (?，無 ATP) 的 ROS 生成隨時間的變化：2′,7′-二氯二氫熒光素的熒光成像 (e) 和熒光強度 (f)。（g）GFZ 可增強光熱效應(yīng)和光動力效應(yīng)的原理示意圖

(3) GC5AY 和 GC5AF₅對變形鏈球菌的體外抗粘附活性

本研究評估了GC5AY和GC5AF₅的細菌捕獲能力、抗黏附性能及穿透細菌細胞壁的能力。通過共培養(yǎng)實驗和共聚焦激光掃描顯微鏡（CLSM）成像發(fā)現(xiàn)，PBS組中的細菌呈分散狀態(tài)，而GC5AY和GC5AF₅處理組形成了明顯的細菌聚集體，表明兩種納米載體對變異鏈球菌（S. mutans）具有良好的誘導(dǎo)聚集能力。在80分鐘內(nèi)，GC5AY和GC5AF₅的聚集率分別達到約98.1%和97.6%，且聚集效率隨樣品濃度增加而提高（圖 4a 和圖 4b）。在人類牙齦成纖維細胞（HGF）模型中，GC5AF₅顯著減少了變異鏈球菌對宿主細胞的黏附，細菌黏附率降至8.8 ± 3.3%（圖 4c），CLSM圖像進一步證實了GC5AF₅的抗黏附特性（圖 4d）。此外，F(xiàn)ITC標(biāo)記實驗表明，GC5AF5能夠穿透細菌細胞壁并進入細胞內(nèi)部，細菌簇表現(xiàn)出強綠色熒光（圖 4e 和圖 4f）。三維共定位成像顯示，F(xiàn)ITC的熒光與細菌的藍色熒光重疊，進一步證實了GC5AF₅在細菌內(nèi)部的分布。穿透能力可能與GC5AF₅中陽離子胍基團與細菌膜上負電荷磷酸基團之間形成的多個鹽橋有關(guān)。綜上，GC5AY和GC5AF₅不僅具有優(yōu)異的細菌捕獲和抗黏附能力，還能穿透細菌細胞壁，為增強PDT療效提供了良好基礎(chǔ)。

圖4. GC5AF₅在細菌聚集、抗粘附和內(nèi)化方面的功效。GC5AY 和 GC5AF₅在不同 (a) 時間間隔和 (b) 濃度下對抗變形鏈球菌的聚集率，以 OD₆₀₀的百分比變化表示。 (c) 用 GC5AF₅處理后變形鏈球菌對 HGF的殘留粘附。 (d) 用無菌 PBS 洗去未粘附的細菌后，用 DAPI 染色的 HGF 的 CLSM，感染了用 FITC 標(biāo)記的變形鏈球菌，有或沒有 GFZ。 (e、f) CLSM 圖像顯示細菌對 FITC 標(biāo)記的 GC5AF₅的內(nèi)化

(4) GFZ的體外抗菌活性

本研究通過標(biāo)準(zhǔn)菌落計數(shù)法和活/死染色實驗評估了GFZ對變異鏈球菌（S. mutans）的光療抗菌活性。在無660 nm激光照射下，GC5AY、GC5AF₅、GFZ@ATP和GFZ（?）組的殺菌活性較弱，但在ATP處理后，GFZ組的殺菌效率顯著提高，表明ATP觸發(fā)ZnPcS₄釋放后激活了GC5AF₅的抗菌活性（圖 5a 和圖 5b）。在660 nm激光照射下，GYZ和GFZ組的殺菌率分別達到86.7%和99.9%，GFZ表現(xiàn)出更高的抗菌效率，這歸因于GC5AF₅的攜氧能力增強了PDT過程中單線態(tài)氧（^1O₂）的生成。活/死染色實驗進一步驗證了GFZ的抗菌活性（圖 5c）。PBS組中細菌呈分散狀態(tài)，且大部分為綠色，表明細菌存活；而GFZ處理組中的細菌則形成聚集，隨著處理組從GC5AY、GC5AF₅到660 nm照射下的ZnPcS₄、GYZ和GFZ，黃色熒光信號（綠色和紅色疊加）逐漸增強，表明細胞損傷和死亡。這表明富含胍基的GC5AF₅通過多個鹽橋與細菌膜上的陰離子組分（如脂多糖和磷脂）快速結(jié)合，從而增強了光療的抗菌效果。掃描電子顯微鏡（SEM）觀察顯示，PBS組中的變異鏈球菌呈原始桿狀，表面光滑且結(jié)構(gòu)完整；而在660 nm激光照射下，GYZ和GFZ處理組的細菌表面出現(xiàn)明顯損傷和不規(guī)則孔洞，其中GFZ組幾乎完全殺滅了細菌（圖 5d）。這些結(jié)果表明，GC5AF₅通過提高ZnPcS₄周圍的氧濃度并延長ROS壽命，在體外顯著增強了光動力抗菌活性。

圖5. 660 nm 照射下 GFZ 對變形鏈球菌的體外抗菌效果。（a）用 PBS、GC5AY、GC5AF₅ 、GFZ@ATP、GFZ（-，無光）、ZnPcS₄ 、GYZ 和 GFZ 組處理后的變形鏈球菌菌落的照片表示。（b）通過平板計數(shù)法定量分析暴露于不同處理后的變形鏈球菌存活率。（c）不同處理后記錄的具有 AO/EB 雙熒光染色的變形鏈球菌的 CLSM 圖像。（d）處理前后變形鏈球菌形態(tài)的 SEM 圖像

（5）增強生物膜滲透和體外抗生物膜評估

本研究評估了GFZ在抗細菌生物膜中的滲透能力和光療效果。GFZ在660 nm光照下激活光熱特性（圖 6a），引發(fā)細菌膜破裂和ATP釋放，觸發(fā)ZnPcS₄釋放，實現(xiàn)PTT和PDT的切換。標(biāo)記實驗顯示，GFZ能在60分鐘內(nèi)完全穿透厚約16 μm的成熟生物膜（圖 6b），并通過緩解缺氧微環(huán)境顯著提高ROS生成和PDT療效（圖 6c）。熒光成像與結(jié)晶紫染色顯示，GFZ可有效減少生物膜質(zhì)量，清除率超過90%，明顯優(yōu)于GYZ組（圖 6d–6f）。在人類離體牙模型中，GFZ組在660 nm光照下5分鐘的清除率達94%（圖 6g 和圖 6h），得益于ATP激活的ZnPcS₄釋放、攜氧能力及治療模式切換，展現(xiàn)出高效的抗生物膜潛力。

圖6. GFZ 穿透和清除生物膜。（a）ATP 響應(yīng)型 GFZ 示意圖。（b）CLSM 圖像展示了 20、40 和 60 分鐘處理后羅丹明 B@GC5AF₅在變形鏈球菌生物膜內(nèi)的深度依賴性滲透。（c）2′,7′-二氯二氫熒光素的熒光強度。（d）各種處理后殘留生物膜的活/死熒光染色圖像。（e）不同處理濃度下剩余變形鏈球菌生物膜的定量分析。（f）評估不同持續(xù)時間的 660 nm 激光照射下生物膜減少的情況。（g）去除孤立牙齒上變形鏈球菌生物膜的效果。（h）OD₅₉₀值用于評估不同樣品處理的生物膜根除效果

（6）體內(nèi)抑制齲齒

本研究在體內(nèi)評估了GFZ對防治齲齒的效果。建立的嚙齒動物模型模擬了嚴(yán)重人類齲齒的特征，變異鏈球菌（S. mutans）感染的大鼠幼崽被喂食高糖飲食，并接受GFZ及660 nm光照（1.0 W/cm2）處理（圖 7a）。紅外熱成像顯示，處理組口腔在5分鐘內(nèi)加熱至46°C，表明GFZ在體內(nèi)仍具有良好的光熱性能（圖 7b）。在21天治療期間，大鼠健康狀況良好，體重未見明顯差異（圖 7c）?？咕鷮嶒灲Y(jié)果顯示，GFZ可消滅99%的變異鏈球菌，顯著優(yōu)于GC5AY/GC5AF₅（33%）和GYZ（62%）（圖 7d 和圖 7e）。結(jié)晶紫染色結(jié)果顯示，GFZ處理后牙齒表面的齲致細菌生物膜幾乎完全被清除，成功阻止了齲齒的發(fā)展（圖 7f 和圖 7g）。

圖7. 局部 GFZ 對體內(nèi)S. mutans生物膜相關(guān)口腔疾病的治療效果。(a) 治療S. mutans生物膜感染大鼠幼崽的實驗程序示意圖。 (b) 使用各種治療方法對S. mutans生物膜感染大鼠幼崽的光熱圖像。(c) 實驗期間大鼠幼崽的體重。 (d) 不同治療組在第 24、28、38 和 49 天的 BHI 瓊脂平板上的細菌菌落照片。(e)治療后S. mutans生物膜感染糖尿病大鼠的剩余細菌變化。(f) 感染變形鏈球菌生物膜后的大鼠幼崽牙齒的代表性照片和相應(yīng)的結(jié)晶紫染色圖像。 (g) 通過結(jié)晶紫染色對剩余的生物膜進行量化

通過Keyes評分和微型CT分析進一步量化GFZ對齲齒的防治效果。結(jié)果表明，與其他組相比，GFZ組在釉質(zhì)及牙本質(zhì)損傷（E、Ds、Dm、Dx）評分上顯著降低，牙齒光滑面和溝裂處的齲病也顯著減少（圖 8a–8c）。微型CT圖像顯示，GFZ組牙釉質(zhì)脫礦程度最低，牙齒光滑面和溝裂處均保持完整；而其他組牙釉質(zhì)脫礦嚴(yán)重，部分達到牙髓腔（圖 8d）。綜上，GFZ通過消除致齲生物膜、抑制牙釉質(zhì)脫礦及阻止齲病發(fā)展，展現(xiàn)出卓越的體內(nèi)防齲潛力，為齲齒治療提供了一種高效策略。

圖8. 使用 Keyes 評分和微型 CT 分析評估防齲治療效果。（a）齲病病變的代表性圖像。（b）從光滑表面記錄的齲齒評分。（c）從齦溝表面記錄的齲齒評分。齲齒評分是根據(jù) Larson 修改的 Keyes 評分系統(tǒng)記錄的。（d）活體上頜磨牙的微型 CT 圖像

（7）對體內(nèi)口腔微生物群的影響

本研究評估了GFZ對口腔微生物多樣性和組織毒性的影響。微生物組測序顯示，各治療組的口腔微生物組成無顯著差異，Shannon指數(shù)（多樣性）和Chao指數(shù)（豐富度）分析表明GFZ組與對照組在微生物多樣性方面無明顯差異（圖 9a–9c）。ASV水平的聚類分析顯示，GFZ組和PBS組的微生物群結(jié)構(gòu)相似（圖 9d）。值得注意的是，GFZ組中與致齲相關(guān)的鏈球菌屬（Streptococcus）豐度顯著降低，表明GFZ可能通過減少酸性環(huán)境來抑制齲齒的發(fā)展（圖 9e）。Bray-Curtis距離主成分分析（PCA）進一步證實了各組微生物群結(jié)構(gòu)無顯著變化（圖 9f）。蘇木精-伊紅（H&E）染色結(jié)果表明，GFZ對牙齦和腭組織無明顯毒性，未出現(xiàn)增生、炎癥或壞死跡象（圖 9g）。綜上，GFZ能夠有效抑制口腔疾病進展，同時保持口腔微生物生態(tài)平衡和組織完整性，為安全、高效的口腔疾病治療提供了潛在的解決方案。

圖9. 局部應(yīng)用對 21 天治療后口腔微生物群和軟組織的影響進行評估。（a）按治療組分類的所有樣本中鑒定出的關(guān)鍵細菌屬的熱圖表示。（b）Shannon 多樣性指數(shù)和（c）OTU 級別的 Chao 豐富度指數(shù)，比較微生物多樣性。（d）各組間豐富度和多樣性沒有顯著差異。（e）不同樣本組中物種級別分類群的相對豐度。（f）加權(quán) UniFrac PCA，表示每組的 β 多樣性；分析顯示，GFZ 組在樣本之間具有相似的組成。（g）接受不同治療組治療的動物牙齦和腭組織的組織病理學(xué)

小結(jié)：

該研究團隊開發(fā)了一種強大的超分子納米制劑，可以自適應(yīng)地增強不同光療模式的治療效果，并根據(jù)ATP反應(yīng)智能地切換治療模式。得益于杯芳烴支架的絡(luò)合誘導(dǎo)猝滅和氟碳鏈的攜氧能力，GC5AF₅作為大環(huán)載體，可以適應(yīng)PTT和PDT。此外，我們通過高效識別細菌破裂后釋放的ATP，實現(xiàn)了從PTT到PDT的按需轉(zhuǎn)換。在避免局部高溫的同時產(chǎn)生大量的ROS，不僅實現(xiàn)了對病原菌生物膜的精準(zhǔn)消滅，而且還最大限度地減少了對正常組織的損傷。此外，由于帶正電的胍基和疏水性氟碳鏈的修飾，GC5AF₅還可以破壞細胞膜的完整性，表現(xiàn)出一定的抗菌能力。因此，GC5AF₅既是一種強大的載體，又具有治療活性，充分體現(xiàn)了其多功能整合特性。大環(huán)化合物易于修飾、良好的識別和組裝性能使其成為多功能整合的優(yōu)質(zhì)平臺，在抗菌膜等復(fù)雜疾病的聯(lián)合治療中具有巨大的潛力。